針刺足三里對CFA大鼠尾殼核中A1R/cAMP/p-CREB信號通路的影響*

張慶祥， 周萌萌， 霍明珠， 常洪恩， 司雨欣， 張祐霖， 房鈺鑫

（天津中醫藥大學針灸推拿學院，天津中醫藥大學實驗針灸學研究中心，天津 301600）

炎性疼痛是全世界所面臨的嚴重健康問題之一，廣泛存在于各種急慢性疾病中[1］。紅腫、發熱、疼痛和功能喪失是炎癥的主要癥狀。其臨床特征包括疼痛閾值降低、疼痛反應增強和自發性疼痛[2］。這通常是由于組織損傷導致P 物質、組胺和前列腺素E9等炎癥介質釋放，進而激活免疫細胞釋放各種促炎因子。外周傷害感受器細胞由促炎因子誘導產生動作電位，最終導致疼痛[3］。在治療中通常選用阿片類藥物和非類固醇抗炎藥，但副作用和耐藥性的問題使得人們不得不尋找其他更安全的治療方式[4］。針灸作為在中國傳承了近5 000 年歷史的治療方式，具有安全、廉價、副作用小等優點，而且其對疼痛的治療逐漸被國際社會所接受。針刺鎮痛本質上是痛覺區域和不同穴位的痛覺信號與中樞神經系統的痛覺通路相互作用的結果[5］。盡管針刺鎮痛療效確切[6-9］，但作用機制尚未被完全闡明。

腺苷是一種內源性神經遞質，在哺乳動物中樞神經系統中廣泛分布，其在傷害性感受過程中的抗傷害作用主要是由腺苷A1 受體（adenosine A1 receptor， A1R）的激活所引起的[10］。Goldman 等[11］也報道了針灸能夠提升小鼠穴位局部的腺苷水平并激活A1R 從而起到抗傷害作用。研究表明，A1R 可與Gi蛋白偶聯，抑制腺苷酸環化酶和下游環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）的積累[12］，防止cAMP 反應元件結合蛋白（cAMP response elementbinding protein， CREB）被磷酸化，以產生鎮痛作用[13］。尾殼核（caudate putamen， CPu）位于基底神經節，由尾狀核與殼核組成。CPu 連接丘腦和大腦皮層，除了參與學習、記憶、情感、感覺運動整合和之外，其在疼痛調節中的重要作用也逐漸被重視[14］。研究表明，針刺可以通過調節大鼠CPu 腦區中的神經遞質來緩解疼痛[15］。由此，我們在確定針刺在治療完全弗氏佐劑（complete Freud's adjuvant， CFA）所致炎性疼痛有效的基礎上，以大鼠CPu 腦區的A1R為其切入點，以蛋白免疫印跡（Western blot）、實時熒光定量PCR、ELISA 和免疫熒光染色驗證針刺對大鼠CPu中A1R、cAMP和CREB表達的影響，進一步通過使用A1R拮抗劑和激動劑探討調控A1R對其相關通路介導針刺鎮痛的影響，為探究大鼠CPu 中A1R介導針刺鎮痛機制、進一步尋找到治療炎癥性疼痛的靶點提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF 級健康Wistar 大鼠64 只，雄性，6～8 周齡，體重為（200±20） g，由北京維通利華公司提供[許可證號：SCXK（京）2016-0006］，飼養條件：12 h明暗交替，室溫（23±2） ℃，濕度50%左右，基礎飼料，自由攝食飲水。適應性喂養3 d。實驗過程中對動物的處理均遵照中華人民共和國科技部2006 年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，且動物使用協議和動物處理程序獲得了天津中醫藥大學實驗動物管理與使用委員會的批準（No. TCM-LAEC2022091）。

2 主要試劑及儀器

PKA、p-PKA 和CREB 兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；A1R 和p-CREB 兔 多 克 隆 抗 體（Abcam）；tubulin 和GAPDH 兔多克隆抗體（上海愛必信生物科技有限公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、A1R 激動劑2-氯-N6-環戊基腺苷（2-chloro-N6-cyclopentyladenosine， CCPA）和A1R拮抗劑8-環戊基-1，3-二丙基黃嘌呤（8-cyclopentyl-1，3-dipropylxanthine， DPCPX）均購自Sigma；HRP 標記的羊抗兔IgG（Thermo Fisher）；BCA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；ELISA 試劑盒（SBJ-R0140；南京森貝伽生物科技有限公司）；E. Z. N. A. Total RNA Kit（Omega Bio-Tek）；反轉錄反應試劑（TaKa-Ra）；Cy3 標記的山羊抗兔IgG、檸檬酸（pH 6.0）抗原修復液、EDTA（pH 9.0）抗原修復液、EDTA（pH 8.0）抗原修復液和組織自發熒光淬滅劑（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

漢醫牌一次性無菌針灸針（北京漢醫醫療器械有限責任公司）；熱輻射痛測定儀（中國醫學科學院生物醫學工程研究所）；腦立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；CMA402 雙通道微量注射泵（北京銘泰佳信科技有限公司）；1.0 mL 自動進樣針（SHIMADZU）；Epoch2 酶標儀（BioTek）；電泳儀、電泳槽、轉膜儀和PVDF 膜（Bio-Rad）；超靈敏多功能成像儀（GE Healthcare）。

3 主要方法

3.1 動物造模及分組 大鼠采用隨機數字法隨機分為鹽水（saline）組、模型組（CFA 組）、CFA+手針針刺（manual acupuncture， MA）組、CFA+溶劑（DMSO）組、CFA+A1R 激動劑（CCPA）組、CFA+A1R 拮抗劑（DPCPX）組、CFA+MA+DMSO 組和CFA+MA+DPCPX組，每組8 只。造模方法參照團隊前期建立的MA 治療佐劑性關節炎疼痛模型效應平臺[16］。CFA 組、CFA+MA 組、CFA+DMSO 組、CFA+CCPA 組、CFA+DPCPX 組、CFA+MA+DMSO 組 和CFA+MA+DPCPX組大鼠右側后足底正中皮下注射0.1 mL CFA，建立大鼠炎性疼痛模型；saline 組大鼠僅在相同位置注射等體積的0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

3.2 CPu 腦區埋置套管 CFA+DMSO、CFA+CCPA、CFA+DPCPX、CFA+MA+DMSO 和CFA+MA+DPCPX組大鼠適應環境7 d 后，于造模前5 d 進行CPu 腦區埋置套管術。具體方法如下：首先將大鼠稱重，根據體重用10%的水合氯醛（3.5 mL/kg）進行腹腔注射以麻醉大鼠。將大鼠頭顱頂部常規消毒去毛備皮，沿大鼠頭頂正中線，縱向切開大鼠頭皮，用眼科剪挑剪皮下筋膜，適當鈍性分離，充分暴露骨膜，可見十字形骨型結構，即大鼠前囟門。隨即調節腦立體定位儀刻度，將零點調整到大鼠前囟門處。按大鼠腦立體定位圖譜調節指針，向左或向右旁開3 mm，在此處用記號筆作一標記，在所標記處用牙科鉆頭鉆孔，將顱骨鉆透且不能傷及腦實質，用加持器將套管緩慢插入孔中，深度為顱骨下5 mm。置管術后肌肉注射青霉素并單籠飼養。術后待大鼠活動自如后，進行CFA造模及后續實驗。

3.3 針刺干預 對CFA+MA、CFA+MA+DMSO 和CFA+MA+DPCPX 組大鼠予以針刺雙側足三里，參照中國針灸學會發布的《實驗動物常用穴位名稱與定位 第2 部分：大鼠》[17］中大鼠標準穴位圖譜定位，足三里穴位于膝關節后外側，在腓骨小頭下約3 mm處。針刺具體操作參照團隊前期建立的MA 治療佐劑性關節炎疼痛模型效應平臺[16］。針刺前，采用自制鼠衣和透明膠帶將大鼠固定于桌上。進針深度為5 mm，施行平補平瀉捻轉手法行針2 min，頻率為180 min-1，每間隔5 min 行針1 次，共4 次，每天1 次，連續7 d。其余saline、CFA、CFA+DMSO、CFA+CCPA和CFA+DPCPX各組大鼠僅給予抓取、固定。

3.4 大鼠痛覺敏感性的測定 采用足底測痛儀測定大鼠右后足對熱刺激的縮足潛伏期。將大鼠放入熱輻射痛測定儀上方的透明格子中，適應30 min 后開始測量，為防止動物燙傷，將熱輻射的最長時間設定為30 s，每只動物重復測量3 次，每次間隔5 min，取平均值。

3.5 取材及樣本處理 針刺第7 天測完熱痛，異氟烷持續性吸入麻醉后，斷頭取腦，用自制腦核團取材器械挖取雙側CPu 腦組織，一半置于標記好的凍存管中液氮凍存，用于蛋白質印跡檢測，剩余部分用于ELISA 檢測；saline 組、CFA 組和CFA+MA 組每組取4只大鼠經左心室灌注4%多聚甲醛固定，冰上快速斷頭取腦，完整剝離腦組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后依次置于20%、30%蔗糖溶液脫水，石蠟包埋，切片（厚度為3 μm），用于免疫熒光檢測。

3.6 ELISA 法檢測大鼠CPu 中cAMP 含量 按大鼠cAMP ELISA 試劑盒說明書操作，設置標準孔，按10倍稀釋樣本，37 ℃溫育1 h，用洗滌緩沖液洗滌10次，加入顯色液，37 ℃下避光15 min，加入停止液后采用酶標儀在450 nm 波長下檢測吸光度，以標準曲線計算cAMP含量。

3.7 Western blot 法檢測PKA 和CREB 的蛋白表達及磷酸化水平 將組織在裂解液（VRIPA∶VPMSF=100∶1）中勻漿，采用BCA法測定蛋白濃度，根據蛋白濃度確定上樣量。100 °C 加熱變性后加入蛋白樣品進行電泳，電泳后轉印至PVDF 膜。室溫條件下5%脫脂奶粉封閉2 h，再加入Ⅰ抗（PKA、p-PKA、CREB 和p-CREB 抗體，1∶1 000；tubulin 抗體，1∶20 000；GAPDH抗體，1∶10 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗滌10 min×3次后，加入Ⅱ抗（1∶10 000）孵育1 h，TBST 洗滌10 min×3次。ECL 化學發光顯色，通過內置分析軟件處理圖像并計算條帶的灰度值。

3.8 實時熒光定量PCR 檢測大鼠CPu 腦區A1R 的mRNA 表達 取30 mg 腦組織，Trizol 法提取總RNA。將提取的RNA 反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板定量擴增A1R 和內參照β-actin。反應程序：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環；95 ℃15 s。用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1. Primer Sequences

3.9 免疫熒光染色檢測大鼠CPu 腦區A1R 的表達情況 4%多聚甲醛固定24 小時，包埋，切片，封閉30 min后，滴加濃度為1∶2 000的A1R抗體，于4 ℃濕盒中孵育過夜，滴加Ⅱ抗，室溫孵育50 min，經PBS清洗后，采用熒光顯微鏡觀察染色結果。每張切片隨機選取3 個區域，分析A1R 和DAPI 雙標記陽性細胞占DAPI陽性細胞的百分比。

4 統計學處理

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。實驗數據用均數±標準誤（mean±SEM）的形式表示。符合正態分布的數據，組間比較選擇單因素方差分析，各組間兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3 檢驗；不符合正態分布的數據則選擇非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠足底熱輻射痛閾值的比較

與saline 組比較，CFA 造模能顯著降低大鼠熱痛閾值（P＜0.01）；與CFA組比較，CFA+MA組大鼠從第2天到第7天足底熱輻射痛閾值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖1。

Figure 1. Comparison of paw withdrawl latency at different time points in rats of each group. Mean±SEM. n=8. **P＜0.01 vs saline group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs CFA group.圖1 各組大鼠不同時點足底熱輻射痛閾值的比較

2 各組大鼠CPu 腦區A1R 的蛋白和mRNA 表達量及A1R陽性細胞比例的比較

與saline 組和CFA 組比較，CFA+MA 組大鼠A1R蛋白表達量和陽性細胞比例均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與saline 組 比 較，CFA 組 和CFA+MA 組A1R mRNA表達量顯著升高（P＜0.01），見圖2、3。

Figure 2. Comparison of the protein （A） and mRNA （B） expression of A1R in the CPu of the rats in each group.Mean±SEM. n=7～8. *P＜0.05， **P＜0.01 vs saline group； #P＜0.05 vs CFA group.圖2 各組大鼠CPu腦區A1R蛋白和mRNA表達量比較

Figure 3. Immunofluorescence staining of A1R in rat CPu （scale bar=50 μm） and comparison of A1R positive expression in each group. Mean±SEM. n=4. **P＜0.01 vs saline group； ##P＜0.01 vsmodel group.圖3 各組大鼠CPu腦區A1R免疫熒光染色及陽性表達的比較

3 各組大鼠CPu 腦區cAMP 含量及CREB 和p-CREB蛋白水平的比較

與saline 組 比 較，CFA+MA 組 大 鼠CPu 腦 區cAMP含量顯著減少（P＜0.05）；與saline組比較，CFA組和CFA+MA 組大鼠CPu 腦區CREB 和p-CREB 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Comparison of cAMP content （A）， and CREB （B） and p-CREBP （C） protein levels in the CPu of rats in each group.Mean±SEM. n=8. *P＜0.05 vs saline group.圖4 各組大鼠CPu腦區cAMP含量及CREB和p-CREB蛋白水平的比較

4 調控CPu 腦區A1R 后各組大鼠足底熱輻射痛閾值的比較

與CFA+DMSO 組相比，CFA+MA+DMSO 組大鼠從第1 天到第7 天熱痛閾值均顯著升高（P＜0.01），CFA+CCPA 組第1、2、3、6 和7 天熱痛閾值顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；與CFA+MA+DMSO 組比較，CFA+MA+DPCPX 組大鼠從第1 天到第7 天熱痛閾值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。

Figure 5. Paw withdrawl latency of rats at different time points after regulation of A1R in the CPu. Mean±SEM. n=7～8.*P＜0.05， **P＜0.01 vs CFA+DMSO group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vsCFA+MA+DMSO group.圖5 調控CPu 腦區A1R 后各組大鼠不同時點足底熱輻射痛閾值的比較

5 調控CPu 腦區A1R 后各組大鼠cAMP 含量及PKA、p-PKA、CREB和p-CREB蛋白水平的比較

與CFA+DMSO 組比較，CFA+MA+DMSO 組大鼠CPu 腦區cAMP 含量顯著減少（P＜0.01），p-CREB 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），CFA+CCPA 組大鼠CPu腦區cAMP 含量顯著增加（P＜0.05）；與CFA+MA+DMSO 組 比 較，CFA+MA+DPCPX 組 大 鼠CPu 腦 區cAMP 含量顯著增加（P＜0.01），p-PKA 和p-CREB 蛋白水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖6。

Figure 6. Comparison of cAMP content （A）， and PKA （B）， p-PKA （C）， CREB （D） and p-CREB（E） protein levels in the CPu of rats after regulation of A1R. Mean±SEM. n=7～8. **P＜0.01 vs CFA+DMSO group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vsCFA+MA+DMSO group.圖6 調控CPu腦區A1R后各組大鼠CPu腦區cAMP含量及PKA、p-PKA、CREB和p-CREB蛋白水平的比較

討 論

目前，針刺已廣泛應用于疼痛相關疾病的治療，且治療效果顯著[11，18-19］。研究顯示，在針刺治療炎性痛的相關研究中足三里使用頻率較高[20］，這或許是因為中醫認為疼痛的病機為“不通則痛”及“不榮則痛”，而足三里穴為足陽明胃經的合穴，陽明經為多氣多血之經，選取足三里可以達到疏通經脈、調和氣血、理氣止痛等作用。足三里穴位作為針刺鎮痛的常用穴位，可以激活腦干、丘腦、下丘腦等腦區的內源性疼痛調控系統，釋放內啡肽、腦啡肽等內源性鎮痛物質，從而達到鎮痛的效果[21-22］。雖然針刺鎮痛已經在臨床實踐中得到了充分的證明，但對其科學機理的闡釋仍不充分。因此，闡明其作用機理對針刺鎮痛的研究至關重要。

針刺能夠通過提高局部腺苷含量激活A1R，并在針刺鎮痛中發揮重要作用[10-11］。在本研究中觀察到，CFA 造模后大鼠足底熱輻射痛閾值顯著降低，而針刺干預提升了CFA 大鼠的熱輻射痛閾值，且針刺后CFA 大鼠CPu 腦區中的A1R 蛋白和mRNA 表達量，以及A1R 陽性的神經元增多，這證明針刺可通過上調大鼠CPu 腦區A1R 起到鎮痛作用。作為其下游重要的信號通路之一，cAMP-PKA-CREB 信號通路已被證實在記憶形成、疼痛調節和不同疾病中扮演著重要角色[23-25］。而針刺可以通過抑制cAMP-PKACREB 的活化產生鎮痛效應[26-27］。研究顯示，慢性疼痛與神經元突觸可塑性有關，cAMP 作為機體的第二信使，參與不同的學習過程和突觸可塑性[28-29］。PKA是cAMP 的主要靶標，當cAMP 在細胞中增加時，PKA 的cAMP 結合調節亞基從PKA 的催化亞基中釋放出來，并允許磷酸化其底物[30］。作為cAMP的另一重要靶點蛋白激酶C（protein kinase C， PKC）也被證明在炎癥引起的傷害感受器致敏中起重要作用[31］。而且，cAMP 到PKC 的信號傳導并不涉及PKA，而是從PKA 上游分支以激活PKC[32］。CREB 家族蛋白是表征良好的PKA 底物，CREB 活化的中心環節就是Ser133 位點的磷酸化，CREB 的激活也與疼痛有關[33-34］。這是因為PKA 和其他激酶如MEK 和MSK磷酸化，并作為轉錄激活劑來調控疼痛[35-36］。此外，PKC 也可以做為上游分子激活CREB[37］。在本研究中，我們觀察到cAMP、CREB 和p-CREB 水平在針刺后降低，而PKA 未觀察到明顯變化，或許是通過cAMP 下游的PKC 通路介導了鎮痛效應。為了進一步驗證A1R 通過cAMP-CREB 信號通路介導針刺鎮痛效應，我們對大鼠側腦室注射A1R 拮抗劑DPCPX和激動劑CCPA。結果顯示，A1R 拮抗劑的使用逆轉了針刺干預后CFA 大鼠痛閾值的升高，以及針刺對cAMP 和p-CREB 的抑制作用；而A1R 激動劑CCPA的使用同針刺一樣提升了CFA 大鼠的熱輻射痛閾值，并對cAMP 和p-CREB 水平產生了和針刺相符合的趨勢。這意味著A1R 處于cAMP/p-CREB 通路的上游，A1R/cAMP/p-CREB 可能介導炎性疼痛的發生和發展，針刺可以調控這一通路來減輕疼痛。

綜上所述，針刺足三里可以緩解CFA 誘導的炎性疼痛，其機制與A1R/cAMP/p-CREB 信號通路有關。針刺可上調大鼠CPu 腦區中的A1R，從而抑制cAMP/p-CREB 信號通路，這可能是針刺減輕CFA 大鼠炎性疼痛的機制之一。