平胃膠囊對惡變后GES-1細胞氧化應激的抑制作用及機制研究*

王麗娟， 汪龍德， 牛小英， 汪 霞， 張瑞婷， 吳毓謙， 樊澤坤

（1甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000，2甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730020）

胃癌（gastric cancer， GC）是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例約為40 萬人，死亡病例約29.1 萬人[1］。胃癌前病變（precancerous lesion of gastric cancer， PLGC）是指胃黏膜從慢性炎癥階段，逐漸發展轉變至癌的過程，即Correa 模式：淺表性胃炎-萎縮性胃炎-腸上皮化生-異型增生[2］。據統計，PLGC 患者在隨訪后10 年內罹患GC 的風險顯著升高。因此，預防PLGC的發生發展對降低消化系統疾病癌變尤為重要。而研究顯示，PLGC 與氧化應激有著密切的聯系[3］。正常生理情況下，機體內活性氧（reactive oxygen species， ROS）的生成與清除處于動態平衡，適量的ROS對于人體殺滅病原菌，以及維持免疫功能等均有重要的生理意義。然而生物體細胞在遇到各種應激刺激時，會產生過多的ROS 導致體內生物大分子以及細胞結構發生氧化損傷以及炎癥反應進而使細胞發生癌變。研究表明，GC 患者血清及胃黏膜中ROS 增多，抗氧化酶活性降低[4-5］。盡管有胃黏膜為其提供了保護屏障，但攝入的食物和微生物病原體仍可誘導氧化損傷和胃腸道上皮細胞發生炎癥反應，最終導致DNA 的氧化損傷以及進一步的ROS蓄積和炎癥反應。開發具有抗氧化活性的藥物已成為PLGC 研究的目標和有效策略。臨床療效顯著的平胃膠囊（Pingwei capsule/Pingwei Jiaonang，PWJN）方中蒼術、柴胡、厚樸、延胡索、陳皮等藥物均具有不同程度的抗氧化作用[6-9］，這也為本實驗的開展提供了新的研究思路。因此，本研究采用亞硝酸胺類化合物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG）模擬生活環境和食物中N-亞硝胺的有害化學物質誘導GES-1 細胞發生氧化損傷[10-11］，觀察PWJN 對MNNG 誘導的GES-1細胞氧化損傷的作用，并探討其作用機制，為研究PWJN防治PLGC提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物及細胞

SPF 級SD 雄 性 大 鼠15 只，6～8 周 齡，體 質 量（200±20） g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心[動物合格證號為No.62001000000709；實驗動物使用許可證號為SYXK（甘）2020-0009；實驗動物生產許可證號為SCXK（甘）2020-0001］。本研究通過甘肅中醫藥大學大學倫理委員會審查，倫理編號為2022-701，飼養條件均已達標。GES-1 細胞購自上海富衡生物科技有限公司（貨號為FH0273）。

2 藥物與試劑

PWJN 為甘肅中醫藥大學附屬醫院院內制劑（批準文號：甘藥制字Z120022224；批號：20230201）；MNNG 購自上海麥克林生化科技有限公司；ROS 測定試劑盒和JC-10 線粒體膜電位熒光探針溶液均購自大連美侖生物技術有限公司；丙二醛（malondialdehyde， MDA）測定試劑盒購自江蘇麥莎實業有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測定試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase， GSH-Px）測定試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；Ki67 抗體購自BOSTER；白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）抗體和黑色素瘤分化相關基因7（melanoma differentiation-associated gene-7， MDA-7）抗體均購自BIOSS。

3 主要方法

3.1 含藥血清的制備 隨機將SD 大鼠分為PWJN組10 只，空白組5 只。按照人與動物體表面積折算等效劑量比值，PWJN 灌胃的大鼠使用PWJN 的等效劑量為：6.3×6 g/60 kg，得出大鼠PWJN 高劑量配比為48 g/L，每只大鼠給予2 mL PWJN 溶液進行灌胃，每日2次，空白組灌胃等量生理鹽水，每日2次，連續給藥3天，末次灌胃2 h后，3%戊巴比妥鈉5 mL/kg麻醉，腹主動脈取血，靜置2～3 h，離心分離血清，用一次性無菌濾器過濾備用；經56 ℃水浴中滅活處理30 min后，-80 ℃冰箱中保存備用。

3.2 細胞株培養模型制備及分組 GES-1細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。參照MNNG 誘導GES-1 細胞惡性轉化細胞模型的建立方法[12-13］，將MNNG 以20 μmol/L[14］濃度溶解在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）中，避光條件干預GES-1 細胞24 h。去除含有MNNG 的培養液，加入含10%胎牛血清的培養液。1周內可見大量細胞死亡脫落，期間正常換液，當殘存細胞生長至70%～80%時進行傳代并命名為MC細胞。

3.3 細胞分組及給藥 將細胞分為正常組、模型組、空白血清組和PWJN 含藥血清組。除正常組外，其余各組加入已配好的MNNG 工作液，正常組加入等劑量不完全DMEM 培養液繼續培養。最佳造模時間后棄去原培養液，PBS洗滌2次，PWJN含藥血清組加入已篩選的最佳濃度PWJN 含藥血清，空白血清組加入同等濃度的空白血清繼續培養24 h。

3.4 篩選PWJN含藥血清的最佳干預濃度及時間實驗分組：對照組（10%胎牛血清）、空白血清組（10%胎牛血清+10%空白血清）、10%含藥血清組（10%胎牛血清+10%含藥血清）、5%含藥血清組（10%胎牛血清+5%空白血清+5%含藥血清）、3.3%含藥血清組（10%胎牛血清+6.7%空白血清+3.3%含藥血清）、2.5%含藥血清組（10%胎牛血清+7.5%空白血清+2.5%含藥血清）、2%含藥血清組（10%胎牛血清+8%空白血清+2%含藥血清）、1.7%含藥血清組（10%胎牛血清+8.3%空白血清+1.7%含藥血清）、1.4%含藥血清組（10%胎牛血清+8.6%空白血清+1.4%含藥血清）和1.2%含藥血清組（10%胎牛血清+8.8%空白血清+1.2%含藥血清）。

當MC 細胞匯合度達到70%～80%時，制備單細胞懸液，96 孔板接種細胞，繼續培養12 h，棄去原培養液，按照設置組別分別配制相應的培養液，依次加入對應孔中，分別培養24、48 和72 h 后于每孔分別加入10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h，于酶標儀450 nm波長處讀取吸光度（A）。細胞活力（%）=A實驗組/A對照組×100%。

3.5 熒光探針DCFH-DA 檢測ROS 含量 PWJN 組用已篩選的最佳含藥血清預處理48 h，待各組細胞匯合度達到70%～80%時，加入1 mL 含有DCFH-DA 探針（10 μmol/L）的PBS，常溫孵育30 min，在激光共聚焦顯微鏡（Ex：488 nm，Em：525 nm）下進行觀察拍照。

3.6 ELISA 法測定MC 細胞中MDA 濃度 PWJN 組用已篩選的最佳含藥血清預處理48 h，待匯合度達到70%～80%時收集各組細胞，PBS 清洗，收集沉淀細胞，研磨破碎細胞后離心收集上清液，按照試劑說明書進行稀釋、加樣、洗滌，加酶標抗體，進行顯色、比色等操作。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的A值。

3.7 生化法檢測細胞中SOD和GSH-Px活性 PWJN組用已篩選的最佳含藥血清預處理48 h，待各組細胞匯合度達到70%～80%時收集各組細胞，PBS 清洗，離心收集細胞，研磨破碎后離心取上清液，按照試劑說明書進行檢測。

3.8 JC-10檢測MC細胞線粒體膜電位 PWJN組用已篩選的最佳含藥血清預處理48 h，待各組細胞匯合度達到70%～80%時，加入1 mL 培養液和1 mL JC-10染色工作液，充分混勻，37 ℃孵育30 min。配制JC-10染色緩沖液，放置冰浴。37 ℃孵育結束后，用JC-10染色緩沖液洗滌2次（冰浴），熒光顯微鏡觀察拍照。

3.9 實時熒光定量PCR 檢測細胞中Ki67 和MDA-7的mRNA 表達 收集細胞提取總RNA，用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。采用7500 real-time PCR 儀檢測，反應條件包括逆轉錄反應和逆轉錄酶失活反應，每個樣本重復6 孔。隨后采用2-ΔΔCt法計算mRNA 相對表達水平，用于PCR的特異性引物見表1。

3.10 Western blot 測定細胞中Ki67、MDA-7 和IL-6蛋白表達 細胞處理后棄去原培養液，PBS 清洗、刮取細胞、離心15 min 棄上清，加入300 μL RIPA 裂解液，混勻冰上裂解15 min，再次離心取上清，進行BCA蛋白定量及蛋白變性。經10% SDS-PAGE后，轉膜至PVDF 膜、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h、加入Ⅰ抗（Ki67、IL-6 和MDA-7 抗體，1∶1 000；內參照GAPDH抗體，1∶2 000），4 ℃過夜孵育，洗膜后Ⅱ抗（1∶4 000）孵育1 h，ECL發光定影，用ImageJ軟件分析灰度值。

4 統計學處理

采用SPSS 25.0 統計軟件分析數據。計量數據采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MC細胞模型驗證

1.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態 倒置顯微鏡下正常組GES-1 細胞形態規則，排列稀疏整齊，呈散在性生長，經MNNG 處理后，部分細胞死亡，殘存細胞形態不規則，外形模糊，排列零亂，呈“島樣”克隆樣生長，以梭形細胞環繞，胞漿內可見空泡，也可見多核巨大細胞，見圖1。

Figure 1. Inverted microscopic observation of cell morphology for model evaluation. A： GES-1 normal cells； B： GES-1 cells after 24 h of MNNG intervention； C： MC cells after modeling. After MNNG treatment， the morphology of GES-1 cells gradually becomes irregular， and some cells die. Image C shows that the remaining cell morphology is blurred， arranged disorderly，showing ＂island-like＂ clonal growth， clear boundaries between clones， spindle-shaped cells around， multinucleated giant cells， and vacuoles in the cytoplasm.圖1 倒置顯微鏡觀察細胞形態進行模型評價

1.2 免疫熒光法檢測促癌因子Ki67 表達水平 通過熒光染色顯微鏡觀察可見正常組GES-1 細胞中Ki67 幾乎不表達；與正常組相比，MC 模型組中Ki67表達顯著升高（P＜0.01），提示MC 細胞模型成功建立，見圖2。

2 PWJN 對MNNG 損傷的MC 細胞給藥濃度及時間篩選

篩選PWJN 含藥血清時間及濃度結果顯示，相對胎牛血清及空白血清，PWJN 含藥血清干預48 h時，不同濃度梯度對MC 細胞均具有抑制作用，故選用48 h 作為最佳干預時間；對比48 h 不同濃度含藥血清對MC 細胞抑制率，含藥血清呈劑量依賴性對MC 細胞具有抑制作用，當含藥血清體積分數為5%時對MC 細胞抑制率可達30%，故選用5%的含藥血清進行后續實驗，見表2。

表2 不同處理時間和濃度平胃膠囊含藥血清對MC細胞活力的影響Table 2. The effect of different treatment time and concentrations of Pingwei capsule-containing serum on the viability of MC cells（Mean±SD. n=3）

3 倒置顯微鏡下各組細胞形態學觀察

通過倒置顯微鏡進行細胞形態觀察，與正常組相比，模型組與空白血清組細胞形態不規則，排列零亂，細胞多呈“島樣”克隆樣生長，胞漿內可見空泡，并出現多核巨大細胞；與空白血清組相比，PWJN 組細胞形態逐漸規則，排列稀疏整齊，呈散在性生長，見圖3。

Figure 3. Morphological observation of the cells in each group under an inverted microscope. Compared with control group， the cells in model group showed irregular morphology and disordered arrangement， some cells exhibited ＂island-like＂ clonal growth，spindle-shaped cells and multinucleated giant cells were visible around， and vacuoles were observed in the cytoplasm.There was no significant change in cell morphology between model group and blank serum group. Compared with blank serum group， the cells in PWJN group gradually became regular， sparse， and orderly arranged， showing scattered growth.圖3 倒置顯微鏡細胞形態觀察

4 PWJN對MC細胞ROS含量的影響

活性氧熒光探檢測結果顯示，與正常組相比，模型組ROS 含量顯著增多（P＜0.01）；模型組與空白血清組中ROS 含量無顯著差異（P＞0.05）；與空白血清組相比，PWJN 組ROS 含量顯著減少（P＜0.01），見圖4。

Figure 4. Detection of intracellular ROS levels using the fluorescent probe. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs control group； **P＜0.01 vs blank serum group.圖4 熒光探針檢測細胞內ROS水平

5 PWJN對MC細胞MDA濃度的影響

本研究結果顯示，與正常組相比，模型組MDA濃度顯著升高（P＜0.01）；模型組與空白血清組無顯著差異（P＞0.05）；與空白血清組相比，PWJN 組MDA濃度顯著降低（P＜0.01），見圖5。

Figure 5. The MDA content. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs control group； **P＜0.01 vsblank serum group.圖5 MDA含量

6 PWJN 對MC 細胞SOD 活性和GSH-Px 含量的影響

本研究結果顯示，與正常組相比，模型組SOD、GSH-PX活性顯著降低（P＜0.01）；模型組與空白血清組中SOD、GSH-PX活性無顯著差異（P＞0.05）；與空白血清組相比，PWJN 組SOD 和GSH-Px 含量顯著升高（P＜0.01），見圖6。

Figure 6. The SOD activity and GSH-Px concentration. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs control group； **P＜0.01 vs blank serum group.圖6 SOD活性及GSH-Px濃度

7 PWJN對MC細胞線粒體膜電位的影響

新型熒光探針JC-10 標記細胞線粒體膜電位結果顯示，與正常組相比，模型組中綠色熒光顯著增多（P＜0.01），紅色熒光顯著減少（P＜0.01）；模型組與空白血清組線粒體膜電位無顯著差異（P＞0.05）；與空白血清組相比，PWJN 組綠色熒光顯著減少（P＜0.01），紅色熒光顯著增強（P＜0.01），見圖7。

Figure 7. Fluorescent probe JC-10 was used to detect the level of mitochondrial membrane potential. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs control group； **P＜0.01 vs blank serum group.圖7 熒光探針JC-10檢測細胞線粒體膜電位水平

8 PWJN 對MC 細 胞 中Ki67 和MDA-7 mRNA 表達的影響

本研究結果顯示，與正常組相比，MC 模型組Ki67 mRNA 表達顯著增高（P＜0.01），MDA-7 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；MC模型組與空白血清組中Ki67 和MDA-7 mRNA 表達無顯著差異（P＞0.05）；與空白血清組相比，PWJN 組Ki67 mRNA 表達顯著降低（P＜0.01），MDA-7 mRNA 表達顯著升高（P＜0.01），見圖8。

Figure 8. The mRNA expression levels of Ki67 and MDA-7 in the cells. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs control group； **P＜0.01 vs blank serum group.圖8 各組細胞中Ki67和MDA-7 mRNA表達水平

9 PWJN 對MC 細胞中Ki67、IL-6 和MDA-7 蛋白表達水平的影響

本研究檢測結果顯示，與正常組相比，MC 模型組Ki67 和IL-6 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），MDA-7蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；模型組與空白血清組中Ki67、IL-6 和MDA-7 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05）；與空白血清組相比，PWJN 組Ki67 和IL-6 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），MDA-7 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），見圖9。

Figure 9. The protein expression levels of Ki67， IL-6 and MDA-7 in the cells. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs control group； **P＜0.01 vsblank serum group.圖9 各組細胞中Ki67、IL-6和MDA-7蛋白表達水平

討 論

中醫學將PLGC 根據胃脘部痞塞不通、滿悶不舒、望之脹形、觸之無塊、壓之不痛等臨床特點，將其歸屬于“痞滿”“胃脘痛”“嘈雜”等范疇。其根本病機是脾胃受損導致脾胃虛弱，致使運化無力，納食不佳，脾不能升清，胃不能降濁，氣滯，濕熱停聚胃脘，久而化毒，瘀滯脈絡。PWJN 由蒼術、柴胡、厚樸、浙貝母、延胡索、枳殼、陳皮、木香、黃連、蒲公英、海螵蛸、赤芍、三棱、莪術、雞內金、白及共16 味藥組成，傳承了國醫大師周信有教授“復方多法、綜合運用、整體調節”的學術思想，在宋代《太平惠民和劑局方》平胃散的基礎上加減化裁而來，全方共奏疏肝理氣、燥濕健脾、和胃止痛、活血消滯之效。

研究顯示[15］經MNNG 誘導后的大鼠胃黏膜中ROS，MDA 等活性氧物質顯著表達。而ROS，MDA等活性氧物質不僅能改變細胞膜通透性，使細胞線粒體膜電位下降，還會引起炎癥因子的釋放。IL-6是一種多功能促炎細胞因子[16］，在機體炎癥感染、促進腫瘤發生發展中發揮作用，Ki67 作為一種敏感又特異的腫瘤細胞標志物，常用于衡量腫瘤細胞的增殖，評價其生物學行為[17］。促癌因子MDA-7 作為腫瘤抑制基因，在多種腫瘤組織中呈現低表達狀態，對人類多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用[18］，尤其對人SGC7901胃癌細胞系具有較強的抑制作用[19］。

本研究通過MNNG 誘導GES-1 細胞使細胞內氧化-還原反應速率失衡，使細胞發生了氧化損傷。從細胞形態看，經MNNG 誘導破壞了原有細胞的正常細胞形態，加速了增殖，使細胞出現了一系列類似腫瘤細胞的特性，經PWJN 干預能明顯修復被破壞的細胞形態，抑制其增殖；氧化損傷后的細胞內不僅ROS、MDA 濃度顯著升高，而且抗氧化酶SOD、GSHPX活性顯著降低，經PWJN 干預能顯著提高SOD、GSH-PX活性，而高濃度的ROS和MDA 能得到有效抑制；經MNNG 誘導也加速了炎癥因子IL-6 和促癌因子Ki67 的釋放，而抑癌因子MDA-7 明顯被抑制，經PWJN 干預又能促進抑癌基因MDA-7 的表達，且抑制IL-6 和Ki67 的釋放。因此推測，PWJN 可能通過增強細胞內抗氧化酶活性，提高細胞抗氧化能力，進而降低活性氧物質的生成以及大量活性氧物質引起的炎癥和癌變損傷，體現了中藥調節細胞內環境，恢復機體平衡狀態而防治疾病的作用機制。

綜上所述，本研究證實了PWJN 可以有效抑制胃黏膜上皮細胞的氧化損傷，保護細胞正常功能。其作用機制可能與上調SOD、GSH-PX抗氧化酶活性，下調IL-6 和Ki67 的表達，促進抑癌因子MDA-7 的釋放，減緩胃黏膜細胞的惡性癌變有關。但中藥復方是通過多途徑、多靶而發揮治療作用，PWJN 中藥味較多，具體是哪幾味藥的哪些成分通過調控氧化-抗氧化平衡而起到治療作用尚不明確，在今后的研究中課題組將進一步明確該方的有效成分及有效部位群，并增加細胞系或小分子抑制劑作為陽性對照進行深入研究，以明確PWJN 治療PLGC 的具體作用機制。