circMYO9A_006通過翻譯蛋白MYO9A-208aa發揮抑制心肌細胞肥大的作用*

姜佳雪， 蘇金鳳， 王 婭， 歐 濤， 李 暉， 徐金東，劉宇鵬， 方咸宏， 單志新，5△

[1華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006；2南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）檢驗科，廣東 廣州 510080；3南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）麻醉科，廣東 廣州 510080；4南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）心內科，廣東 廣州 510080；5南方醫科大學附屬廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）醫學研究部，廣東 廣州 510080］

心血管疾病已成為全世界范圍內人口死亡的主要原因之一[1］。正常心臟在受到外界刺激后，會發生生理性或病理性心肌肥大，生理性肥大通常發生在運動訓練后、心臟病早期、妊娠末期或甲狀腺功能亢進時，是心臟發生的一種良性的適應性反應[2］；但在長期的高血壓或超負荷血流灌注刺激下，這種生理性適應會演變成病理性心肌肥大，并進一步引發心力衰竭[3-4］。有研究證實，包括非編碼RNA 在內的多種表觀遺傳方式在多種心血管疾病的發生中發揮重要的調節作用[5-6］。

環狀RNA（circular RNA， circRNA）為單鏈閉合的非編碼RNA 分子，在病毒、原核生物、單細胞真核生物和哺乳動物（也包括人類基因轉錄組）中均有表達[7］。多數circRNA 來源于其宿主基因的外顯子序列，可通過不同的剪接環化方式形成[8］。與線性mRNA 分子相比，circRNA 轉錄效率較低，但卻有更好的RNA 穩定性。circRNA 可做為微小RNA 或某些RNA 結合蛋白的分子海綿，對其起到特異性吸附作用[9-10］，而一些circRNA 具有翻譯蛋白/多肽的能力，并通過其翻譯產物來發揮相應的生物學功能[11］。

circMYO9A_006 是由其宿主基因肌球蛋白IXA（myosin IXA，MYO9A）的第2～4 個外顯子序列，通過反向剪接形成的circRNA，全長為1 126 nt。我們前期的circRNA 表達譜分析結果顯示，circMYO9A_006在心衰患者心肌標本中表達顯著升高[12］，但其對心肌細胞肥大表型的調控作用尚不清楚。序列分析結果提示，該circRNA 包含1 個可能的開放閱讀框（open reading frame， ORF）及2 個內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site， IRES）。本項工作擬研究circMYO9A_006 對原代分離培養的大鼠和小鼠心肌細胞肥大表型的調節作用，并明確其是否具有翻譯蛋白作用，并通過翻譯的蛋白來發揮對心肌細胞肥大表型的調節作用。

“移就”又稱“轉借”、“移狀”、“移用”，就是當甲乙兩事物連在一起時，把原來屬于甲事物的性狀詞語移用到乙事物上的一種修辭格。

農戶是使用機械設備進行農業生產的主要力量，在農機深松整地技術推廣過程中，首先需要面對的就是廣大農戶群眾，農機深松整地技術推廣需要農戶群眾的積極配合。因此，在推廣過程中必須要加強對農戶的教育，引導農戶改變傳統的思想觀念，讓農戶認識到農機深松整地技術的重要性；學習專業的設備操作技巧，從而在日常生產過程中加強對機械設備的利用，提高生產水平[3]。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

本研究所使用的實驗動物有出生1～3 d的SPF級C57BL/6 乳小鼠和Sprague-Dawley （SD）乳大鼠，雌雄不限，分別用于分離原代乳小鼠心室肌細胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes， NMVCs）和乳大鼠心室肌細胞（neonatal rat ventricular cardiomyocytes，NRVCs）。以上實驗動物均購于廣州省醫學實驗動物中心[生產許可證號為SCXK（粵）2022-0002］。

2 細胞系和主要試劑

1.1 研究對象 回顧性分析2016年10月-2018年7月來我院（萍鄉市胎兒畸形產前篩查中心）行III級產前超聲檢查孕婦23835例，經產后超聲心動圖及引產后胎兒尸解證明上腔靜脈先天性變異的72例患者。

抗體均在5%脫脂乳充分溶解后用于Western blot：鼠抗Flag-M2 型抗體（F3165，稀釋比例1∶1 000）購自Sigma；兔抗β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain， β-MHC）抗體（A7564，稀釋比例1∶3 000）和兔抗骨骼肌肌動蛋白α1（skeletal muscle actin alpha 1，ACTA1）抗體（ab197345，稀釋比例1∶5 000）購自ABclonal；兔抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（19H19L1，稀釋比例1∶1 000）購自Invitrogen。

2.1.9 錳。2012年全市葉片錳平均含量為167.40 mg/kg(表1)，說明錳的含量在較高的水平，這與果園較低的土壤pH和土壤透氣性不良有關。果樹錳含量過高易產生毒性，表現為粗皮病，韌皮部壞死枯斑，通常土壤pH 5.0以下尤為明顯。高的土壤 pH(>6.3)易導致錳缺乏，相反，低的 pH(<5.6)會導致錳過剩。土壤 pH 4.5提高到pH 6.5，土壤錳的有效性降低30 ～50倍。如果錳缺乏，在落花后10～14 d噴布一次硫酸錳(濃度約4 g/L)即可。

Trizol Reagent 購 自Invitrogen；5× PrimeScript ?RT Master Mix 和預混型qPCR 試劑盒購自TaKaRa；膠原酶粉末購自Sigma；Dual-Luciferase?Reporter Assay System 購自Promega；鬼筆環肽（phalloidin）購自翌圣生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和蛋白Marker購自Thermo；PVDF 膜和Immobilon ECL Ultra Western HRP 試劑購自Millipore；超敏發光液購自廣州創偉生物科技有限公司；脫脂奶粉購自Bio-Rad。

3 主要實驗方法

所有數據的統計均用GraphPad Prism 9.5 進行分析，表示為三個獨立實驗的均數±標準差（mean±SD）。多組間均數比較用采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

資金來源渠道的單一嚴重限制了我國互聯網汽車金融行業的發展，互聯網汽車金融企業要運用多種方式籌集資金，拓寬籌資渠道。比如發行金融債券，向同業機構進行拆借等方式。這可以有效地克服先前資金來源期限短、金額少等缺點，促進互聯網汽車金融行業的發展。

3.5 雙螢光素酶報告基因實驗 通過DNA 合成出circMYO9A_006 的2 個可能的IRES 序列，并定向克隆到pGL3-Promoter 螢光素酶載體中。將1 μg 海腎螢光素酶質粒（作為內部對照）與構建好的螢光素酶質粒共轉染293T 細胞。轉染后24 h 后，用購自Promega的雙螢光素酶報告基因測定試劑盒中的裂解緩沖液裂解細胞，按照試劑盒指示測量螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶活性。相對螢光素酶活性即為被海腎螢光素酶標準化的螢火蟲螢光素酶的值。

3.4 鬼筆環肽染色 參照我們已報道的方法[13］，預先在激光共聚焦細胞培養皿中鋪適當鼠尾膠原，使膠原均勻蓋滿皿底。于37 ℃細胞培養箱孵育1 h 以上，吸出膠原，將適量密度的乳小鼠心肌細胞懸液接種到皿中，置于細胞培養箱中培養。次日，用高壓滅菌后的PBS 反復沖洗細胞，棄去廢液。每皿加入1 mL 含2%血清的F12 培養液，將細胞同步化處理12 h。對照組細胞以帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）的空載腺病毒感染，實驗組細胞分別感染含不同目的基因的重組腺病毒，每組均做3個復孔處理。充分感染24 h 后棄原有細胞培養液，用PBS 漂洗細胞3 次。加入4%多聚甲醛室溫靜置固定20 min。回收多聚甲醛，PBS 洗滌細胞3 次（每次10 min），用提前2 h 配好的0.1% Triton X-100 透化細胞。棄透化液，加入500 μL 用3%牛血清白蛋白溶液配好的鬼筆環肽工作液（iFluor? 647 標記的鬼筆環肽）避光孵育90 min。回收工作液，用預先配好的PBST 漂洗細胞3 次，每次10 min。加入3～5 滴DAPI 染色劑染色15 min 后，用PBS 漂洗5 min 后即可用于共聚焦顯微鏡拍照。使用ImageJ 軟件進行細胞表面積的測量。

3.3 Western blot 事先用PBS 輕輕漂洗掉孔板內原有的細胞培養液，加入適量的RIPA 裂解液置于冰上充分裂解15 min。事先預冷離心機至4 ℃，將細胞裂解液于12 000×g離心15 min。取上清液，按照說明書指示，利用標準曲線法檢測蛋白濃度。接著加入適量4×蛋白上樣緩沖液于99 ℃變性10 min。利用SDS-PAGE 分離樣品中不同分子量大小的蛋白，并將其轉印到PVDF 膜上。將含有轉印蛋白的PVDF膜在室溫下用封閉液（含0.1% Tween 20和5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液）封閉1 h 后，加入相應的Ⅰ抗稀釋液，4 ℃過夜孵育。次日用TBST 緩沖液漂洗膜3次，每次6 min。用相應的Ⅱ抗稀釋液，于室溫孵育1 h 后，TBST 緩沖液漂洗膜3 次，每次10 min。使用LAS 500進行化學發光，后續用ImageJ軟件進行灰度值分析。

3.2 RT-qPCR 使用Trizol 試劑從培養的細胞中提取總RNA，按照PrimeScript? Master Mix 逆轉錄試劑說明書指示，將總RNA 逆轉錄為cDNA。使用2×SYBR Green Mix 和相應引物進行RT-qPCR 檢測，用2-ΔΔCt公式計算相對基因表達水平。circMYO9A_006的上游引物序列為5'-AGGAGCAAGTGAAGATGAGAGA-3'，下游引物序列為5'-TTCAAAGCGTCGTCTTCCTC-3'，內參照GAPDH 的上游引物序列為5'-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下游引物序列為5'-CCACCCTGTTGCTGTAGCC-3'。PCR 條 件 如下：一個初始變性周期（95 ℃ 3 min），40 個擴增循環（95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s），熔解曲線分析（95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃連續），冷卻期（40 ℃30 s）。

4 統計學處理

3.1 分離和培養乳鼠心肌細胞 采用課題組以往做法分離并培養乳鼠心肌細胞[12］。取1～3 日齡的C57BL/6乳小鼠或SD 乳大鼠，拉緊其背頸部皮膚，持眼科剪沿腋下橫向剪開，取出心臟置于提前預冷的PBS 中，將心臟周圍血管和結締組織用鑷子輕輕剝離，置于7 mL 胰蛋白酶（0.1% trypsin-EDTA）中，4 ℃搖床上消化過夜。次日，加入14 mL 完全培養液并置于37 ℃水浴鍋中孵育10 min終止消化。棄去試管中原有液體，加入10 mL事先用F12培養液配好的膠原酶溶液，37 ℃孵育10 min 后用巴氏管不斷吹打直至吹碎整個心臟，用70 μm 細胞濾網過濾后將細胞懸液置于細胞培養瓶中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，約1.5 h 后部分細胞貼壁，吸出上層細胞懸液即為乳鼠心肌細胞，置于已提前鋪好鼠尾膠原的細胞板中。用含10% FBS 的完全培養液培養，使細胞穩定生長24 h后進行后續實驗。

結 果

1 過表達circMYO9A_006 可抑制NMVCs 中心肌肥大相關蛋白表達

circMYO9A_006來源于其宿主基因MYO9A的第2～4 個外顯子反向剪接環化形成，由1 226 個堿基組成（圖1A）。通過分子克隆技術構建rAd-circ-MYO9A_006 重組腺病毒，其載體本身帶有GFP 標簽，用其感染NMVCs 24 h 后，觀察到GFP 熒光充分表達；RT-qPCR 結果顯示腺病毒可介導circMYO9A_006 在NMVCs 中有效表達（圖1B）。DNA 測序結果證實，在NMVCs 中過表達的circMYO9A_006 包含正確的接頭序列，見圖1C。Western blot 結果顯示，與感染空載體重組腺病毒組相比，過表達circMYO9A_006 可有效抑制NMVCs 中肥大相關蛋白β-MHC、ACTA1和ANP的表達（P＜0.01），見圖1D。

Figure 1. Overexpression of circMYO9A_006 inhibited the expression of hypertrophy-related proteins in neonatal mouse ventricular cardiomyocytes （NMVCs）. A： circMYO9A_006 sequence is derived from exon 2 to exon 4 of MYO9A gene； B： the infection efficiency of rAd-circMYO9A_006 was monitored by the co-expressed marker green fluorescent protein， and the expression of circMYO9A_006 was determined by RT-qPCR； C： DNA Sanger sequencing results showed the correct junction sequence of the exogenously overexpressed circMYO9A_006 in NMVCs； D： the protein expression of β-myosin heavy chain（β-MHC）， skeletal muscle actin alpha 1（ACTA1） and atrial natriuretic peptide （ANP） was decreased in NMVCs with overexpression of circMYO9A_006. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector group.圖1 過表達circMYO9A_006抑制NMVCs中肥大相關蛋白表達

2 過表達circMYO9A_006 可抑制NRVCs 的肥大表型

利用腺病毒介導在分離培養的NRVCs 中過表達circMYO9A_006。Western blot 結果顯示，與感染對照腺病毒組相比，過表達circMYO9A_006 可有效抑制NRVCs 中肥大相關蛋白β-MHC、ACTA1 和ANP的表達（P＜0.01），見圖2A。建立去氧腎上腺素（phenylephrine， PE）誘導的NRVCs 肥大模型。鬼筆環肽染色結果顯示，過表達circMYO9A_006 可顯著縮小PE 誘導的NRVCs 細胞表面積（P＜0.05），表明過表達circMYO9A_006 可抑制PE 誘導的NRVCs 肥大表型。

人胚腎293T 細胞株來源于美國細胞培養物收藏中心（ATCC）細胞庫。細胞在補充有10%澳洲胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的DMEM/F12 培養液（Gibco）中培養，培養條件為37 ℃、5% CO2的加濕細胞培養箱。

Figure 2. Overexpression of circMYO9A_006 inhibited the expression of hypertrophy-related proteins in neonatal rat ventricular cardiomyocytes （NRVCs）. A： the protein expression of β-myosin heavy chain （β-MHC）， skeletal muscle actin alpha 1 （ACTA1） and atrial natriuretic peptide （ANP） was suppressed in NRVCs with overexpression of circMYO9A_006； B： the morphological changes of NRVCs observed by Phalloidin-iFluor 647 staining showed that overexpression of circMYO9A_006 reduced phenylephrine （PE）-induced NRVC size （scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector group； △P＜0.05 vsvehicle+vector group； #P＜0.05 vsPE+vector group.圖2 過表達circMYO9A_006抑制NRVCs中肥大相關蛋白表達

3 circMYO9A_006 可翻譯出含208 個氨基酸的蛋白

通過在線程序circBank （http：//www. circbank.cn/searchCirc.html）進行序列分析提示，circMYO9A_006包含2個潛在的IRES和1個可翻譯出含208個氨基酸蛋白（命名為MYO9A-208aa）的ORF（圖3A、B）。我們將兩個潛在IRES 的DNA 序列定向克隆到螢光素酶報告基因載體上，雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，與陽性對照circ_0001742 相似，circMYO9A_006所包含的兩個IRES序列具有介導下游ORF翻譯的作用（圖3C）。Western blot結果顯示，在NRVCs中過表達circMYO9A_006后，在28 kD位置有特異表達的蛋白條帶（圖3D）。通過對成功過表達MYO9A-208aa 的NRVCs 進行蛋白核質分離實驗，發現該翻譯蛋白主要定位于細胞質中（圖3E）。

Figure 3. Identification of circMYO9A_006-translated MYO9A-208aa protein. A： the IRES and ORF sequences in circMYO9A_ 006；B： the predicted amino acid sequences of circMYO9A_006-translated MYO9A-208aa protein； C： detection of the activity of 2 IRES sequences in circMYO9A_006 by dual-luciferase reporter assay （FL： firefly luciferase； RL： Renilla luciferase）；D： identification of circMYO9A_006-translated MYO9A-208aa in neonatal rat ventricular cardiomyocytes （NRVCs） by Western blot； E： identification of the intracellular localization of MYO9A-208aa in NRVCs by Western blot. MYO9A-208aa was shown accumulated in the cytoplasm.圖3 circMYO9A_006翻譯蛋白MYO9A-208aa的鑒定

4 MYO9A-208aa 介導了circMYO9A_006 對心肌細胞肥大的抑制作用

為了進一步探究circMYO9A_006 翻譯蛋白的生物學功能，本研究分別構建了circMYO9A_006 的ORF 中ATG 突變（circMYO9A_006-ATG-mut，ATG 變為AG，不能起始翻譯）和表達circMYO9A_006-ORFflag 的載體，見圖4A。Western blot 結果顯示，circ-MYO9A_006-ATG-mut 不能翻譯產生MYO9A-208aa，只有circMYO9A_006-flag 和circMYO9A_006-ORFflag 可一致表達MYO9A-208aa 蛋白（圖4B）。同時，只有過表達circMYO9A_006-flag 和circMYO9A_006-ORF 可一致地下調NRVCs 中心肌細胞肥大相關蛋白β-MHC、ACTA1 和ANP 的表達（P＜0.01），并可逆轉PE 誘導的NRVCs 肥大反應（P＜0.05），而過表達circMYO9A_006-ATG-mut沒有上述作用，見圖4C、D。

Figure 4. circMYO9A_006 inhibited the hypertrophic phenotype via translating MYO9A-208aa protein. A： sequence characteristics of empty vector， circMYO9A_006-flag， circMYO9A_006-ATG-mut and circMYO9A_006-ORF； B： the expression of MYO9A-208aa-flag protein in neonatal rat ventricular cardiomyocytes（NRVCs） detected by Western blot； C： overexpression of circMYO9A_006-flag and circMYO9A_006-ORF could consistently inhibit β-myosin heavy chain （β-MHC）， skeletal muscle actin alpha 1 （ACTA1） and atrial natriuretic peptide （ANP） expression in NRVCs； D： the morphological changes of NRVCs exposed to phenylephrine （PE） treatment were observed by Phalloidin-iFluor 647 staining， and the results showed that overexpression of circMYO9A_006-flag and circMYO9A_006-ORF could markedly reverse PE-induced increase in size of NRVCs （scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs vector group； #P＜0.05 vsvehicle+vector group； ＆P＜0.05 vsPE+vector group.圖4 circMYO9A_006通過翻譯MYO9A-208aa發揮抑制NRVCs肥大表型的作用

討 論

心肌肥大是一種對左心室壁應力升高的代償性心肌增厚反應[14-16］。隨著長期處于持續的壓力刺激，這種病理性心肌肥大會進一步加重演變成不可逆轉的心肌損傷[17］。在本研究中，我們證實circMYO9A_006具有抑制NMVCs和NRVCs中肥大相關蛋白表達的作用，以及抑制PE 誘導的NRVCs 肥大的作用，即circMYO9A_006具有抑制心肌細胞肥大的作用。

絕大多數circRNA 是由宿主基因的相關外顯子反向剪接環化構成[18-19］，雖然circRNA 通常要低于其線性宿主基因mRNA 的表達水平，但共價閉合的環狀結構可使其免于核酸內切酶的降解，導致其在體內半衰期通常較長，進而可能發揮更為持久的生物學功能[20］。近年來的研究證實一些circRNA 具有翻譯蛋白的能力[21-23］。由于circRNA 缺乏5′端帽子結構，故其翻譯主要依賴于潛在ORF 前短元件的m6A修飾或者IRES的驅動來實現[24］。

序列分析提示，circMYO9A_006具有2個潛在的IRES 序列。我們分別構建螢光素酶報告基因載體，并通過雙螢光素酶報告基因實驗來檢測證實2 個IRES 序列均具有介導核糖體與circMYO9A_006 結合，并啟動蛋白翻譯的能力。蛋白表達結果顯示，circMYO9A_006 可翻譯出蛋白MYO9A-208aa，且該蛋白主要定位于細胞質中。

為明確MYO9A-208aa 對心肌細胞肥大表型的調節作用，我們分別構建了編碼MYO9A-208aa 的ORF 表達載體和circMYO9A_006-ATG-mut 表達載體。功能實驗結果顯示，circMYO9A_006 和circ-MYO9A_006-ORF 均可表達MYO9A-208aa 蛋白，一致性地抑制心肌細胞肥大相關蛋白β-MHC、ACTA1和ANP 的表達，并可逆轉PE 誘導的NRVCs 肥大反應，而circMYO9A_006-ATG-mut 不具有上述作用。上述結果表明翻譯蛋白MYO9A-208aa 介導了circ-MYO9A_006對心肌細胞肥大的抑制作用。

借鑒游客感知價值測量相關研究，依據“Means-End”理論，參考我國《中華人民共和國旅游行業規范——旅游景區游客中心設置與服務規范》(LB/T011-2011)對于游客中心相關建設標準、臨安大峽谷村游客中心現狀，設計游客中心屬性層與結果層題項；參考KAHLE[23]的LOV價值觀列表，制定使用游客中心可能滿足的游客最終目的題項，量表指標來源如表1所示。設計訪談問卷如表2所示。

綜上所述，本研究證實了circMYO9A_006 通過其翻譯蛋白MYO9A-208aa 發揮抑制心肌細胞肥大的作用。在后續研究中，我們將在整體動物水平來明確circMYO9A_006 抑制心肌肥大的作用，闡明翻譯蛋白MYO9A-208aa 介導circMYO9A_006 發揮抑制心肌肥大作用的分子機制。