響應面法優化超聲波輔助提取黃櫨葉漆黃素的工藝

許凱揚，徐娜，李彥，王滿生

1.長沙理工大學食品與生物工程學院（長沙 410114）；2.中國農業科學院麻類研究所（長沙 410205）

黃櫨（Cotinus coggygriaScop.）為漆樹科黃櫨屬（CotinusL.）植物，喬木或灌木[1]，一直被用作保持水土的防護林和園林綠化的景觀植物，也作為化工鞣化劑。雖尚未作為藥材收載入《中國藥典》，但許多藥理和藥效學實驗均表明黃櫨具有治療濕熱型黃疸、抗肝炎、止瀉、抗菌等作用[2-4]。黃櫨富含黃酮類化合物、單寧、多酚類物質及有機酸類等，還含有多種微量元素，例如鉀、鈉、鋁、鎂、硅、鈣、磷[5]。至今，從黃櫨中共分離出18種黃酮類化合物，全棵不同地方的總黃酮量從大到小為根、枝莖、葉子[6]。例如，黃櫨根和莖中黃酮類化合物含量為6.75%[7]。張正臣等[8]首次從黃櫨中分離出3,7,3’,4’-四羥基黃酮即漆黃素（fisetin），是黃櫨中抗肝炎的有效成分[9]。研究表明，漆黃素可通過誘導腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞信號轉導通路、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲等途徑發揮抗腫瘤的作用[10-12]。漆黃素為黃色針狀結晶，分子式為C15H10O6，溶于乙醇、丙酮、乙酸、氫氧化物堿溶液，不溶于水、乙醚、苯、氯仿和石油醚[13]。

天然色素提取通常采用溶劑提取法。近年來，超聲、微波等輔助手段可提高提取率，其中，超聲輔助提取技術是利用超聲波的強振動、高加速度、強空化效應、強攪拌作用來縮短天然產物有效成分進入溶劑的時間，加快提取過程，提高提取率，并有效避免高溫對有效成分的破壞[14-16]。

近年來，研究者主要圍繞黃櫨的藥理活性開展了研究，而關于其有效成分的提取工藝報道較少。例如：李建華等[6]采用正交試驗對黃櫨漆黃素的煎煮工藝進行了優化，得到最佳提取方案：以25倍原料量的65%乙醇為提取溶媒，調pH至9，提取90 min，按此法得黃櫨中漆黃素的提取率為1.03%；崔恩賢[17]通過試驗確定了黃櫨藥用的有效部位，研究表明，黃櫨根、枝、莖和葉中總黃酮含量呈上升趨勢。基于此，文章采用超聲輔助提取法，通過單因素試驗和響應面優化，獲得了黃櫨中主要有效成分漆黃素的最佳提取工藝參數，此次研究有助于降低成本、提高有效成分提出率，也有利于更好地開發、利用黃櫨的藥用價值，提高其制劑質量及藥效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃櫨葉（河南南陽，烘干粉碎后置陰涼干燥處備用）；漆黃素標準品（西安匯林生物科技有限公司）；無水乙醇（分析純，鄭州派尼化學試劑廠）；甲醇、乙酸（分析純，太倉滬試試劑有限公司）；丙酮（分析純，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司）；氫氧化鈣（分析純，廣東光華科技股份有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

101A-2電熱鼓風干燥箱、FW177中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV-5200紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；FA2014精密電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；SB3200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵、RE-1020旋轉蒸發器、RE-201D恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

采用紫外分光光度法測定黃櫨中漆黃素含量[18-19]。精密稱取2.00 mg漆黃素標準品，用60%丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。精確吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00和6.00 mL于10 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收峰366 nm處測定其吸光度，所得數據經回歸處理，得到標準曲線回歸方程A=0.0759C-0.0273，相關系數為R2=0.9997。

1.3.2 漆黃素含量的測定

精確移取0.5 mL提取液于50 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收波長366 nm處測吸光度，根據標準曲線，得漆黃素的濃度。漆黃素得率（%）按式（1）計算。

式中：C為試樣質量濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；m為試樣的質量，g。

1.3.3 單因素試驗

分別以不同溶劑、丙酮體積分數、料液比、提取時間、提取次數為單因素進行試驗，探討其對黃櫨葉漆黃素得率的影響。

準確稱取5.0000 g黃櫨葉粉，按料液比1∶10（g/mL）分別加入飽和石灰水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸，室溫下浸泡2 h，超聲處理20 min，抽濾，重復提取2次，合并濾液，按1.2.2小節方法測定其吸光度，計算漆黃素得率，重復3次。

準確稱取5.0000 g黃櫨葉粉，按料液比1∶10（g/mL）分別加入體積分數為20%，40%，60%，80%和100%的丙酮溶液，室溫下浸泡2 h，超聲處理20 min，抽濾，重復提取2次，合并濾液，按1.2.2小節方法測定其吸光度，計算漆黃素得率，重復3次。

準確稱取5.0000 g黃櫨葉粉，分別按料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12和1∶14加入60%丙酮溶液，室溫下浸泡2 h，超聲處理20 min，抽濾，重復提取2次，合并濾液，按1.2.2小節方法測定其吸光度，計算漆黃素得率，重復3次。

準確稱取5.0000 g黃櫨葉粉，按料液比1∶10（g/mL）加入60%丙酮溶液，室溫下浸泡2 h，分別超聲處理10，20，30，40和50 min，抽濾，重復提取2次，合并濾液，按1.2.2小節方法測定其吸光度，計算漆黃素得率，重復3次。

準確稱取5.0000 g黃櫨葉粉，按料液比1∶10（g/mL）加入60%丙酮溶液，室溫下浸泡2 h，超聲處理40 min，抽濾，同樣條件下分別超聲處理1，2，3和4次，合并濾液，按1.2.2小節方法測定其吸光度，計算漆黃素得率，重復3次。

1.3.4 響應面優化試驗

在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，選擇丙酮體積分數、料液比、提取時間進行三因素三水平的中心組合試驗，利用Design-Expert軟件進行數據擬合，確定超聲波提取黃櫨葉漆黃素的最佳工藝參數，試驗因素和水平見表1。

表1 三因素三水平中心組合試驗因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 不同溶劑對漆黃素得率的影響

從表2可以看出：采用丙酮提取漆黃素的得率最高，達到1.6503%；飽和石灰水和乙酸所得漆黃素得率較低，均低于0.8000%，在提取中不宜采用；甲醇所得漆黃素得率與乙醇相當。這主要是因為漆黃素略溶于丙酮、甲醇、乙醇，幾乎不溶于乙酸，而在堿性水溶液中其溶解度也偏小[8]。因此，從漆黃素得率方面考慮，后續試驗均采用丙酮作為溶劑進行漆黃素的提取研究。

表2 不同提取溶劑對漆黃素得率的影響

2.1.2 丙酮體積分數對漆黃素得率的影響

由圖1可以看出，開始時漆黃素得率隨丙酮體積分數的增大而增加，當體積分數達到60%時，漆黃素得率最高（1.6503%），而當丙酮體積分數繼續增加時，得率反而下降。這是由于丙酮體積分數較低時，水的含量相對較高，使漆黃素得率較低。當丙酮體積分數過高時，一些脂溶性物質的溶出量增大，使漆黃素的溶解度降低，從而導致漆黃素得率降低。因此，后續試驗確定最適宜丙酮體積分數60%。

圖1 丙酮體積分數對漆黃素得率的影響

2.1.3 料液比對漆黃素得率的影響

由圖2可知，在其他條件一致的情況下，漆黃素得率隨料液比的減小而增加，但當料液比低于1∶10（g/mL）時，黃櫨葉漆黃素得率也開始降低。這是因為當擴散達到平衡時，增加提取劑用量不僅不會促進漆黃素的提取，反而為后面的工作帶來困難。從提取效果和減少溶劑用量等方面綜合考慮，后續試驗采用料液比為1∶10（g/mL）。

圖2 料液比對漆黃素得率的影響

2.1.4 提取時間對漆黃素得率的影響

由圖3可知，黃櫨葉漆黃素得率隨提取時間的增加而增加，增加提取時間會使物質能更加充分地溶解，使顆粒中物質溶解完全，但40 min后提取率的增加相對較小，延長提取時間只會增加提取成本，為節約成本，后續試驗宜選擇40 min作為最適提取時間。

圖3 提取時間對漆黃素得率的影響

2.1.5 提取次數對漆黃素得率的影響

由圖4可知，隨著提取次數的增加，漆黃素得率也增加。提取2次即可達到較好的效果，3次提取與2次提取的得率相比變化不明顯，從經濟與操作方面考慮，后續試驗選擇2次為最適提取次數。

圖4 提取次數對漆黃素得率的影響

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析

根據Box-Benhnken中心組合實驗設計原理，結合單因素試驗的結果，選取丙酮體積分數、料液比、提取時間進行三因素三水平中心組合試驗，利用響應面法優化黃櫨葉漆黃素提取工藝參數，試驗方案與結果見表3。

表3 三因素三水平中心組合試驗方案及結果

用Desingn-Expert軟件對表3數據進行回歸分析，結果見表4。對各因素回歸擬合后，得到黃櫨葉漆黃素得率Y對X1，X2和X3的二次多項回歸方程：

表4 回歸系數顯著性檢驗表

從表4可以看出：料液比、提取時間的一次項和二次項對漆黃素得率的影響極顯著或高度顯著；丙酮體積分數的二次項對漆黃素得率的影響極顯著，而一次項不顯著。表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系。回歸方差分析顯著性檢驗結果表明，該模型回歸高度顯著，且失擬項不顯著，說明該方程對試驗擬合較好，可以用此模型來分析和預測超聲波法輔助提取黃櫨葉漆黃素的工藝條件。

2.2.2 響應面分析與優化

響應曲面反映了當丙酮體積分數、料液比、提取時間三個因素的任意變量取零點水平時，其他兩個因素的交互作用對黃櫨葉漆黃素得率的影響情況。曲面陡表明該因素對提取率的影響顯著，曲面平緩表明該因素對提取率的影響不顯著；等高線的形狀反映兩因素交互作用的強弱，橢圓形表明交互作用強，影響顯著，圓形則相反；等高線密集表明對提取率影響較大，稀疏表明影響較小。

圖5～圖7直觀地反映了各因素對響應值的影響，通過比較該3組圖可知：提取時間（X3）對漆黃素得率的影響最為顯著，表現為曲線較陡；而丙酮體積分數（X1）與料液比（X2）次之，表現為曲線較為平滑，3組圖的等高線均為圓形，說明各因素的交互作用較弱，對漆黃素得率的影響不顯著。

圖5 丙酮體積分數與料液比的交互作用對漆黃素得率的影響

圖6 丙酮體積分數與提取時間的交互作用對漆黃素得率的影響

圖7 料液比與提取時間的交互作用對漆黃素得率的影響

2.3 黃櫨葉漆黃素最佳提取條件的確定和驗證試驗

根據所得到的模型，可預測在穩定狀態下的最優工藝條件，即丙酮體積分數61.73%、料液比1∶10.37（g/mL）、提取時間44.23 min。在此條件下漆黃素得率理論上可達1.9513%。考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為乙醇體積分數60%、料液比1∶10（g/mL）、提取時間44 min，在此條件下進行3次平行試驗，實際平均值為1.9482%，與預測值偏差較小，說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法優化所得的超聲波輔助提取工藝參數準確可靠。

3 結論

研究以漆黃素得率為指標，通過單因素試驗和響應面法優化試驗，獲得了超聲波輔助法提取黃櫨葉漆黃素的最佳工藝和條件：丙酮體積分數60%，料液比1∶10（g/mL），提取時間44 min，重復次數2次，在該工藝條件下黃櫨葉中漆黃素得率為1.9482%。研究結果為漆黃素的進一步應用提供了一定的理論基礎和參考。