小續命湯對OGD/R誘導HT22細胞損傷后突觸可塑性的影響*

王漫漫， 蘭 瑞， 張 勇， 付雪琴， 鄒旭歡， 王瑋瑋，李泓宇， 唐 琛， 劉 雙

（1河南中醫藥大學第一臨床醫學院， 河南 鄭州 450046；2河南中醫藥大學第一附屬醫院腦病中心，河南 鄭州 450099；3鄭州大學第三附屬醫院中醫科， 河南 鄭州 450052）

腦卒中是全球范圍內的第三大死因[1］，已給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[2］。缺血性腦卒中是一種由于腦血管閉塞、腦部供血減少造成神經功能障礙的中樞神經系統疾病[3］。許多神經保護劑在基礎實驗研究中表現出有益的作用，但均未在臨床試驗取得成功，而臨床應用的溶栓藥物及手術治療因窗口狹窄及副作用大等原因，僅有少數病人能夠得到及時的救治及處理[4-5］。因此，開發新的缺血性腦卒中治療藥物及方法是當務之急。

神經元主要以電信號的形式處理和傳遞信息，并通過功能單位突觸與其他神經元連接形成大量的神經網絡[6］。缺血性腦卒中后梗塞組織中神經細胞的變性及死亡導致機體神經功能喪失[7］。外部刺激后激活整個大腦中的神經元導致突觸的結構/功能改變，稱為突觸可塑性[8］。后者可以編碼和存儲信息，有助于學習和記憶等認知功能。因此，促進突觸可塑性可改善缺血性卒中后認知和運動功能的恢復，為治療缺血性腦卒中的有效方法[9-10］。

小續命湯（Xiaoxuming decoction， XXMD）是我國的傳統方劑，具有祛風通絡、活血化瘀的功效[11］。前期研究顯示，小續命湯可以通過減少線粒體自噬的激活、改善線粒體功能、預防血腦屏障破壞、神經損傷和抗凋亡等作用而減輕缺血性腦卒中損傷[12-14］。本研究通過建立體外腦缺血再灌注損傷（ischemiareperfusion injury， IRI）模型，將小鼠海馬神經元細胞系進行氧糖剝奪/復氧（oxygen glucose deprivation/reoxygenation， OGD/R）處理，CCK-8 法檢測細胞生存率，選取小續命湯最佳治療濃度。同時觀察細胞形態、炎癥因子及超微結構變化，并檢測突觸相關蛋白神經絲200（neurofilament 200， NF200）和微管相關蛋白2（microtubule associated protein 2， MAP2）的熒光強度及表達水平，為XXMD 緩解腦缺血再灌注損傷提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 試劑與材料

XXMD 相關中藥顆粒購自河南中醫藥大學第一附屬醫院（中國新綠藥科技發展有限公司）；小鼠海馬神經元細胞系（220825）購自河南省工業微生物菌種工程技術研究中心。DMEM 高糖培養基（C3110）、胎牛 血清（C04001）購 自BI；DMEM 無 糖培 養基（D6540）、CCK-8 試劑盒（CA1210）、電鏡固定液（P1126）購自北京索萊寶生物科技有限公司；IL-1β（EK301B/3-96） ELISA 試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；IL-6 （88-50625-88）、TNF-α（88-7340-88） ELISA 試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；BCA 蛋白測定試劑盒（092721211228）購自上海碧云天公 司；破膜液（G1204）、DAPI 染色試劑（G1012）、NeuN（GB11138）、Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔IgG （GB25303）、Cy3 標記的山羊抗兔IgG（GB21303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；MAP2 （GTX133109）購自GeneTex；NF200 （18934-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG （AB205718）購自Abcam。

2 實驗儀器

超凈工作臺（ECO 0.9）和CO2細胞培養箱（371）購自Thermo；細胞缺氧小室（MIC-101）購自Billups-RothenbergInc；凝膠電泳儀（041BR304570）和化學發光凝膠成像儀（GelDoc XR）購自Bio-Rad；倒置熒光顯微鏡（Ti-E）購自Nikon；酶標儀（Synergy H1 型）購自BioTek。

3 中藥及抑制劑的制備

將XXMD 顆粒溶于PBS，多次離心取上清，經0.22 μm 針式無菌過濾器過濾后，調整最終濃度為50 g/L。

4 細胞培養

將HT22 細胞從-80 ℃冰箱取出后，快速溶解并加入2 mL 含10% FBS 的高糖DMEM，1 000×g離心5 min，棄上清，再次加入高糖DMEM 置于37 ℃、5%CO2環境中培養，待長至約80%時進行傳代，第5 代細胞開始用于造模。

5 主要實驗方法

5.1 氧糖剝奪/復氧模型的構建 將細胞按照每孔1×105均勻鋪至12 孔板培養24 h。XXMD 分別按照0、25、50、100、200 mg/L 的濃度溶解于無糖培養基中，每孔加入含不同濃度XXMD無糖培養基1 mL，放入含95% N2、1% O2、4% CO2的缺氧小室中缺氧3 h，再更換為含有不同XXMD 濃度高糖完全培養基于5% CO2、37 ℃環境中復氧24 h。正常組細胞常規培養至其他組復氧結束。

5.2 CCK-8 檢測細胞活力 將細胞以每孔1×104個細胞的密度接種在96孔板中24 h。復氧結束后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育0.5 h。取出96 孔板，在450 nm 處測量吸光度（A）值。細胞活力計算如下：細胞活力（%）=（實驗組A值/空白組A值）×100%。

5.3 倒置熒光顯微鏡觀察 將復氧24 h 后的HT22細胞置于倒置熒光顯微鏡下，觀察各組細胞形態變化，拍照。

5.4 ELISA 收集各組HT22細胞，加入PBS進行勻漿，12 000 ×g，離心5 min，棄沉淀，采用ELISA 試劑盒檢測細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

5.5 透射電鏡 將各組細胞使用PBS 沖洗3 次后，加入電鏡固定液常溫固定5 min，用細胞刮刀沿一個方向輕輕刮取，將細胞液吸至離心管，1 000 ×g，離心5 min。棄上清，再次加入1 mL 電鏡固定液，送至武漢賽維爾科技有限公司進行拍照。

5.6 免疫熒光染色 將各組細胞使用PBS沖洗3次后，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS 沖洗2 次，取出細胞爬片，加70 μL破膜工作液，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次5 min。血清封閉30 min，加入NeuN或突觸及通路相關蛋白4 ℃孵育過夜，PBS 清洗3次，加入Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG、CY3 標記山羊抗兔IgG 室溫孵育50 min。PBS 洗滌3 次，滴加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?，最后進行圖像采集。

5.7 Western blot 將各組細胞用PBS 沖洗3 次后，刮取細胞，離心棄上清，加入80 μL RIPA 冰上裂解1 h，BCA 定量后加入4×Buffer，上樣后1×SDS 150V 1 h，240 mA轉膜1.5 h，5%奶粉分封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃過夜，TBST 5 min 6次，Ⅱ抗孵育1 h，洗膜顯影。

6 統計學處理

使用SPSS 23.0 進行統計學分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示。符合正態分布后使用單因素方差分析（one way-ANOVA）進行統計學分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 不同濃度的XXMD 對OGD/R 后HT22細胞活力的影響

通過CCK-8 測定各組HT22 細胞活力，初步探討了XXMD 對OGD/R 作用下的HT22 細胞的保護作用，并篩選出最佳作用濃度。HT22 細胞在相同的OGD/R 條件下，不同濃度（25 mg/L、50 mg/L、 100 mg/L、200 mg/L）XXMD干預后，與未干預時相比，細胞活力均有不同程度的提高，其中XXMD 濃度為100 mg/L 細胞活力達到最高，作用效果最佳（P＜0.05），見圖1。因此選取100 mg/L的濃度用于以下實驗。

Figure 1. The viability of HT22 cells in each group. Mean±SD.n=3. *P＜0.05 vs0 mg/L XXMD group.圖1 各組HT22細胞活力

2 XXMD對OGD/R HT22細胞形態的影響

倒置熒光顯微鏡觀察結果顯示，對照組細胞密度較大，胞體完整呈扁平樣長梭形，折光性較強；經OGD/R 處理后，細胞形態破環嚴重，出現變圓、皺縮，突觸間連接數量減少；OGD/R+XXMD 組在復氧結束后表現為出與空白組細胞相似的形態特征，突觸連接交織呈網狀。見圖2。

Figure 2. Morphological changes of HT22 cells in each group （scale bar=200 μm）.圖2 各組HT22細胞形態變化

3 HT22細胞上清液炎癥因子水平變化

通過ELISA 測定HT22 細胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，探討了XXMD 對OGD/R 誘導的神經炎癥的保護作用，見圖3。與對照組相比，OGD/R 處理后炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 平均水平分別從142.58 ng/L、69.86 ng/L、217.98 ng/L 顯著升高至377.43 ng/L、211.72 ng/L、644.54 ng/L （P＜0.05）。而XXMD 干預后，與模型組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α平均水平顯著下降至244.61 ng/L、135.01 ng/L、386.67 ng/L （P＜0.05）。

Figure 3. The levels of inflammatory factors in HT22 cells of each group. Mean±SD. *P＜0.05 vs Control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.圖3 各組HT22細胞炎癥因子水平

4 透射電鏡觀察細胞超微結構變化

透射電鏡觀察：對照組線粒體邊界及結構清晰，基質均勻，嵴排列整齊，未見明顯的腫脹變化。模型組HT22 細胞線粒體結構模糊，水腫，部分線粒體嵴斷裂、減少，呈空泡樣改變；溶酶體及自噬體數量異常。高濃度XXMD 處理組線粒體結構有所改善，受損傷線粒體數量及自噬體較模型組減少。見圖4。

5 免疫熒光染色檢測細胞突觸相關蛋白的熒光強度

結果顯示，與對照組相比，OGD/R 損傷后的HT22 細胞神經元標志物NeuN 陽性細胞較少，且NeuN 及突觸相關蛋白NF200、MAP2 的平均熒光強度明顯降低 （P＜0.05）；而XXMD 可以提高損傷細胞中NeuN 陽性細胞數量，顯著提升NeuN、NF200 及MAP2平均熒光強度（P＜0.05），見圖5、圖6。

Figure 5. The NF200 fluorescence level detected by immunofluorescence staining. The NeuN （green） and NF200 （red） were determined by double immunofluorescence staining （scale bar=50 μm， zoom scale bar=10 μm）， and quantitative analysis of mean fluorescence intensity of NeuN and NF20 was shown. Blue： DAPI. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.圖5 免疫熒光染色檢測NF200熒光水平

Figure 6. The MAP2 fluorescence level detected by immunofluorescence staining. The NeuN（green） and MAP2（red） were determined by double immunofluorescence staining （scale bar=50 μm， zoom scale bar=10 μm）， and quantitative analysis of mean fluorescence intensity of NeuN and MAP was shown. Blue： DAPI. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.圖6 免疫熒光染色檢測MAP2熒光水平

6 Western blot檢測細胞突觸相關蛋白表達水平

Western blot 檢測各組細胞突觸相關蛋白NF200、MAP2 的表達。與對照組相比，NF200、MAP2蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.05）；高濃度XXMD干預后NF200、MAP2 蛋白的表達量均顯著高于模型組 （P＜0.05），見圖7。

Figure 7. The levels of synapse-associated proteins NF200 and MAP2 detected by Weston blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs OGD/R group.圖7 Western blot檢測各組突觸相關蛋白NF200和MAP2水平

討 論

腦卒中是人類嚴重、長期殘疾的主要原因之一。腦卒中可分為兩種不同類型：缺血性中風和出血性中風，其中缺血性腦卒中占87%左右[15］。當發生局灶性缺血性中風時，缺血核心區的腦血流量低于正常的20%。腦灌注量減少會限制葡萄糖和氧氣的輸送，損害離子梯度所需的能量，并導致神經膠質和神經元膜電位的喪失[16］。缺血半暗帶區域保留了部分能量代謝及結構完整性，但功能喪失或受損。核心區的細胞可能經歷著永久性缺氧去極化，而缺血半暗帶的細胞需要更多能量復極化。但由于持續的興奮性毒性、炎癥和細胞凋亡，缺血半暗帶區域可能進展為梗死核心，挽救缺血半暗帶成為神經保護的目標之一[16］。在過去20 年中，缺血性腦卒中死亡率迅速下降，但由于缺乏有效治療手段，缺血性腦卒中后的殘疾人數卻逐步增加。因此，缺血性腦卒中的預防和治療亟待進一步研究。

XXMD 作為治療缺血性腦卒中的經典名方，為歷代醫家所推崇[17］?，F代醫學研究表明，XXMD 能夠擴大腦組織供血量，降低毛細血管的通透性，抗炎抗凋亡及調節自噬等方面均具有保護神經細胞、促進恢復神經功能的作用[13-14，18-19］。Liu 等[20］報道了XXMD 可以通過抑制AGE-RAGE 信號通路，下調HMGB1、TLR4 和p-p65 的表達，減輕炎癥因子的釋放和中性粒細胞浸潤，從而改善神經炎癥。Wu 等[19］報道了XXMD 可以通過下調Nix、PINK1 及Parkin 蛋白表達減少線粒體自噬，進而保護神經元病理損傷。上述研究結論與本研究結果基本一致，證實了XXMD 對大腦神經元的保護作用。不同的是，我們的研究結果主要側重于闡明XXMD 對神經元突觸可塑性的作用及機制。

突觸作為神經元之間傳遞信息的基本結構，是保持神經網絡活動和正常大腦功能的關鍵。大腦受到外部刺激后，神經遞質從突觸前軸突釋放到突觸間隙，結合并激活突觸后樹突上的受體傳遞信號。雖然大多數神經元及軸突和樹突結構可以在成熟的大腦中保持穩定，但它們之間的突觸連接卻并不穩定[21］。在缺血性腦卒中期間，正常神經元及突觸功能的破壞，突觸密度顯著降低并出現運動功能障礙，記憶和認知能力下降等癥狀[22］。NF-200 和MAP2 作為神經元的主要細胞骨架成分，通常在軸突和樹突中表達[23-24］。NF-200 在促進軸突的生長、維持和再生方面發揮著關鍵作用，從而成為評估中樞神經系統形態學改變和軸突修復或生長狀態的指標[25-26］。MAP2 的主要功能在于通過調節微管之間的間距來促進樹突棘的穩定性，并可以增強神經元軸突和樹突的生長、分化、凋亡和可塑性[27］。本研究成功建立體外腦缺血再灌注模型，并進一步證實了OGD/R 可以下調HT22 細胞中突觸相關蛋白NF200、MAP2 的表達，同時引起神經元細胞損傷，具體表現為細胞變圓皺縮、細胞間隙增大，生存率下降，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高及超微結構破壞嚴重等。這提示OGD/R 誘導的HT22 細胞損傷可能與炎癥反應與突觸功能的破壞相關。

既往研究發現，缺血性腦卒中發生后，可在一定時間段內觀察到調控促進神經元生長、突觸發生、軸突及樹突增殖等基因和蛋白表達的自發性上調，這些與突觸可塑性的增強及機體記憶及功能的自發性恢復有關[28］。突觸可塑性作為是神經系統適應外部環境和內部生理變化的必要手段，是缺血腦卒中后記憶的形成和恢復的關鍵參與者[29］。如何提高腦卒中損傷后的突觸可塑性，成為當今神經科學和康復醫學研究的熱點問題。因此，我們進一步使用NF200、MAP2 作為突觸可塑性的主要觀察指標，用于XXMD 機制的研究。結果顯示，XXMD 可以有效逆轉OGD/R 對HT22 細胞的形態、超微結構的損傷，減輕炎癥因子水平，并上調NF200、MAP2 的熒光強度及蛋白表達。通過上述實驗，表明XXMD 可以改善OGD/R誘導的神經炎癥，增強突觸可塑性。

綜上所述，本研究證實了XXMD 可以有效抑制缺血性腦卒中后神經元炎癥反應，增強突觸可塑性。其作用機制為改善神經元超微結構，降低IL-1β、IL-6、TNF-α 平均水平，上調NF200、MAP2 的表達，從而發揮神經元保護的重要作用。