藍莓清汁復合酶解工藝優化

孫瑞悅，張見，李彩鈴，劉元法,2

1.白馬未來食品研究院（南京 210095）；2.江南大學（無錫 214000）

藍莓（Blueberry）屬于杜鵑花科越桔屬，果實呈藍色，外含一層白色果粉，果肉細膩，風味獨特，口感酸甜，被譽為“漿果之王”[1]。藍莓果實中含有豐富的營養成分，如花青素、黃酮、維生素、超氧化物歧化酶（SOD）、膳食纖維等多種生理活性物質[2]，具有抗氧化[3]、增強機體免疫[4]、緩解眼部疲勞[5]、降血糖[6]等多種功能。

藍莓除少數用作鮮食外，大多數被加工成各種產品[7]。我國起步較晚，主要將其加工成果汁[8]、果醬[9]、果酒[10]等，相對而言，果汁類產品少，市售果汁主要以果肉飲料和濃縮汁為主。而有一部分人認為果肉飲料和濃縮汁的口感過于濃厚，他們更青睞于清淡口味，因此為豐富藍莓果汁的種類，研制藍莓清汁飲料以填補市場空白。

此研究旨在通過復合酶酶解制備出汁率高、花青素含量高的藍莓清汁飲料，為藍莓清汁的開發利用提供理論數據，加快實現藍莓清汁飲料的工業化生產。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

藍莓（江蘇中植生態植物科學研究院有限公司）；食品級果膠酶（30000 U/g）、食品級纖維素酶（10000 U/g）、食品級半纖維素酶（30000 U/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司；飛燕草色素標品（純度99.4%）、矮牽牛色素標品（純度99.8%）、芍藥素標品（純度98.5%）：德斯特生物有限公司；矢車菊色素標品（純度96.7%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；天竺葵色素標品（純度98.8%純度，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；錦葵素標品（純度97.4%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

5500+液相色譜-質譜聯用儀（德國SCUEX）；TM6多功能小美料理機：福維克家用電器制造（上海）有限公司；ARD110電子天平、AX224ZH/E分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；LYNX4*1 L離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；HHS-21-6恒溫水浴鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程藍莓凍果→清洗→4 ℃解凍→瀝干→破碎打漿→酶解→鈍酶→離心→藍莓清汁

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 原料預處理取-20 ℃冷凍藍莓果，挑棄凍癟和含有枝干的果，用自來水洗去表面灰塵。

1.3.2.2 打漿

采用多功能料理機進行打漿破碎（漿果與水比例1∶4）。

1.3.2.3 酶解、鈍酶、離心

根據漿汁總質量稱取一定比例的果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶，置于50 ℃恒溫水浴鍋中，酶解2 h，于85 ℃滅酶10 min，后在5000 r/min轉速下離心15 min，得藍莓清汁。

1.3.3 酶解工藝優化試驗

1.3.3.1 果膠酶添加量對酶解效果的影響

分別稱取6份50 g藍莓漿果，在酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h條件下，考察不同果膠酶添加量（0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%和0.3%）對藍莓清汁出汁率和花青素溶出率的影響。以藍莓出汁率、花青素含量作為評價指標，每個試驗重復3次，確定果膠酶的最適添加量。

1.3.3.2 纖維素酶添加量對酶解效果的影響

分別稱取6份50 g藍莓漿果，在酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h條件下，考察不同纖維素酶添加量（0.02%，0.06%，0.1%，0.14%，0.18%和0.22%）對藍莓清汁出汁率和花青素溶出率的影響。以藍莓出汁率、花青素含量作為評價指標，每個試驗重復3次，確定纖維素酶的最適添加量。

1.3.3.3 半纖維素酶添加量對酶解效果的影響

分別稱取6份50 g藍莓漿果，在酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h條件下，考察不同半纖維素酶添加量（0.02%，0.04%，0.06%，0.08%，0.10%和0.12%）對藍莓清汁出汁率和花青素溶出率的影響。以藍莓出汁率、花青素含量作為評價指標，每個試驗重復3次，確定半纖維素酶的最適添加量。

1.3.3.4 復合酶配比正交優化試驗

通過單因素試驗確定果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶的最適添加范圍，在酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h條件下，以3種酶的不同添加量設計L9(33)正交試驗，確定復合酶最佳配比，試驗設計如表1所示。

表1 復合酶因素水平 單位：%

表2 響應面試驗因素水平設計

1.3.3.5 酶解溫度對酶解效果的影響

分別稱取6份50 g藍莓漿果，固定復合酶添加量（果膠酶添加量為0.15%，纖維素酶添加量為0.08%，半纖維素酶添加量為0.08%）、酶解時間2 h，考察不同酶解溫度（35，40，45，50，55和60 ℃）對藍莓出汁率和花青素含量的影響。以藍莓出汁率和花青素含量作為評價指標，每個試驗重復3次，確定酶解的最適溫度。

1.3.3.6 酶解時間對酶解效果的影響

分別稱取6份50 g藍莓漿果，固定復合酶添加量（果膠酶添加量為0.15%，纖維素酶添加量為0.08%，半纖維素酶添加量為0.08%）、酶解溫度50 ℃，考察不同酶解時間（0.5，1，1.5，2，2.5和3 h）對藍莓出汁率的影響。以藍莓出汁率和透光率作為評價指標，每個試驗重復3次，確定酶解的最適時間。

1.3.3.7 響應面試驗設計

1.3.4 檢測方法

1.3.4.1 出汁率測定

酶解后的藍莓清汁離心取上清液，所得清汁質量占酶解前藍莓汁質量的百分比為出汁率[11]。

1.3.4.2 花青素含量的測定

參考孫瑞悅等[12]、Liu等[13]的方法并稍作修改。取1 g酸奶塊粉末樣品于具塞刻度試管中，用提取液（無水乙醇+水+鹽酸=2∶1∶1，V/V）定容至50 mL，超聲提取30 min，沸水浴水解1 h，冷卻，用提取液再次定容至刻度線，靜置，取上清液，用0.22 μm水相過濾備用。液相色譜條件[14]：使用色譜柱C18液相色譜柱，流動相為乙腈（溶液A）和1%甲酸水溶液（溶液B），柱溫40 ℃，流速1 mL/min，進樣量為10 μL，洗脫條件如下表3所示。

表3 梯度洗脫程序

1.3.4.3 藍莓清汁綜合評價指標

藍莓清汁綜合評價指標按式（1）計算。

綜合評分=出汁率×50%+花青素含量×50%（1）

1.4 數據處理

采用SPSS和Origin軟件進行數據分析，繪制折線圖，采用Design-Expert進行試驗設計及響應面分析。

2 結果與分析

2.1 果膠酶添加量對酶解效果的影響

由圖1可知，在果膠酶添加量0.05%～0.3%范圍內，隨著果膠酶添加量的增加，藍莓清汁的出汁率先上升后平緩的趨勢。這是由于果膠酶能夠降解漿果中果膠物質，從而破壞植物細胞壁，提高果汁出汁率，降低果汁黏度。當果膠酶添加量為0.15%時，出汁率達到最大值（64.2%），當果膠酶繼續增加時，出汁率無明顯變化，這是因為果漿定量時，其所含果膠物質含量一定，果膠酶過多只能加速酶解反應，不會提高出汁率[15]。此外，藍莓清汁中花青素含量也呈現出與出汁率相同的趨勢，且在0.15%時花青素含量最高。因此果膠酶的最適添加量范圍為0.12%～0.17%。

圖1 果膠酶添加量對酶解效果的影響

2.2 纖維素酶添加量對酶解效果的影響

由圖2可知，在纖維素酶添加量0.02%～0.18%范圍內，隨著纖維素酶添加量的增加，藍莓清汁的出汁率先上升后平緩的趨勢。這是由于纖維素酶能夠破壞植物細胞壁，從而提高果汁出汁率。當纖維素酶添加量為0.1%時，出汁率達到最大值（56.3%），當纖維素酶繼續增加時，出汁率無明顯增加，這是因為酶過量導致溶液體系黏度增大，限制酶解反應速率[16]。此外，藍莓清汁中花青素含量與出汁率呈現出相同趨勢，且在0.1%時花青素含量最高。因此纖維素酶的最適添加量范圍為0.08%～0.12%。

圖2 纖維素酶添加量對酶解效果的影響

2.3 半纖維素酶添加量對酶解效果的影響

由圖3可知，在半纖維素酶添加量0.02%～0.12%范圍內，隨著半纖維素酶添加量的增加，藍莓清汁的出汁率先上升后平緩的趨勢，當半纖維素酶添加量為0.08%時，出汁率達到最大值（51.9%），當半纖維素酶繼續增加時，出汁率無明顯變化。此外，在一定范圍內，藍莓清汁中花青素含量與出汁率呈現出相同趨勢，且在0.06%時花青素含量最高。因此纖維素酶的最適添加量范圍為0.06%～0.1%。

圖3 半纖維素酶添加量對酶解效果的影響

2.4 復合酶配比正交優化試驗

由表4可知，各因素水平對藍莓清汁的綜合評分影響順序為A（果膠酶添加量）＞B（纖維素酶添加量）＞C（半纖維素酶添加量），果膠酶添加量是影響藍莓清汁綜合評分的最主要因素，其次是纖維素酶添加量、半纖維素酶添加量，其最優組合為A2B1C2，即果膠酶添加量為0.15%，纖維素酶添加量為0.08%，半纖維素酶添加量為0.08%。復合酶最優組合綜合評價指標為49.48分，故選擇復合酶配比（果膠酶∶纖維素酶∶半纖維素酶）分別為0.12%∶0.08%∶0.08%，0.15%∶0.08%∶0.08%和0.18%∶0.08%∶0.08%作為響應面試驗的3個水平。

表4 復合酶配比正交試驗結果

2.5 酶解溫度對酶解效果的影響

由圖4可知，藍莓清汁中花青素含量與出汁率均隨酶解溫度的增加而呈現先上升后下降的趨勢，當酶解溫度為50 ℃時，出汁率達84.57%，花青素含量為10.3 mg/100 g。這是因為在最適溫度下酶活性達到最大值，使果汁中果膠等大分子物質降解，增加出汁率，此外還提高了花青素的溶出率，但溫度過高，會導致酶活性喪失，從而失去作用。因此，選擇45，50和55 ℃作為響應面的3個水平。

圖4 酶解溫度對酶解效果的影響

2.6 酶解時間對酶解效果的影響

由圖5可知，藍莓清汁中花青素含量與出汁率均隨酶解時間的增加而呈現先上升后平緩的趨勢，當酶解溫度為3 h時，出汁率達88.05%，花青素含量為13.01 mg/100 g，此后，隨著時間的延長，對出汁率及花青素含量影響不大。這是因為適當的酶解時間有利于藍莓胞內物質溶出，時間過長導致花青素損失率增加。因此，綜合考慮選擇2，2.5和3 h作為響應面試驗的3個水平。

圖5 酶解時間對酶解效果的影響

2.7 響應面試驗結果分析

2.7.1 回歸模型的建立與方程分析

在單因素試驗結果的基礎上，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）、復合酶配比（C）作為響應因子，以藍莓清汁綜合評價作為響應值，建立Box-Behnken試驗設計模型，對三因素三水平進行響應面分析，優化藍莓清汁酶解加工工藝。試驗設計方案及結果如表5所示。

表5 響應面分析試驗設計及結果

利用Box-Behnken響應面對表4試驗數據進行多元回歸擬合，得到藍莓清汁綜合評價的二元多項回歸方程：

模型方程顯著性檢驗如表6所示。回歸項中模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明方程與實際情況擬合比較好，能夠準確反映綜合評分與各因素之間的關系。一次項（A、C）、交互項（BC）、二次項（A2、B2、C2）對藍莓清汁評分具有極顯著影響（P＜0.01）；一次項（B）、交互項（AB、AC）對藍莓清汁評分影響不顯著（P＞0.05）。此外，F值越大，說明該因素對藍莓清汁綜合評分影響越大[17]。因此，比較F值大小可知，各因素影響藍莓清汁綜合評分的大小依次為A（酶解時間）、C（復合酶配比）、B（酶解溫度）。

表6 回歸方程方差分析

2.7.2 響應面因素交互作用分析

由因素顯著項（P＜0.05）交互作用的響應面圖（圖6）分析可得，綜合評分在所選范圍內存在極點，響應面坡度陡峭、等高線呈橢圓形，反映出各因素之間的兩兩交互作用顯著[18]。酶解溫度和復合酶配比之間的交互作用顯著，對結果影響較大，與表6結果一致，進一步直觀地說明該試驗模型具有較好的可靠性和可行性。

圖6 酶解溫度和復合酶配比對綜合評分影響的響應面圖（A）和等高線圖（B）

2.7.3 響應面最優條件預測與驗證試驗

經響應面最優組合分析，確定藍莓清汁酶解工藝條件：酶解溫度49.14 ℃，酶解時間2.42 h，復合酶配比0.15%∶0.08%∶0.08%。在此條件下，藍莓清汁的最佳綜合評分為50.12分。為方便實際的試驗操作，將最佳工藝參數修正為酶解溫度50 ℃、酶解時間2.5 h、復合酶配比0.15%∶0.08%∶0.08%。采用修正后的工藝參數進行3次平行試驗，藍莓清汁綜合評分為50.1±0.3分，與理論預測值非常接近，可知利用響應面分析法優化藍莓清汁酶解工藝參數具有實際可行性。

3 結論

通過單因素試驗、正交試驗和Box-Behnken響應面優化了藍莓清汁飲料的酶解工藝條件。試驗結果表明：藍莓清汁的最佳酶解工藝為酶解溫度50 ℃、酶解時間2.5 h、復合酶配比0.15%∶0.08%∶0.08%，在此條件下，藍莓清汁的綜合評分為50.1±0.3分。通過響應面分析和驗證試驗證明，建立的數學模型合理可靠，可為后期藍莓清汁飲品開發提供參考。