水翁花蕾多酚的提取及其抗氧化、抑菌活性研究

吳麗麗，陳江龍，李莎

遵義醫(yī)科大學(xué)生物工程學(xué)院（珠海 519041）

水翁花，始載于《嶺南采藥錄》，為桃金娘科水翁屬植物水翁[Cleistocalyx operculatus（Roxb.）Merr.et Perry]的干燥幼嫩花蕾，在我國主要分布于廣東、廣西、海南等省份，具有清熱解暑、去濕消滯、生津止渴等功效，可被用于急性胃腸炎、細菌性痢疾、消化不良和傷風(fēng)感冒等的治療[1]，在廣東地區(qū)常被用作涼茶制備的主要成分[2]。隨著對水翁花研究的逐漸深入，研究發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理作用，如：程少璋等[3]通過小鼠試驗發(fā)現(xiàn)水翁花具有較好抗炎、解熱和鎮(zhèn)痛作用；羅清等[4]通過小鼠試驗發(fā)現(xiàn)水翁花具有良好的抗內(nèi)毒素作用；羅穎娣[5]研究發(fā)現(xiàn)水翁花功能成分2’,4’-二羥基-6’-甲氧基-3’,5’-二甲基查耳酮（2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone，DMC）具有降血糖作用；玉萬國[6]研究發(fā)現(xiàn)水翁花功能成分DMC具有抗炎保肝作用，可用于肝炎相關(guān)疾病預(yù)防和治療；盧艷花等[7]通過試驗發(fā)現(xiàn)水翁花提取物對小鼠肝微粒體膜脂氧化和神經(jīng)細胞氧化損傷均具有抑制作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，水翁花中含有黃酮類、酚類、甾醇、三萜類、木脂素、揮發(fā)油等多種有機成分，其中多酚類化合物作為一類重要的天然產(chǎn)物，亦是水翁花中主要的組成成分。多酚由于其分子結(jié)構(gòu)中具有很多捕獲自由基能力較強的鄰位酚羥基，被認為是一種天然且安全高效的抗氧化劑，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病變等潛在應(yīng)用價值[8-10]。水翁花提取物的研究集中在黃酮類物質(zhì)上，如：趙文娟等[11]通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助法提取水翁花蕾查耳酮工藝研究；葉春林等[2]報道的水翁花總黃酮酶法提取工藝及抗氧化活性研究。關(guān)于水翁花多酚提取物的報道和研究還較少，試驗以水翁花為原料，乙醇為提取劑，結(jié)合單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化水翁花多酚提取條件，并研究水翁花多酚的抗氧化活性和抑菌活性，以期為水翁花的進一步研究和應(yīng)用提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

水翁花蕾粉末[市售水翁花蕾，產(chǎn)于廣西，粉碎過0.250 mm（60目）篩]；沒食子酸（HPLC≥98%）、無水碳酸鈉、福林酚、維生素C、碳酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀、DPPH等：上海源葉生物科技有限公司；ABTS（上海阿拉丁生化有限公司）；無水乙醇（麥克林生化科技有限公司）。試驗所用試劑均為分析純級別以上。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為實驗室前期保存菌株，LB液體培養(yǎng)基（滅菌）自配制。

1.2 儀器與設(shè)備

萬分之一電子天平（BSA 224S，德國賽多利斯公司）；超聲波清洗機（SB-5200DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（HEI-VAP，德國Heidolph公司）；酶標儀（MULTISKAN GO，美國ThermoFisher公司）；超凈臺（VS-840K-U，蘇凈安泰設(shè)備有限公司）。

1.3 方法與步驟

1.3.1 標準曲線的繪制

參考文獻[12]稍作修改，采用福林-酚法繪制沒食子酸標準曲線，用于測定提取物中多酚含量。稱取5 mg沒食子酸標準品，加蒸餾水定容，配成1 mg/mL標準溶液待用。將上述1 mg/mL沒食子酸溶液稀釋至40，60，80，100和120 μg/mL。取200 μL不同濃度沒食子酸溶液分別與100 μL福林酚（10%，V/V）混合作用5 min，加入100 μL 7.5% Na2CO3溶液，混合均勻，于室溫閉關(guān)顯色30 min，測定其波長765 nm處的吸光度，平行重復(fù)3次。以沒食子酸終濃度為橫坐標，波長765 nm處吸光度為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線。

1.3.2 多酚提取及含量測定

以粉碎后過0.250 mm（60目）篩水翁花蕾粉末為原材料，60%乙醇為提取劑，使其料液比為1∶60（g/mL），超聲（60 ℃，200 W）60 min提取水翁花多酚。離心（4000 r/min，10 min）得多酚粗提液，取200 μL上清液于1.5 mL離心管中，按照繪制標準曲線方法，測定粗提液波長765 nm處吸光度，每個樣品重復(fù)3次，并按式（1）計算多酚含量。

式中：c為水翁花多酚提取液質(zhì)量濃度，μg/mL；n為水翁花多酚提取液的稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為水翁花蕾粉末質(zhì)量，mg。

離心收集上清液，沉淀用無水乙醇洗滌3次，離心合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)上清液中無水乙醇，得高濃度水翁花多酚溶液，取少量稀釋一定比例，測定其多酚含量，并保存于4 ℃，用于后續(xù)抗氧化和抑菌活性測定。

1.3.3 水翁花多酚體外抗氧化活性測定

1.3.3.1 ABTS+自由基清除活性測定

ABTS+自由基（ABTS+·）清除活性測定試驗，參照文獻[2]，并稍作修改進行。準確稱取3 mg ABTS二銨鹽，加蒸餾水（0.735 mL）配制7.4 mmol/L的ABTS二銨鹽儲備液。準確稱取5 mg過硫酸鉀，加蒸餾水（1.43 mL）配制13 mmol/L的過硫酸鉀儲備液。取等體積的ABTS二銨鹽儲備液和過硫酸鉀儲備液室溫避光混合作用1 h，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）將混合液適當(dāng)稀釋至波長734 nm處吸光度為0.7左右，此稀釋溶液即為ABTS+·工作液（僅限配制當(dāng)天使用）。準確移取800 μL上述ABTS+·工作液，分別與200 μL不同質(zhì)量濃度（0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10和0.05 mg/mL）的水翁花多酚-乙醇溶液混合，避光室溫作用30 min。使用維生素C作為陽性對照，無水乙醇作為樣品對照，去離子水作為空白對照。最后，通過全波段酶標儀測定樣品在波長734 nm處吸光度。ABTS+·清除率按式（2）計算。

式中：A0為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A1為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除活性測定

DPPH自由基（DPPH·）清除活性的測定方法，參照已報道文獻[13]，并稍作修改。準確稱取一定量DPPH固體于15 mL離心管中，加入無水乙醇充分振蕩搖勻，以配制0.1 mg/mL的DPPH溶液。取800 μL上述DPPH溶液分別與200 μL不同質(zhì)量濃度（0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10和0.05 mg/mL）的水翁花多酚-乙醇溶液混合，避光室溫作用30 min。使用維生素C作為陽性對照，無水乙醇作為樣品對照，去離子水作為空白對照。最后，通過全波段酶標儀測定樣品在波長519 nm處的吸光度。DPPH·清除率按式（3）計算。

式中：ADPPH為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A樣品為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.3.3 羥自由基清除活性測定

羥自由基（·OH）清除活性的測定試驗，參照王錦秀等[14]已報道方法進行，并稍作修改。配制不同質(zhì)量濃度（0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10和0.05 mg/mL）的水翁花多酚-乙醇溶液。準確移取200 μL不同濃度的水翁花多酚樣品溶液，分別加入160 μL FeSO4溶液（3.2 mmol/L）和160 μL H2O2溶液（18.2 mmol/L），振蕩混勻，室溫下避光作用10 min。加入480 μL水楊酸-乙醇溶液（3.6 mmol/L），振蕩混勻，室溫下避光作用30 min。使用維生素C作為陽性對照，無水乙醇作為樣品對照，去離子水作為空白對照。最后，通過全波段酶標儀測定樣品在波長510 nm處的吸光度。·OH清除率按式（4）計算。

式中：A0為不加樣品扣空白對照后的吸光度；A1為加樣品扣空白對照后的吸光度。

1.3.4 水翁花多酚體外抑菌活性測定

取低溫保存大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min過夜振蕩活化。用LB液體培養(yǎng)基，將活化后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液適當(dāng)稀釋至A600等于0.2。用LB液體培養(yǎng)基，將高濃度水翁花多酚溶液分別稀釋至0，100，500和1000 μg/mL。準確吸取10 mL上述不同濃度水翁花多酚稀釋液，分別與0.1 mL的大腸桿菌或金黃色葡萄球菌稀釋菌液混合，混合液中乙醇含量均小于0.5%。其中，不含水翁花多酚處理組設(shè)為樣品對照組。細菌與多酚混合液于37 ℃，200 r/min分別振蕩培養(yǎng)0，3，6和9 h，取不同培養(yǎng)時間點菌液梯度稀釋1×102，1×104，1×106，1×108，1×1010和1×1012倍。取5 μL不同稀釋倍數(shù)菌液均勻涂于LB瓊脂糖平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)18 h，拍照并計算細菌菌落數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，標準誤差在數(shù)據(jù)圖中用誤差線表示；運用GraphPad Prism 5進行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線和多酚含量測定結(jié)果

2.1.1 標準曲線

沒食子酸標準曲線如圖1所示，其線性回歸方程為y=0.0128x-0.0906，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9979，R2接近1表明其具有較好的線性相關(guān)性，可作為定量測定標準用于多酚含量測定。圖中y軸為波長765 nm處吸光度，x軸為樣品質(zhì)量濃度（μg/mL）。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.1.2 多酚含量測定

運用1.3.2多酚提取率公式和2.1.1中線性回歸方程計算出水翁花多酚提取率，結(jié)果為0.95%±0.01%。

2.2 水翁花多酚體外抗氧化活性結(jié)果分析

有研究報道表明，自由基與如腫瘤、心腦血管疾病、阿爾茲海默病、糖尿病等許多疾病的發(fā)生有關(guān)[7,15]。隨著對自由基深入研究和認識，大眾逐漸意識到清除體內(nèi)多余自由基的重要性，這將有益于預(yù)防和治療某些疾病。

2.2.1 ABTS+自由基清除率測定

ABTS與過二硫酸鉀反應(yīng)，可生成在波長734 nm處有較強吸收峰的ABTS+·，通過測定波長734 nm處吸光度測定其濃度。當(dāng)抗氧化物質(zhì)加入時，ABTS+·工作液在波長734 nm的吸光度將減小，從而判斷其對ABTS+·清除活性，該方法常被用于植物（或中草藥抽提物）等的抗氧化能力檢測[2]。水翁花多酚提取物對ABTS+·自由基清除率測定結(jié)果如圖2（A）所示。結(jié)果表明，水翁花多酚質(zhì)量濃度在10～80 μg/mL時，其對ABTS+·清除率由12.09%增加至90.22%。在同等濃度范圍內(nèi)，對照組維生素C對ABTS+·清除率由68.4%增加至100%。從試驗結(jié)果可以看出，低濃度時水翁花多酚對ABTS+·清除率不如維生素C，但當(dāng)其質(zhì)量濃度達70 μg/mL以上時其對ABTS+·清除率與維生素C相當(dāng)，表明水翁花多酚具有較強的ABTS+·清除能力。此外，已有文獻[2]報道，酶提法所得水翁花總黃酮亦具有較好的抗氧化能力，溶液質(zhì)量濃度750 μg/mL時，其對應(yīng)的ABTS+·清除率為70.6%±3.0%。

圖2 水翁花多酚對ABST+自由基的清除活性（A）、對DPPH自由基的清除活性（B）和對羥基自由基的清除活性（C）

2.2.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基是一種N原子上有成單電子的活潑自由基，其紫色醇溶液在波長519 nm處有較強吸收峰，遇到抗氧化劑時，隨著DPPH自由基被清除，其溶液顏色逐漸變淡，波長519 nm處吸光度也隨之減小，因此可用于抗氧化劑抗氧化能力定量分析[16-17]。水翁花多酚提取物對DPPH·清除率的測定結(jié)果如圖2（B）所示。結(jié)果表明，水翁花多酚質(zhì)量濃度10～80 μg/mL時，其對DPPH· 清除率由25.15%增加至94.01%。在同等濃度范圍內(nèi)，對照組維生素C對DPPH·清除率由66.27%增加至96.53%。從試驗結(jié)果可以看出，當(dāng)水翁花多酚質(zhì)量濃度為10～50 μg/mL時，隨著多酚濃度的增大，DPPH·清除率快速升高。水翁花多酚質(zhì)量濃度達到50 μg/mL以上時，隨著多酚濃度的增大，DPPH·清除率升高速率減緩，且其對DPPH·清除能力與同濃度的維生素C相當(dāng)。研究表明水翁花多酚對DPPH·有很強的清除活性。羅清等[18]研究不同極性溶劑作為提取劑，獲得的水翁花提取物對DPPH·清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)石油醚提取物的抗氧化能力最強，提取物質(zhì)量濃度30 μg/mL時，其DPPH·清除率達79.69%，該結(jié)果優(yōu)于此次試驗，考慮原因可能是石油醚提取物中有抗氧化能力優(yōu)于多酚的物質(zhì)。

2.2.3 羥自由基清除率測定

羥自由基具有極強的得電子能力也就是氧化能力，作為一種常見的自由基，可從DNA、細胞膜等方面損害生物體[19]。水翁花多酚提取物對·OH清除率的測定結(jié)果如圖2（C）所示，質(zhì)量濃度10～80 μg/mL時，水翁花多酚與維生素C表現(xiàn)出較為接近的·OH清除率能力，且隨著抗氧化劑水翁花多酚或維生素C濃度的增大，·OH清除率變化不大，水翁花多酚·OH清除率由30.51%增加至32.72%，維生素C的·OH清除率由37.30%增加至37.82%。試驗表明水翁花多酚具有一定的·OH清除能力，但與結(jié)果2（A、B）相比可知，相較于·OH自由基，同等質(zhì)量濃度下水翁花多酚具有更強的ABTS+·和DPPH·清除能力。

2.3 水翁花多酚體外抑菌活性

已有報道[20]顯示，水翁花具有一定抑菌作用，其常見對化膿性球菌和腸道致病菌均具有較強的抑制作用，但是對于水翁花提取物的抑菌活性研究鮮少報道。為研究水翁花多酚的抑菌活性，體外將不同濃度的水翁花多酚分別與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時間間隔點取少量菌液梯度稀釋，將細菌稀釋液涂板繼續(xù)培養(yǎng)18 h，拍照記錄各處理組同一稀釋倍數(shù)下（不同培養(yǎng)間隔時間點所選取拍照記錄菌落數(shù)的稀釋倍數(shù)不相同，選取原則為各處理組均具有細菌菌落的最大稀釋倍數(shù)）細菌菌落圖片，相關(guān)結(jié)果如圖3（上，大腸桿菌）和圖4（上，金黃色葡萄球菌）所示。結(jié)果表明，水翁花多酚質(zhì)量濃度達500 μg/mL以上時，水翁花多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌活性，且其抑菌能力具有濃度依賴性，濃度越高抑菌效果越明顯。此外，通過計算不同培養(yǎng)時間間隔點各處理組菌液的菌落總數(shù)（CFU），定量分析水翁花多酚質(zhì)量濃度和共培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響，結(jié)果如圖3（下，大腸桿菌）和如圖4（下，金黃色葡萄球菌）所示。水翁花多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果具有時間依賴性，隨著共培養(yǎng)時間的延長，抑菌效果越明顯。與對照組相比，水翁花多酚在與大腸桿菌共培養(yǎng)9 h時，對照組與不同質(zhì)量濃度（100，500和1000 μg/mL）水翁花多酚處理組的CFU比值分別為102，107和108。與對照組相比，水翁花多酚在與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)9 h時，對照組與不同質(zhì)量濃度（100，500和1000 μg/mL）水翁花多酚處理組的CFU比值分別為100，108和109。綜上所述，水翁花多酚質(zhì)量濃度500 μg/mL時，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出顯著抑菌活性，且其抑菌效果具有濃度和時間依賴性。

圖3 水翁花多酚對大腸桿菌的抑制作用

圖4 水翁花多酚對金黃色葡萄球菌的抑制作用

3 結(jié)論

運用超聲波輔助提取法提取水翁花多酚，在乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶60（g/mL）、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃時，水翁花多酚提取率為0.95%±0.01%。水翁花多酚質(zhì)量濃度80 μg/mL時，其表現(xiàn)出與維生素C相近的ABTS+、DPPH和羥自由基清除能力，表明水翁花多酚具有較強的抗氧化活性。此外，水翁花多酚質(zhì)量濃度達500 μg/mL以上時，其可明顯抑制革蘭陰性（大腸桿菌）和革蘭陽性（金黃色葡萄球菌）細菌生長，表明水翁花多酚具有一定的抑菌活性。試驗結(jié)果為進一步推廣和開發(fā)水翁花應(yīng)用價值提供參考依據(jù)。