卡格列凈與阿米洛利或苯扎米爾聯(lián)用對(duì)腎病綜合征大鼠骨代謝的影響

環(huán) 薇, 李 瀟, 洪文娟, 羅曉菲, 王學(xué)芳, 李 倩, 成家茂

(1. 大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 云南 大理, 671003; 2. 大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腎臟內(nèi)科, 云南 大理, 671013;3. 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 解剖教研室, 云南 大理, 671003)

腎病綜合征(NS)是以大量蛋白尿(>3.5 g/24 h)、低蛋白血癥(< 30 g/L)、水腫和高脂血癥為特征的一組臨床綜合征,是終末期腎病的原因之一。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑(SGLT2i)是一類新型降糖藥, 具有降低尿蛋白、改善腎功能的作用[1], 卡格列凈可增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[2]。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn),卡格列凈治療可使骨盆骨密度下降,高劑量卡格列凈能增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)。上皮鈉通道是一種在腎遠(yuǎn)端小管處對(duì)鈉轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用的離子通道,維持著體內(nèi)的鈉水穩(wěn)態(tài)[4]。阿米洛利和苯扎米爾是上皮鈉通道阻斷劑(ENaCi), 其中,阿米洛利可抑制破骨細(xì)胞分化[5], 苯扎米爾對(duì)骨代謝影響的報(bào)道較少, ENaCi聯(lián)用SGLT2i對(duì)骨代謝的影響尚未闡明。本研究觀察卡格列凈分別聯(lián)用阿米洛利或苯扎米爾對(duì)阿霉素腎病大鼠骨代謝的影響,以期為臨床防治NS患者藥物性骨質(zhì)疏松提供用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要藥物

阿霉素注射液(深圳萬樂藥業(yè)有限公司,批號(hào)H44024359); 卡格列凈片(西安楊森制藥有限公司,批號(hào)H20170375); 阿米洛利(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司,目錄號(hào)HY-B0285A/CS-2298); 苯扎米爾(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司,目錄號(hào)HY-B1546A/CS-7692)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

SPF級(jí)雄性SD大鼠49只, 6周齡,體質(zhì)量180～200 g, 購(gòu)自昆明雙欣生物科技有限公司,許可證號(hào)SCXK(豫)2020-0005。所有大鼠均飼養(yǎng)在大理大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,自由飲食飲水。隨機(jī)選取42只大鼠,經(jīng)尾靜脈第1次注射阿霉素4 mg/kg, 間隔1周后第2次注射阿霉素2.5 mg/kg, 建立NS模型; 剩余7只作為正常對(duì)照組(NG組),給予注射等量0.9%氯化鈉溶液。造模7 d后,留取24 h尿液,并進(jìn)行24 h尿蛋白定量(24 h-UTP)檢測(cè)。24 h-UTP≥100 mg表示造模成功[6]。將造模成功大鼠再隨機(jī)分為模型組(MG組)、卡格列凈組(KG組)、苯扎米爾組(BH組)、阿米洛利組(AL組)、卡格列凈+苯扎米爾組(KB組)、卡格列凈+阿米洛利組(KA組),每組7只。

1.3 藥物干預(yù)及一般情況觀察

卡格列凈使用劑量[10.5 mg/(kg·d)]依據(jù)人與大鼠用藥比例進(jìn)行換算,苯扎米爾[1.25 μg/(g·d)]及阿米洛利[10 mg/(g·d)]則依據(jù)說明書給予安全劑量,各藥物均使用0.9%氯化鈉溶液配制成相應(yīng)濃度備用。每天上午9: 00開始,各藥物組每只大鼠給予1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃, NG組則只給予0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)灌胃6周。每天灌胃前觀察大鼠的一般情況,記錄大鼠體質(zhì)量。

1.4 尿液指標(biāo)檢測(cè)

在干預(yù)前1 d和干預(yù)6周末,將各組的每只大鼠單獨(dú)放置于代謝檢測(cè)籠,期間禁食不禁水, 24 h后收集尿液,立即送大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)24 h-UTP、尿鈉(UNa)、尿鉀(UK), 采用日立7000 120+ISE+ID型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.5 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

藥物干預(yù)6周后,采用烏拉坦1.5 g/kg腹腔注射麻醉大鼠,剪開胸腹腔,抽取下腔靜脈血5 mL, 3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 吸取血清, -4 ℃保存。第2天冷鏈-80 ℃送至武漢賽維爾生物科技有限公司,采用Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、血鈣(SCa)、血鈉(SNa)、血鉀(SK)、25-羥維生素D(25-OH-D)、堿性磷酸酶(ALP)和甲狀旁腺素(PTH)水平。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)血清骨形成標(biāo)志物Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)和骨吸收標(biāo)志物Ⅰ型膠原羧基端肽β 特殊序列(β-CTX)的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量比較

各組大鼠體質(zhì)量符合正態(tài)分布,采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。大鼠初始體質(zhì)量及造模期間各組持續(xù)升高的體質(zhì)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見圖1。連續(xù)藥物干預(yù)2、4、6周后,大鼠體質(zhì)量變化為NG組、MG組持續(xù)上升(P<0.01), KG組持續(xù)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而AL組、BH組、KB組、KA組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,單用卡格列凈有減輕體質(zhì)量的作用,而卡格列凈聯(lián)用苯扎米爾或阿米洛利可能具有防止體質(zhì)量下降的作用。

圖1 各組大鼠灌胃前后體質(zhì)量變化

2.2 各組大鼠尿液指標(biāo)比較

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),干預(yù)前后24 h-UTP、UNa的方差齊性檢驗(yàn)均齊同,采用方差分析; UK方差不齊,采用秩和檢驗(yàn)。藥物干預(yù)前1 d行24 h-UTP檢測(cè); 藥物干預(yù)6周后,進(jìn)行24 h-UTP、電解質(zhì)的檢測(cè)和比較。

2.2.1 尿蛋白水平比較: 干預(yù)前1 d, MG組及各藥物組大鼠的24 h-UTP均較NG組升高,且超過100 mg, 表明造模成功。干預(yù)6周后,各藥物組大鼠24 h-UTP均較MG組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 單藥組間比較, BH組降低蛋白尿的效果較差,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 而KG組和AL組的降低效果比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 聯(lián)合用藥物KB組和KA組與KG組, KB組與BH組, KA組與AL組分別進(jìn)行比較, KA組降尿蛋白的效果最好,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 見表1。結(jié)果表明單獨(dú)用藥和聯(lián)和用藥均能使阿霉素誘導(dǎo)NS大鼠的尿蛋白降低,以KA組最為顯著。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠尿液指標(biāo)比較

2.2.2 UNa、UK比較: NG組與MG組的UNa水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); AL組、KB組、KA組的UNa水平高于MG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。單藥組間比較, AL組的UNa水平高于BH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); KB組的UNa水平高于BH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); KA組與AL組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明造模不影響UNa的排泄,單用AL組及聯(lián)合用藥KB組、KA組均有排鈉作用,僅聯(lián)合用藥KB組較單用藥BH組排鈉效果增強(qiáng)。各組的UK水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠血液指標(biāo)的比較

經(jīng)方差齊性檢驗(yàn), ALB、TC、TG、LDL、SCa、25-OH-D、ALP、PINP、PTH、β-CTX的方差均齊同,采用方差分析; SNa、SK方差不齊,采用秩和檢驗(yàn)。藥物干預(yù)6周后,進(jìn)行低蛋白血癥、高脂血癥、電解質(zhì)和骨代謝相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)和比較。

2.3.1 ALB水平比較: MG組較NG組下降,各藥物組均較MG組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 但各藥物組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表2。結(jié)果表明阿霉素誘導(dǎo)的NS 大鼠出現(xiàn)低蛋白血癥,單用和聯(lián)用藥物均能使其得到改善且效果接近。

表2 藥物干預(yù)6周后各組大鼠血液指標(biāo)比較

2.3.2 脂質(zhì)代謝指標(biāo)TC、TG、LDL水平比較: MG組均高于NG組,各藥物組均較MG組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01), 但各單用藥組進(jìn)行組間比較及各聯(lián)合用藥物組與相應(yīng)的單用藥組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表2。結(jié)果表明阿霉素誘導(dǎo)的NS大鼠出現(xiàn)高脂血癥,單用和聯(lián)用各藥物后,均能獲得相差不明顯的降血脂效果。

2.3.3 電解質(zhì)SCa、SNa、SK水平比較: MG組的SCa水平較NG組升高,各藥物組較MG組均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); KG組的降SCa效果較AL組更好,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明,造模后NS大鼠的SCa水平上升,各藥物組治療后均使SCa水平下降,但單用阿米洛利降SCa的效果較差。各組的SNa、SK水平間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 藥物干預(yù)6周后各組大鼠血液指標(biāo)比較 mmol/L

2.3.4 骨代謝指標(biāo)25-OH-D、ALP、PINP、PTH、β-CTX水平比較: 前三者有利于促進(jìn)成骨,后兩者則促進(jìn)破骨。藥物干預(yù)6周后,進(jìn)行各指標(biāo)比較。MG組的25-OH-D、ALP、PINP水平較NG組均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); 與MG組比較,單用藥AL組25-OH-D、PINP水平升高,聯(lián)合用藥KA組25-OH-D、ALP、PINP水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); 與KG組比較, KA組的ALP水平升高, KB組的PINP水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與NG組比較, MG組的PTH水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), MG組、AL組的β-CTX水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), KG組、BH組、KB組的β-CTX水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 而KA組的β-CTX水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與MG組比較, KA組的β-CTX水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與KG組相比, KA組的PTH、β-CTX水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。結(jié)果表明,造模NS大鼠的破骨因子可能受到抑制,單用或聯(lián)用藥物后的破骨作用可不產(chǎn)生明顯影響,但在阿米洛利與卡格列凈聯(lián)用后,有可能增加了后者導(dǎo)致骨折的風(fēng)險(xiǎn)。

表4 藥物干預(yù)6 周后各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較

3 討 論

阿霉素是一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥物,通過對(duì)腎臟的直接毒性作用來誘發(fā)腎小管間質(zhì)損傷,可用于構(gòu)建高度可重復(fù)的NS 模型[7]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)經(jīng)尾靜脈注射阿霉素后的大鼠尿液和血液檢測(cè)結(jié)果證明模型復(fù)制成功。骨質(zhì)疏松癥是以骨吸收超過骨形成引起的骨密度下降和骨組織微觀結(jié)構(gòu)惡化為特征的一種全身退變性骨病[8], 其是NS的常見并發(fā)癥,與血清總鈣和維生素D 水平降低有關(guān)[9]。鈣-PTH-維生素D軸是經(jīng)典的SCa調(diào)節(jié)通路。SCa降低時(shí), PTH的合成、分泌增加,促進(jìn)腎重吸收鈣,并增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收作用使骨鈣釋放增多,同時(shí)刺激腎將25-OH-D轉(zhuǎn)化為維生素D的活性形式1, 25-(OH)2-D3以增強(qiáng)腸道鈣的吸收,從而升高SCa[10-11]。PINP和β-CTX 分別為骨形成和骨吸收的標(biāo)志物,反映骨重塑率,可作為診斷骨質(zhì)疏松癥的參考指標(biāo)[12-13]。ALP也可作為診斷和治療骨質(zhì)疏松癥的有效生物標(biāo)志物, ALP水平升高代表成骨細(xì)胞活性和骨化增強(qiáng)[14]。研究[15]認(rèn)為, β-CTX在預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥方面優(yōu)于骨密度。此外,低鈉血癥能增加破骨細(xì)胞形成和骨吸收活性,也與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)造模后大鼠的SCa升高,促骨形成因子25-OH-D、ALP、PINP水平和促破骨因子PTH均顯著下降,而SNa、SK、UNa、UK和β-CTX水平均無明顯變化,表明阿霉素誘導(dǎo)的NS模型主要通過抑制成骨作用增加骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)。

SGLT2i 可阻斷近端腎小管的重吸收來增強(qiáng)尿液中葡萄糖和鈉的排泄[17], 還可能會(huì)破壞磷酸鹽和鈣的穩(wěn)態(tài),影響骨骼結(jié)構(gòu),導(dǎo)致體質(zhì)量減輕[18]。臨床薈萃分析[19-20]表明, SGLT2i治療2型糖尿病患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)總比率為0.67, 其致病機(jī)制并不十分明確。其中,卡格列凈增加骨折的風(fēng)險(xiǎn),與血清1, 25-(OH)2-D3減少和PTH 增加導(dǎo)致骨量減少有關(guān)[21], 還與血清β-CTX 的增加相關(guān)[22]。本研究中,卡格列凈治療NS后大鼠的體質(zhì)量減少, SCa降低,而SNa、SK、UNa、UK、25-OH-D、ALP、PTH、PINP和β-CTX 均無明顯變化,表明卡格列凈有可能通過降低SCa和減輕體質(zhì)量增加骨折風(fēng)險(xiǎn),而通過打破血清成骨/破骨因子平衡造成骨折尚需達(dá)到一定的條件。

上皮鈉通道在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞上都有分布[4]。研究[23]發(fā)現(xiàn), NS患者尿中的絲氨酸蛋白酶增多,使上皮鈉通道的α 和γ 亞基被蛋白水解,導(dǎo)致該通道過度激活,引起鈉水潴留。血清鈉增加可能會(huì)刺激成骨細(xì)胞的增殖、分化和基因表達(dá)[24]。用阿米洛利治療腎病小鼠,可使尿中的絲氨酸蛋白酶活性正常化并防止鈉水潴留[25], 并減少大鼠破骨細(xì)胞的數(shù)量,抑制破骨細(xì)胞中基因cathepsinK的表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn),阿米洛利和苯扎米爾對(duì)SNa、SK、UNa、UK以及血清ALP、PTH和β-CTX的影響不明顯,均可導(dǎo)致NS大鼠的SCa下降,但只有阿米洛利能使25-OH-D、PINP升高,表明阿米洛利可能通過促進(jìn)成骨作用來防止NS 大鼠的骨質(zhì)疏松。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的NS大鼠模型給予SGLT2i、ENaCi及兩者聯(lián)合用藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單藥和聯(lián)合用藥均可有效降低尿蛋白和血脂,升高血清ALB, 可用于NS的治療。本實(shí)驗(yàn)還觀察到,聯(lián)用卡格列凈和阿米洛利治療后, NS大鼠的SCa降低,血清25-OH-D、ALP、PINP和β-CTX水平均升高,表明二者聯(lián)用能顯著加強(qiáng)成骨作用,破骨作用也可能增強(qiáng),從而形成新的成骨/破骨平衡。本研究為治療NS提供了新的用藥參考,卡格列凈聯(lián)用阿米洛利可能有預(yù)防NS相關(guān)骨質(zhì)疏松的作用,但具體機(jī)制需進(jìn)一步探索。