丙泊酚血藥濃度檢測方法建立及在淋巴水腫患者中的應(yīng)用Δ

李京峰 ，時正媛 ，張夢潔 ，關(guān)雷 ，姜德春 #（.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 00038；.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院麻醉科，北京 00038）

丙泊酚是一種具有抗焦慮、調(diào)節(jié)免疫等作用的靜脈麻醉藥，其半衰期短、起效快，且麻醉后患者不適感較少，因此臨床應(yīng)用廣泛[1-2]。但丙泊酚在臨床應(yīng)用中可能會引起呼吸抑制、血流動力學(xué)不穩(wěn)定等不良反應(yīng)[3]，尤其是高齡、肝腎代謝排泄異常和體內(nèi)循環(huán)功能異常的特殊患者，其體內(nèi)的丙泊酚吸收、分布、代謝、排泄特征會發(fā)生改變，這可能會加劇丙泊酚所致的不良反應(yīng)[4]。

淋巴水腫是由于淋巴管阻塞使得淋巴液回流發(fā)生障礙，導(dǎo)致過多富含蛋白質(zhì)的液體積聚于組織間隙而引起的水腫[5-6]。手術(shù)過程中，淋巴水腫患者因淋巴液回流障礙造成大量血漿蛋白積聚在組織間隙或體腔中，影響了血液中丙泊酚的代謝、排泄過程，從而影響丙泊酚用藥后的安全性[7-9]。因此，探究丙泊酚在該類患者體內(nèi)的代謝、排泄過程，對提高丙泊酚的用藥安全性具有重要意義。

由于丙泊酚顯弱酸性，且具有高親脂性的特點[10]，導(dǎo)致其在分離色譜柱上的保留特征復(fù)雜，而使得分析方法的重復(fù)性較差。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)雖然已報道了多種丙泊酚血藥濃度的分析方法[11-13]，但這些方法的專屬性和靈敏度均較低。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）技術(shù)可通過超高效液相技術(shù)對待測物進(jìn)行分離，并利用質(zhì)譜檢測器對待測物的準(zhǔn)分子離子和特征碎片離子進(jìn)行檢測，具有分析速度快、選擇性好、靈敏度高的特點[14]。本研究建立了檢測人血漿中丙泊酚濃度的UPLC-MS/MS法，并嘗試應(yīng)用于臨床，旨在為臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Acquity H-Class型超高效液相系統(tǒng)（美國Waters公司）、QTRAP 5500型質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司）、Quintix 125D-1CN型電子天平（德國Sartorius公司）、Sigma 3-18K型低溫高速離心機(jī)（德國Sigma-Aldrich公司）、Vortex-5型斡旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Milli-Q Integral 5水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

丙泊酚對照品（批號100806-201803，純度99.9%）、麝香草酚（內(nèi)標(biāo)，批號100508-201603，純度99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、氨水均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；水為純化水。

1.3 血漿樣品

人空白血漿（批號3807253）購自上海譜芬生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

以Kinetex C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～1 min，5%A；1～4 min，5%A→95%A；4～6 min，95%A；6～8 min，5%A）；流速為200 μL/min；進(jìn)樣量為5 μL；柱溫為40 ℃；樣品倉溫度為15 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）進(jìn)行檢測；噴霧電壓為－4 500 V；毛細(xì)管溫度為400 ℃；霧化氣壓為30 psi，輔助加熱氣壓為30 psi，氣簾氣壓為10 psi，碰撞氣壓為6 psi；用于定量分析的離子對為m/z177.0→161.2、碰撞能量30 eV（丙泊酚），m/z149.0→133.1、碰撞能量35 eV（內(nèi)標(biāo)）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液及質(zhì)控儲備液

精密稱取丙泊酚對照品12.00 mg，用甲醇-水（1∶1，V/V，下同）溶液溶解并稀釋，得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的對照品儲備液。同法制備質(zhì)量濃度為8 mg/mL的質(zhì)控儲備液。上述溶液均于4 ℃冰箱密封保存、備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取內(nèi)標(biāo)2.00 mg，用乙腈溶解并稀釋，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液。吸取上述溶液0.5 mL，置于500 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃冰箱密封保存、備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液

取“2.2.1”項下對照品儲備液10 μL，加入甲醇-水溶液990 μL，渦旋混勻1 min，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液。取上述溶液，用甲醇-水溶液稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。取上述各標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液10 μL，加入空白血漿90 μL，渦旋混勻1 min，得質(zhì)量濃度為50～5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.2.4 質(zhì)控樣品溶液

取“2.2.1”項下質(zhì)控儲備液10 μL，加入甲醇-水溶液990 μL，渦旋混勻1 min，得質(zhì)量濃度為80 μg/mL的溶液。取上述溶液，用甲醇-水溶液稀釋，得質(zhì)量濃度分別為0.5、0.8、4、40 μg/mL的質(zhì)控工作液。取上述各質(zhì)控工作液10 μL，加入空白血漿90 μL，渦旋混勻1 min，得質(zhì)量濃度為50、80、400、4 000 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液。

2.3 血漿樣品的前處理

精密吸取待測血漿樣品100 μL，置于1.5 mL塑料離心管中，加入“2.2.2”項下內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，渦旋混勻30 s，以12 000 r/min離心30 min，取上清液進(jìn)樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

按國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會的指導(dǎo)原則《M10：生物分析方法驗證及樣品分析》進(jìn)行驗證。

2.4.1 專屬性考察

分別取6份不同來源的人空白血漿樣本，加入乙腈200 μL，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄空白色譜圖（圖1A）。取“2.2.3”項下質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液10 μL，加入空白血漿90 μL，渦旋混勻30 s，加入“2.2.2”項下內(nèi)標(biāo)溶液200 μL，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1B）。取患者血漿樣品100 μL，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（圖1C）。結(jié)果顯示，空白血漿樣品色譜圖中均無內(nèi)源性干擾峰。

圖1 丙泊酚及內(nèi)標(biāo)的典型MRM圖

2.4.2 線性關(guān)系及定量下限考察

取“2.2.3”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。以丙泊酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、丙泊酚與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值之比為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重為1/x2）進(jìn)行回歸方程擬合，得丙泊酚的回歸方程為y＝0.001 93x+0.024 20（r＝0.995 0），表明丙泊酚檢測質(zhì)量濃度在50～5 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。定量下限為50 ng/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗

取“2.2.4”項下質(zhì)控樣品溶液，每個濃度平行6份，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，考察批內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，考察批間精密度，并以實測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的偏差作為準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，批內(nèi)精密度的RSD為3.64%～4.71%（n＝6）；批間精密度的RSD%為1.51%～8.08%（n＝6）；準(zhǔn)確度為－6.81%～1.55%（n＝6），表明該方法的精密度、準(zhǔn)確度均較好。

2.4.4 殘留效應(yīng)

取“2.2.3”項下質(zhì)量濃度為5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.3”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，每個樣品檢測后再隨行檢測1個空白血漿樣品。結(jié)果顯示，空白樣品中均未檢測到丙泊酚及內(nèi)標(biāo)，表明檢測高質(zhì)量濃度樣品后，儀器無殘留效應(yīng)。

2.4.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

取“2.2.1”項下質(zhì)控儲備液，用甲醇-水溶液稀釋，得質(zhì)量濃度分別為80、400、4 000 ng/mL的溶液A，每個濃度平行6份。取空白血漿，用2倍體積乙腈沉淀蛋白后，以12 000 r/min離心30 min，取上清液，然后將“2.2.1”項下質(zhì)控儲備液用上述上清液稀釋，得質(zhì)量濃度為80、400、4 000 ng/mL的溶液B，每個濃度平行6份。按“2.2.4”項下方法制備質(zhì)量濃度為80、400、4 000 ng/mL的溶液C，每個濃度平行6份。將溶液A、B、C按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，分別記錄峰面積A、B、C。基質(zhì)效應(yīng)＝峰面積B/峰面積A×100%；提取回收率＝峰面積C/峰面積B×100%。結(jié)果顯示，基質(zhì)效應(yīng)為97.93%～101.73%，RSD均小于5.16%（n＝6）；提取回收率為89.80%～93.73%，RSD均小于3.25%（n＝6）。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.4”項下質(zhì)量濃度分別為80、400、4 000 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，每個濃度平行6份，分別于室溫條件下放置1、4 h，－80 ℃下放置30 d，－80 ℃和室溫條件下反復(fù)凍融3次，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。另取“2.2.4”項下質(zhì)量濃度分別為80、400、4 000 ng/mL的質(zhì)控樣品溶液，每個濃度平行6份，按“2.3”項下方法處理后，將樣品置于樣品倉中12 h，按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，各樣品在上述條件下的穩(wěn)定性均良好，RSD均小于3.27%，準(zhǔn)確度為－5.45%～－1.27%。結(jié)果見表1。

表1 丙泊酚的穩(wěn)定性檢測結(jié)果（±s，n＝6，ng/mL）

表1 丙泊酚的穩(wěn)定性檢測結(jié)果（±s，n＝6，ng/mL）

理論濃度80 400 4 000實測室溫放置1 h 78.98±2.24 382.12±9.00 3 829.74±70.05實測室溫放置4 h 78.46±2.56 380.29±8.48 3 794.18±37.29實測凍融3次78.17±1.90 387.71±4.23 3 782.10±78.34實測－80 ℃放置30 d 77.81±1.13 386.20±6.53 3 841.11±87.90實測樣品倉放置12 h 77.87±2.54 384.46±11.34 3 825.40±102.72

2.4.7 稀釋效應(yīng)

按“2.2.3”項下方法制備質(zhì)量濃度為50 000 ng/mL血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍，平行稀釋6個樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，準(zhǔn)確度為－6.77%～0.27%（n＝6），表明高質(zhì)量濃度樣品稀釋10倍后無稀釋效應(yīng)。

2.5 臨床應(yīng)用

2.5.1 患者納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究的患者納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）按美國麻醉醫(yī)師協(xié)會健康狀況分級為Ⅰ～Ⅱ級；（2）年齡26～54歲；（3）無中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無精神障礙，無嚴(yán)重的心血管及呼吸系統(tǒng)疾病；（4）肝腎功能正常；（5）體重在標(biāo)準(zhǔn)體重的±20%范圍內(nèi)。

本研究的患者排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）有丙泊酚使用禁忌證者；（2）術(shù)中發(fā)生突發(fā)情況導(dǎo)致無法完成樣本收集者；（3）繼續(xù)研究會對患者生命、健康造成風(fēng)險；（4）術(shù)前或術(shù)后提出終止研究者。

2.5.2 資料來源

選擇2021年7月1日－2022年7月1日首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院收治的因患有淋巴水腫而行淋巴靜脈吻合手術(shù)的乳糜患者6例，其中男性4例，女性2例；年齡26～54歲。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號sjtkyll-lx-2020（71）。所有患者均簽署了知情同意書。

2.5.3 用藥方法

患者術(shù)中靶控輸注（target controlled infusion，TCI）丙泊酚乳狀注射液（意大利Corden Pharma S.P.A公司，規(guī)格20 mL∶200 mg，注冊證號H20171277），誘導(dǎo)麻醉總劑量為1.5～2.5 mg/kg，以20～50 mg/min給藥，維持劑量為4～12 mg/（kg·h）；丙泊酚血漿靶濃度為3 μg/mL。

2.5.4 檢測方法與檢測結(jié)果

所有患者分別于TCI 2、5、10、30 min，停藥后0（即刻）、2、5、10、30 min和停藥后1、2、4、8 h采集橈動脈血2 mL，置于肝素抗凝管中，以3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測（超出檢測上限的血漿樣品需稀釋后測定）。結(jié)果顯示，6例患者在TCI 2～30 min內(nèi)的血藥濃度分別為1 871.6～4 008.2、2 972.2～4 131.1、3 482.5～5 120.1、4 250.2～4 972.3、3 643.7～6 056.2、1 865.3～2 093.7 ng/mL，均維持在較穩(wěn)定的范圍內(nèi)；停藥后，丙泊酚被快速代謝，停藥后4～8 h內(nèi)基本代謝完全。結(jié)果見表2。

表2 6例患者血漿中丙泊酚濃度的檢測結(jié)果（ng/mL）

3 討論

由于丙泊酚及內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)中均含有酚羥基，故在電噴霧離子源中易失去H+而帶負(fù)電荷，因此本研究中選用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。同時，丙泊酚及內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]－分別為m/z177.0、m/z149.0，在對碎片離子進(jìn)行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，丙泊酚碎片離子m/z161.2和內(nèi)標(biāo)碎片離子m/z133.1信號較強(qiáng)且穩(wěn)定，因此最終選定用于定量分析的離子對分別為m/z177.0→161.2（丙泊酚）、m/z149.0→133.1（內(nèi)標(biāo)）。

丙泊酚的酸度系數(shù)（acidity constant，pKa）為11.10，呈弱酸性，在溶液中易發(fā)生電離，為保證丙泊酚在色譜柱上保留，通常需加入揮發(fā)性的弱酸來抑制丙泊酚的電離；此外，由于弱酸性化合物在電噴霧離子源中易失去H+而帶負(fù)電荷，此時需要在流動相中加入揮發(fā)性的弱堿，以提高響應(yīng)值。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，若在流動相中加入弱堿，會與丙泊酚發(fā)生酸堿反應(yīng)，導(dǎo)致其色譜行為發(fā)生改變；若加入弱酸則會使質(zhì)譜響應(yīng)降低，導(dǎo)致靈敏度下降。本課題組在前期方法建立中，曾嘗試以水和乙腈作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以水和乙腈為流動相時，丙泊酚的色譜分離較好，質(zhì)譜信號強(qiáng)度合適。

TCI 2～30 min時，患者6的丙泊酚血藥濃度低于其余5例患者，這可能與不同患者對丙泊酚的耐受性不同有關(guān)。TCI可根據(jù)患者用藥前后的心率、血壓、血氧含量、呼吸功能和麻醉深度等來調(diào)節(jié)丙泊酚的用量，患者6可能對丙泊酚的耐受性較低，在較低的血藥濃度時就能維持良好的麻醉效果。所有患者在停藥后，丙泊酚均能被快速代謝，停藥后4～8 h內(nèi)基本代謝完全。

綜上所述，本研究所建UPLC-MS/MS法可以在不進(jìn)行衍生化的前提下，實現(xiàn)對丙泊酚的測定，樣品前處理過程簡便、快速，可用于淋巴水腫患者血漿樣本中丙泊酚的血藥濃度檢測，以滿足此類患者丙泊酚臨床治療藥物濃度監(jiān)測的需要。