補(bǔ)腎中藥復(fù)方對(duì)高鹽攝入去卵巢大鼠骨代謝及ENaCα、NCC和ClC-3表達(dá)的影響*

崔 琰， 孫珂煥， 詹小瑤， 莫 樞， 肖雅雯， 王攀攀，楊 麗， 張榮華△， 朱曉峰△

（1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632；2暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632；3深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518025；4深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518000；5暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis， OP）是具有骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞特點(diǎn)的慢性疾病，由其引發(fā)的脆性骨折是患病群體失能、失用的主要原因，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國(guó)50 歲以上人群的重要健康問(wèn)題之一，絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松問(wèn)題尤為嚴(yán)重[1］。隨著飲食與骨代謝疾病關(guān)系研究的深入，飲食營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)成為與內(nèi)分泌失調(diào)、代謝紊亂及機(jī)械因素同樣顯著影響OP發(fā)生的主要因素之一[2-3］，尤其氯化鈉在飲食調(diào)味中居于主導(dǎo)地位，高鹽飲食作為飲食偏嗜最常見(jiàn)的類型，已被證實(shí)不僅與高血壓、心腦血管病、腎臟病、腫瘤及肥胖等的發(fā)生有關(guān)[4-6］，同時(shí)也是加速骨丟失的因素之一。

離子通道是細(xì)胞膜上一類調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)特異離子穿膜的通道，也是一類特殊親水性蛋白質(zhì)微孔道，存在于機(jī)體內(nèi)多種生命活動(dòng)過(guò)程，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[7］。參與骨代謝的間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞上表達(dá)多種離子通道如鈉通道、氯通道、鈣通道等的功能障礙與骨代謝疾病關(guān)系密切，這些離子通道不僅調(diào)節(jié)骨系細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理活動(dòng)，還參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，進(jìn)而影響骨代謝[8］。

補(bǔ)腎中藥復(fù)方（Bushen formulae， BHF）是張榮華教授依據(jù)骨質(zhì)疏松癥腎虛血瘀病機(jī)特點(diǎn)，以補(bǔ)腎活血壯骨為治法開(kāi)處的臨床驗(yàn)方，臨床治療OP 時(shí)取得了良好療效[9］。本研究以高鹽攝入的去卵巢大鼠為研究對(duì)象，從骨代謝、電壓門(mén)控性氯離子通道3（chloride channel of the ClC gene family， ClC-3）、上皮鈉離子通道α（epithelial sodium channel α， ENaCα）、鈉-氯同向轉(zhuǎn)運(yùn)體（Na-Cl cotransporter， NCC）為切入點(diǎn)，探討補(bǔ)腎中藥復(fù)方對(duì)不同飲食干預(yù)的去卵巢大鼠骨代謝的作用機(jī)制，拓展補(bǔ)腎中藥復(fù)方對(duì)骨代謝疾病的多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)SPF 級(jí)3 月齡SD 雌鼠80 只，體重為190～210 g，許可批號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。飼養(yǎng)于廣州博濟(jì)生物醫(yī)藥公司，飼養(yǎng)環(huán)境條件：環(huán)境通風(fēng)良好、安靜，相對(duì)濕度控制在45%～50%，溫度控制在（23±2） ℃。本項(xiàng)目通過(guò)廣州博濟(jì)生物醫(yī)藥公司動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

2 主要儀器與試劑

2.1 主要試劑 骨代謝生物標(biāo)志物指標(biāo)檢測(cè)ELISA 試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物；大鼠ENaCα、ClC-3 多克隆抗體（Alomone Labs），NCC多克隆抗體（Arigo）。

2.2 儀器 Prodigy 型雙能X 線骨密度儀（GE）；Micro-CT 儀（ZKKS-Sharp-MCT）； 全自動(dòng)生化分析儀（HITACHI 7600-020）；梯度PCR 儀（Veriti 96-Well，ABI）；熒光定量PCR儀（ABI7500）。

3 方法

3.1 藥物制備 補(bǔ)腎中藥復(fù)方由淫羊藿、熟地、骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、秦艽、中膝和枸杞等7 味藥組成，配比與煎煮方法同既往研究[10］，藥液濃縮至生藥量1 g/mL，干預(yù)劑量為7.8 g·kg-1·d-1，每日1次。

3.2 高鹽飼料 實(shí)驗(yàn)用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)高鹽飼料購(gòu)置于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，等級(jí)A 級(jí)。除了添加不同含量的氯化鈉外，其余均按照常規(guī)哺乳動(dòng)物飲食營(yíng)養(yǎng)成分添加。氯化鈉含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，w/w）分別為：正常飼料（含0.5%氯化鈉）、中等高鹽飲食組飼料（含2.0%氯化鈉）和高鹽飲食組飼料（含8.0%氯化鈉）。

3.3 去卵巢大鼠造模 大鼠飼養(yǎng)3 個(gè)月后，將6 月齡80 只SPF 級(jí)大鼠經(jīng)隨機(jī)數(shù)字表法為假手術(shù)組（10只）、去卵巢手術(shù)（sham）組（70 只），去卵巢手術(shù)（ovariectomy，OVX）組切除大鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅切除少量卵巢旁脂肪。具體操作步驟：SD 大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后，仰臥位固定，腹部術(shù)區(qū)進(jìn)行剃毛、消毒，沿腹白線縱行切口約2 cm 以打開(kāi)腹腔，去卵巢組找到雙側(cè)卵巢后予切除并止血，假手術(shù)組僅切除少量卵巢旁脂肪，術(shù)閉逐層縫合腹腔。

3.4 動(dòng)物分組及干預(yù) 造模1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將去卵巢手術(shù)組大鼠分為模型組（OVX 組）、中高鹽飲食（medium-high-salt diet， MSD）組、高鹽飲食（high-salt diet， HSD）組、補(bǔ)腎中藥復(fù)方（BHF）組、補(bǔ)腎中藥復(fù)方+生理鹽水（BHF+NS）組、補(bǔ)腎中藥復(fù)方+中高鹽飲食（BHF+MSD）組和補(bǔ)腎中藥復(fù)方＋高鹽飲食（BHF+HSD）組，每組各10 只。除補(bǔ)腎中藥復(fù)方+生理鹽水組飲水采用生理鹽水模擬淡鹽水送服外，其余均自由飲水和獲取所供不同的飼料，藥物劑量組分別給予相當(dāng)于成人臨床劑量的3 倍連續(xù)給藥灌胃12周。

3.5 骨代謝生物標(biāo)志物檢測(cè) 采用普通非抗凝采血管采集各組大鼠腹主動(dòng)脈血液樣本，4 ℃靜置分層后，離心取上層血清，依據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)血清中骨鈣素（bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein，BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）、Ⅰ型膠原羧基端肽（carboxy-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，CTX）、I 型膠原氨基端肽（N-terminal telopeptide of type I collagen，NTX）、雌二醇（estradiol 2，E2）。

3.6 骨組織蛋白表達(dá)的檢測(cè) 制備濃縮膠濃度為4%、分離膠濃度為10%的電泳凝膠，安裝好電泳裝置，按設(shè)計(jì)好的上樣順序緩慢上樣，微量加樣器吸取10 μL 樣品緩慢加入樣品孔，SDS-PAGE 電泳結(jié)束后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、洗膜后，置于搖床上封閉1 h，分別與ClC-3、ENaCα、NCC、GAPDH Ⅰ抗稀釋液（1∶1 000）在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。與Ⅱ抗工作液（1∶2 500）在室溫下孵育1 h 后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，檢測(cè)各條帶的灰度值，數(shù)據(jù)處理，分析蛋白的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。結(jié)果符合方差齊性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)，采用one-way ANOVA，當(dāng)P＜0.05時(shí)，用Tukey HSD 進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)采用Brown-Forsythe 和Welch 檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)，兩兩比較采用Dunnett’T3 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠股骨骨微結(jié)構(gòu)、骨密度、骨參數(shù)比較

在第12 周末檢測(cè)骨密度，如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，OVX 組大鼠骨密度顯著降低 （P＜0.05）；與模型組比較，中高鹽組和高鹽組骨密度進(jìn)一步下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而補(bǔ)腎方組股骨骨密度顯著增加（P＜0.05）。進(jìn)一步分析各組骨參數(shù)顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠骨體積分?jǐn)?shù)[BV/TV（%）］、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均顯著降低（P＜0.05），而骨小梁間距（Tb.Sp）則顯著增加（P＜0.05）；而高鹽攝入后去卵巢大鼠骨微結(jié)構(gòu)則進(jìn)一步破壞，表現(xiàn)為BV/TV（%）、Tb. N 、Tb. Th 的進(jìn)一步下降與Tb. Sp 上調(diào)，補(bǔ)腎復(fù)方攝入后可顯著改善去卵巢模型大鼠骨微結(jié)構(gòu)破壞，經(jīng)補(bǔ)腎方治療的中高鹽飲食攝入大鼠的骨參數(shù)較中高鹽大鼠均有改善（P＜0.05）；同樣，高鹽攝入并予補(bǔ)腎復(fù)方干預(yù)組其骨參數(shù)均較高鹽組有顯著改善（P＜0.05）。此外，與補(bǔ)腎方組比較，補(bǔ)腎方+生理鹽水組的BV/TV%下調(diào)且Tb.Sp 上調(diào)（P＜0.05），說(shuō)明生理鹽水的攝入對(duì)于補(bǔ)腎復(fù)方藥效發(fā)揮存在一定影響。

Figure 1. Comparison of bone mineral density and bone microarchitecture parameters by Micro-CT in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group； ?P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.圖1 各組大鼠股骨骨密度、骨參數(shù)比較

2 各組大鼠骨代謝生物標(biāo)志物指標(biāo)比較

如圖2 所示，模型組大鼠E2、PINP、BGP 較假手術(shù)組下降，但TRACP、CTX、NTX上調(diào)（P＜0.05），表明其骨形成能力下降而骨吸收增強(qiáng)。中高鹽攝入后不同程度升高CTX、BGP、PINP 水平，高鹽飲食攝入后進(jìn)一步下調(diào)E2 水平并上調(diào)CTX、NTX、BGP、PINP 水平（P＜0.05），表明不同濃度高鹽飲食加劇模型大鼠高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)。補(bǔ)腎方干預(yù)后，去卵巢大鼠PINP 表達(dá)上調(diào)，而CTX水平下降（P＜0.05）；并且補(bǔ)腎方干預(yù)可提升高鹽飲食大鼠E2、BGP水平，并下調(diào)骨吸收標(biāo)志物CTX水平（P＜0.05）。同時(shí)，在中高鹽、高鹽飲食攝入的基礎(chǔ)上，補(bǔ)腎方能夠分別下調(diào)其CTX 及BGP水平（P＜0.05）。此外，補(bǔ)腎方+生理鹽水組大鼠CTX水平較補(bǔ)腎方組升高（P＜0.05），其余骨代謝生物標(biāo)志物無(wú)顯著差異。

Figure 2. Comparison of bone metabolism biomarkers in each group. Quantification of serum E2， TRACP， CTX， NTX， BGP and PINP by ELISA. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group； ?P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.圖2 各組大鼠骨代謝生物標(biāo)志物指標(biāo)比較

3 各租大鼠骨組織病理形態(tài)變化比較

如圖3 所示，假手術(shù)組大鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨部位骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量密集且排列整齊，骨小梁間可互相連接成網(wǎng)狀，腔內(nèi)骨髓細(xì)胞數(shù)量豐富。模型組大鼠股骨骨小梁稀疏，游離端多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，骨髓內(nèi)空泡狀脂肪細(xì)胞明顯增多；與模型組比較，中高鹽組和高鹽組大鼠股骨骨小梁稀疏、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，脂肪細(xì)胞增多；補(bǔ)腎方組可見(jiàn)股骨骨小梁數(shù)量增多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)修復(fù)，脂肪細(xì)胞變少。經(jīng)補(bǔ)腎復(fù)方干預(yù)后，補(bǔ)腎方+中高鹽組和補(bǔ)腎方+高鹽組可見(jiàn)骨小梁數(shù)量增多，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)略微修復(fù)，脂肪細(xì)胞變少。

Figure 3. HE staining of femur in each group （scale bar=200 μm）.圖3 各組大鼠股骨HE染色

4 各組大鼠骨組織ENaCα、ClC-3 和NCC 蛋白水平比較

如圖4 所示，相較于假手術(shù)組，模型組大鼠骨組織ClC-3 顯著下調(diào)（P＜0.05），ENaCα 和NCC 表達(dá)無(wú)顯著變化（P＞0.05），而中高鹽飲食攝入則可上調(diào)去卵巢大鼠NCC，并下調(diào)其骨組織ClC-3 和ENaCα 表達(dá)，高鹽飲食攝入則下調(diào)其NCC 表達(dá)水平（P＜0.05）。經(jīng)補(bǔ)腎復(fù)方干預(yù)的模型大鼠NCC 表達(dá)水平下降，ClC-3 表達(dá)水平顯著升高，并且與對(duì)應(yīng)的中高鹽組、高鹽組相比，補(bǔ)腎復(fù)方的干預(yù)能不同程度下調(diào)中高鹽、高鹽攝入的大鼠骨組織NCC水平，并上調(diào)骨組織中ClC-3 和ENaCα 的表達(dá)（P＜0.05），說(shuō)明補(bǔ)腎中藥復(fù)方能調(diào)節(jié)離子通道的改變。此外，補(bǔ)腎方+生理鹽水組相較于補(bǔ)腎復(fù)方組大鼠ENaCα 和NCC 上調(diào)，ClC-3 下調(diào)（P＜0.05），表明生理鹽水對(duì)補(bǔ)腎復(fù)方作用機(jī)制的發(fā)揮存在影響。

Figure 4. The protein expression of ENaCα， ClC-3， and NCC in bone tissues of the rats in each group. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group； ?P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.圖4 各組大鼠骨組織ENaCα、ClC-3和NCC蛋白的表達(dá)

討 論

離子通道對(duì)于骨發(fā)育和骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，也是許多藥物作用的靶點(diǎn)[11］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上表達(dá)多種離子通道如鈉通道、氯通道、鈣通道和鉀通道等，這些離子通道不僅調(diào)節(jié)骨系細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理活動(dòng)，還參與多種信號(hào)感知、傳遞及轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，影響骨代謝功能，離子通道對(duì)骨系細(xì)胞的影響日益受到人們的關(guān)注[12-13］。ENaC 主要可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)以維持體內(nèi)鈉離子的平衡，也是許多藥物作用研究的重要靶點(diǎn)[14］。Na+已被證實(shí)可影響OB 細(xì)胞的分化來(lái)干預(yù)成骨功能，即低濃度時(shí)促進(jìn)分化，而高濃度抑制分化，成骨相關(guān)基因、ENaCα mRNA 的變化與OB 細(xì)胞分化活性的變化基本一致，ENaC 也參與OB 細(xì)胞在壓力刺激作用下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15］，以調(diào)節(jié)OB 細(xì)胞骨形成能力。本實(shí)驗(yàn)也同樣發(fā)現(xiàn)，在高鹽飲食狀態(tài)下，股骨ENaCα 蛋白表達(dá)均下調(diào)，可能是抑制成骨細(xì)胞分化的一個(gè)新途徑，從而影響骨代謝的變化。

NCC 也成稱為噻嗪類敏感的鈉-氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，噻嗪類利尿劑藥理機(jī)制包括促進(jìn)機(jī)體水、鈉的排泄，減少血容量、尿鈣排泄，促進(jìn)體內(nèi)鈣平衡，而噻嗪類利尿劑的長(zhǎng)期使用被發(fā)現(xiàn)可以減少骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、增加骨密度[16］?，F(xiàn)代研究還發(fā)現(xiàn)此類噻嗪類利尿藥可直接抑制NCC 刺激OB 細(xì)胞分化標(biāo)志物Runx2 和骨橋蛋白的產(chǎn)生，提高礦化結(jié)節(jié)的形成[17］，且NCC基因的失活能提高OB 細(xì)胞成骨分化能力以提高骨密度[18］。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了NCC在骨組織中的表達(dá)，且隨著體內(nèi)氯化鈉濃度的增加，NCC 的mRNA 和蛋白表達(dá)增加，在一定程度上抑制了成骨細(xì)胞活性和分化，誘導(dǎo)骨吸收，導(dǎo)致鈣從骨中丟失，從而影響骨代謝，而補(bǔ)腎中藥復(fù)方的干預(yù)可調(diào)節(jié)高鹽飲食引起NCC 的mRNA 和蛋白表達(dá)的改變，說(shuō)明補(bǔ)腎中藥復(fù)方就有一定的治療效果。ClC-3 氯通道與骨代謝也有密切關(guān)系[19］，通過(guò)檢測(cè)ClC-3 在小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明骨形成標(biāo)志物ALP、OCN 和Runx2 的mRNA 表達(dá)水平與ClC-3 表達(dá)水平成正相關(guān)，并呈高表達(dá)。而RNAi 介導(dǎo)的ClC-3基因沉默可下調(diào)這些成骨標(biāo)志物的表達(dá)[20］。在本研究中，隨著高鹽飲食的增加，ClC-3 蛋白表達(dá)量下調(diào)，因而推斷ClC-3抑制了去卵巢大鼠成骨分化，使骨吸收大于骨形成，從而直接影響骨代謝，補(bǔ)腎方干預(yù)后的補(bǔ)腎方+中高鹽飲食組和補(bǔ)腎方+高鹽飲食組與其相對(duì)應(yīng)的高鹽飲食組比較，均可不同程度的調(diào)節(jié)ClC-3 蛋白表達(dá)的改變，說(shuō)明補(bǔ)腎中藥復(fù)方的調(diào)節(jié)作用。此外，《本草綱目》曰：“故服補(bǔ)腎藥用鹽湯者，咸歸腎，引藥氣入本臟也”，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，味咸的中藥多歸腎經(jīng)，歷代醫(yī)家應(yīng)用補(bǔ)腎壯骨藥物時(shí)，也常用鹽作為引經(jīng)之藥，本研究納入的補(bǔ)腎方+生理鹽水組研究也為該理論的科學(xué)內(nèi)涵提供了更多依據(jù)。

綜上所述，高鹽飲食可引起股骨組織的相關(guān)離子通道ENaCα 和ClC-3 的表達(dá)下調(diào)，NCC 的表達(dá)上調(diào)，從而直接影響骨系細(xì)胞活性，引起骨形成的減少和骨吸收的增加，改變骨代謝的平衡。同時(shí)補(bǔ)腎中藥復(fù)方干預(yù)能夠不同程度的調(diào)節(jié)高鹽引起的相關(guān)離子通道的改變而發(fā)揮藥效作用。