利用超臨界CO2萃取川續斷揮發油的試驗研究

張玉，周孟焦，鄒靜，李潮俊，梁曉峰

1.西南科技大學材料與化學學院（綿陽 621010）；2.四川中醫藥高等專科學校綿陽市中藥資源開發利用重點實驗室（綿陽 621010）

續斷是川續斷科植物川續斷（Dipsacus asperwall.Ex Henry）的干燥根，又名川斷，《神農本草經》將其列為上品，具有補肝腎、強筋骨、續折傷、止崩漏、安胎等功效，資源豐富，應用久遠[1]，也有記載將續斷作為藥膳。川續斷化學成分主要有揮發油類、三萜皂苷類、生物堿類、環烯醚萜類，其中，揮發油為其主要成分之一[2]，有文獻報道，精油具有較好的抑菌、抗氧化作用[3]。

川續斷揮發油的提取方法主要包括水蒸氣蒸餾、溶劑萃取和酶輔助提取[3]，在這幾種方法中，水蒸氣蒸餾法提取有時間長、耗能較大等問題，使得提取率低，甚至難以收集。溶劑萃取法存在工藝復雜、耗時長、提取效率低等問題。超臨界CO2萃取是近幾年發展起來的一種中藥萃取方法，因其萃取速度快、流程短、效率高、能耗少，適合于熱敏組分的萃取而受到學者廣泛關注[4-6]。

由于川續斷的主要藥用部位在其根部，根部主要是木質結構，需要加入一定的攜帶劑以改變超臨界CO2的溶解性，萃取其易揮發性成分。超臨界CO2萃取法萃取川斷中揮發油工藝研究少見報道。因此，在單因素試驗基礎上，采用正交設計試驗優選出超臨界CO2萃取法萃取川繼斷揮發油最佳工藝[7-8]，并探究其抗氧化性，以期為川續斷更廣泛的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

川續斷（購自江西臻藥堂藥業股份有限公司），經四川省四川中醫藥高等專科學校王化東副教授鑒定為川續斷科植物川續斷（Dipsacus asperwall.Ex Henry）的干燥根，清洗、烘干、粉碎并過0.850 mm（20目）篩；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，國藥集團化學試劑有限公司）；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+，上海麥克林生化科技有限公司）；乙醇為分析純；水為純化水。

1.2 儀器與設備

HA120-50-01超臨界CO2萃取裝置（南通華安超臨界萃取有限公司）；752N Plus紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；RE52CS-2旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；QP2020氣質色譜-質譜儀（GC-MS，日本Shimadu公司）。

1.3 方法

1.3.1 超臨界CO2裝置萃取川續斷揮發油

稱取15 g（S0，所有川續斷樣品皆粉碎，過0.850 mm篩）川續斷粉末，無水乙醇作為攜帶劑，經攜帶劑泵泵入，設定萃取條件，進行動態萃取，從分離釜收集萃取液。提取得到的川續斷揮發油未旋蒸樣品為橙色液體，散發特殊香味，溶劑去除后的樣品為橙黑色黏稠液體，同樣散發特殊香味。由于萃取液中的目標產物在光熱條件下不穩定，因此，選擇40 ℃旋干攜帶劑，旋干后所得萃取物即為最終產物（S1），稱重并計算揮發油萃取率。

2 結果與分析

2.1 超臨界CO2裝置萃取川續斷揮發油的工藝優化

2.1.1 單因素試驗

采用超臨界CO2萃取法提取川續斷揮發油，以萃取時間、萃取溫度、萃取壓力、攜帶劑的浸泡時間和料液比（物料與攜帶劑比例）等作為考察因素，以川續斷揮發油的萃取率為評價指標，考察各個因素對川續斷萃取率的影響。

2.1.1.1 攜帶劑浸泡時間對川續斷揮發油萃取率的影響

在物料與攜帶劑比例1∶2.5（g/mL）、萃取溫度50 ℃、萃取時間1 h、萃取壓力20 MPa、分離溫度45℃的條件下，設置浸泡時間0，0.5，1.0，1.5和2.0 h這5個水平，計算揮發油萃取率，結果見圖1。

圖1 浸泡時間對萃取率的影響

結果表明：起初攜帶劑與原料未完全接觸，萃取率較低；隨著時間逐漸延長，浸泡面積增大，萃取率逐漸增大；1.0 h之后，萃取率下降，可能是在一定溫度下，物料和攜帶劑在萃取釜中時間較長，部分乙醇揮發，使得萃取率逐漸下降。因此，選擇浸泡時間0.5，1.0和1.5 h作為正交試驗浸泡時間的水平。

2.1.1.2 料液比對川續斷揮發油萃取率的影響

在浸泡時間1 h、萃取溫度50 ℃、萃取時間1 h、萃取壓力20 MPa、分離溫度45 ℃的條件下，設置物料比1∶1.5，1∶2，1∶2.5，1∶3和1∶3.5（g/mL）5個水平，計算揮發油萃取率。結果見圖2。

圖2 料液比對萃取率的影響

結果表明：隨著料液比比值的減小，萃取率呈現先上升后下降趨勢。料液比1∶3（g/mL）的萃取率不升反降，原因可能是攜帶劑用量對超臨界流體和溶質的接觸面積造成一定的影響，料液比1∶3（g/mL）時，物料全部浸泡在攜帶劑中，使得超臨界流體與物料無法充分接觸，從而其萃取大幅降低。因此，選擇料液比1∶2.5（g/mL）。

2.1.1.3 萃取時間對川續斷揮發油萃取率的影響

在物料與攜帶劑比例1∶2.5（g/mL）、浸泡時間1 h、萃取溫度50 ℃、萃取壓力20 MPa、分離溫度45℃的條件下，設置萃取時間0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，5個水平，計算揮發油萃取率，結果見圖3。

圖3 萃取時間對萃取率的影響

結果表明：在反應剛開始時，CO2與物料接觸面積比較小，萃取率較低；隨著萃取時間延長，超臨界流體與物料接觸面積增大，萃取率增大；1.5 h之后，萃取率增加緩慢，萃取效果提高不明顯，可能是因為萃取時間延長，攜帶劑部分揮發，使得萃取率降低。因此萃取時間選擇1.5，2.0和2.5 h作為正交試驗萃取時間水平。

2.1.1.4 萃取壓力對川續斷揮發油萃取率的影響

在物料與攜帶劑比例1∶2.5（g/mL）、浸泡時間1 h、萃取溫度50 ℃、萃取時間1 h、分離溫度45 ℃的條件下，設置萃取壓力16，18，20，22，24和26 MPa這5個水平，計算揮發油萃取率，結果見圖4。

圖4 萃取壓力對萃取率的影響

結果表明，隨著壓力逐漸增大，萃取率逐漸上升，后逐漸得到平緩。這可能是因為反應剛開始，萃取壓力的增加使得CO2的溶解性顯著增強，從而提高萃取率。超過22 MPa時，萃取壓力提高，萃取率幾乎不變，從安全角度來看，選擇20，22和24 MPa作為正交試驗萃取壓力的水平。

2.1.1.5 萃取溫度對川續斷揮發油萃取率的影響

在物料與攜帶劑比例1∶2.5（g/mL）、浸泡時間1 h、萃取時間1 h、萃取壓力20 MPa、分離溫度45 ℃的條件下，設置萃取時間35，40，45，50和55 ℃這5個水平，計算揮發油萃取率，結果見圖5。

圖5 萃取溫度對萃取率的影響

結果表明，萃取剛開始，萃取率隨著萃取溫度的升高而呈現升高趨勢，萃取溫度45 ℃后，萃取率下降，可能是因為在超臨界萃取過程中，萃取溫度主要受到升溫所增加的擴散系數與所降低的CO2密度2種效應的影響，溫度適當升高有助于溶質擴散速度加快，萃取率得以提高，一旦溫度升高到一定程度，超過這個限度，CO2對溶質的溶解能力降低，萃取率開始不升反降，同時溫度過高會使得乙醇和產物揮發較快，熱敏香味成分分解，對其品質產生負面影響，因此選擇溫度40，45和50 ℃作為正交試驗的水平。

2.1.2 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，選擇浸泡時間（A）、萃取壓力（B）、萃取溫度（C）、萃取時間（D）為自變量，進行L9(34)正交試驗，因素水平見表1，正交試驗設計與結果見表2與表3。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交試驗設計及結果

表3 方差分析結果

由表2中極差分析可知，川續斷萃取率的各因素影響程度大小依次為A＞B＞C＞D。表3中方差分析表明，A、B、C對揮發油提取率有顯著影響（P＜0.05），A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2，D3＞D1＞D2，故A因素選擇A2水平，B因素選擇B3水平，C因素選擇C1，D因素選擇D3，因此川續斷揮發油提取工藝最優設計方案是A2B3C1D3，即物料比1∶2.5（g/mL）、浸泡時間1 h、萃取壓力24 MPa、萃取溫度40 ℃、萃取時間2.5 h。

2.1.3 驗證試驗

驗證試驗見表4。

表4 驗證試驗表 單位：%

2.2 川續斷揮發油的GC-MS分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱為非極性SH-RXi-5Sil MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣；進樣溫度290℃。柱箱溫度（采用程序升溫方案）：柱初始溫度50℃，保持5 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至290 ℃，保持10 min；進樣量1 μL；分流比10∶1；柱流量1.0 mL/min；溶劑延遲時間3 min。質譜條件：離子源為電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；檢測電壓0.8 kV；質量掃描范圍（m/z）33～700 amu；電子能量70 eV。

2.2.2 GC-MS分析

采用GC-MS法分析川續斷揮發油的主要成分，采用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。由表5可以得出，川續斷揮發油中共檢出46種化合物。所得的揮發油相對含量大于2%的化合物有棕櫚酸（8.93%）、棕櫚酸乙酯（4.22%）、亞油酸乙酯（3.91%）、亞麻酸乙酯（3.13%）、辛基棕櫚酸酯（2.54%）、β-谷甾醇（10.51%）。其中，相對含量大于1%的化合物有亞油酸（1.90%）、硬脂酸乙酯（1.05%）、γ-谷甾醇（1.82%）、菜油甾醇（1.90%）、羊毛甾醇（1.04%）。

表5 GC-MS分析

2.3 抗氧化性試驗

2.3.1 DPPH·抑制能力的測定

稱取一定量的川續斷揮發油，將川續斷揮發油配制成0.50，1.00，2.00，4.00，8.00和16.00 mg/mL的系列梯度溶液，配制質量濃度0.08 mg/mL的DPPH·溶液。取2.0 mL DPPH·溶液和2.0 mL上述不同濃度的樣品溶液混合均勻，避光靜置30 min，通過紫外分光光度計在517 nm波長處測定吸光度（A1）；測定2.0 mL無水乙醇與2.0 mL不同濃度揮發油樣品溶液混合液的吸光度（A2）；測定2.0 mL無水乙醇與2.0 mL DPPH·的吸光度（A0）。重復測定3次，取均值。抑制率按式（2）計算。

自由基抑制率=[1-（A1-A2）]/A0×100% （2）

2.3.2 ABTS+·抑制能力的測定

稱取一定量的川續斷揮發油，配制成0.25，0.50，1.00，2.00，4.00和8.00 mg/mL的系列梯度溶液，稱取19.18 mg ABTS+·粉末，配制成質量濃度3.84 mg/mL的溶液，另稱取3.10 mg K2S2O8粉末，配制成質量濃度0.62 mg/mL的溶液，2種溶液等體積混合，暗處反應12～14 h，取1.0 mL上述混合溶液，稀釋約40倍，通過紫外可見分光光度計在734 nm波長處測試其吸光度，吸光度為0.700±0.02。取1.0 mL上述樣品溶液，加入制備好的3.0 mL混合溶液，混合均勻，暗處反應10 min，測試吸光度（A2）；取1.0 mL樣品溶液，加入3.0 mL乙醇溶液，混合均勻，測試吸光度（A1）；取1.0 mL混合溶液，加入3.0 mL無水乙醇，混合均勻，測試其吸光度（A0）。重復測定3次，取均值。抑制率按式（2）計算。

2.3.3 抗氧化性試驗結果

由圖6可知，川續斷揮發油對DPPH·的抑制率隨著川續斷揮發油質量濃度的升高而增大，川續斷揮發油質量濃度16.00 mg/mL時，其對DPPH·抑制率達83.4%±3.38%。由圖7可知，川續斷揮發油對ABTS+·的抑制率隨著川續斷揮發油質量濃度的升高而增大，川續斷揮發油質量濃度4.00 mg/mL時，其對ABTS+·抑制率達100%±0.10%。試驗表明所提取的川續斷揮發油對2種自由基都具有較好的抗氧化性能。

圖6 川續斷揮發油對DPPH自由基的抑制作用

圖7 川續斷揮發油對ABTS+自由基的抑制作用

3 結論

在單因素試驗基礎上，結合正交設計試驗，得出川續斷揮發油萃取率最優設計方案。結果表明，無水乙醇作為攜帶劑，物料與攜帶劑比例1∶2.5（g/mL），萃取壓力24 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時間2.5 h，浸泡時間1.0 h時，超臨界CO2萃取川續斷揮發油最優萃取率達3.60%。根據GC-MS試驗結果，川續斷揮發油中共分離檢測出46種化合物，主要成分包含醇、烯、酯及芳香物質等化合物類型，其中，棕櫚酸和β-谷甾醇含量分別達8.93%和10.51%。抗氧化性試驗表明，川續斷揮發油具有DPPH·抑制能力和ABTS+·清除能力，且揮發油濃度與這2種自由基抑制率呈正相關關系。