云芝多糖對(duì)腸道益生菌生長的影響

陳镕坤，池延添，易永旺，鄧柳鴻，曾亮，魏奇

1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（寧德 352100）；2.福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地（寧德 352100）

益生菌是腸道中的優(yōu)勢菌群。益生菌可以幫助消化食物，抑制腸道內(nèi)有害細(xì)菌的生長，從而維持腸道的微生態(tài)平衡[1-3]。青春雙歧桿菌是一種有益菌，存在于人體的腸道內(nèi)，具有預(yù)防便秘和恢復(fù)腸道菌群平衡等作用[4]。酪丁酸梭菌能夠促進(jìn)腸道內(nèi)其他有益菌的生長，具有修復(fù)損傷的黏膜、抑制病原菌的生長和恢復(fù)腸道菌群平衡的作用[5]。嗜熱鏈球菌是酸奶制作的主要菌種之一，可以消化乳糖，對(duì)胃酸和膽鹽具有耐受性，能夠有效改善酸奶品質(zhì)和機(jī)體腸道微環(huán)境[6]。植物乳桿菌是食品中常用的乳酸菌之一，能夠大量產(chǎn)酸，已有研究表明植物乳桿菌具有免疫調(diào)節(jié)、抑制致病菌生長和維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用[7]。由此可知，益生菌對(duì)保持腸道正常微生物菌群平衡具有重要意義。

云芝（Coriolus versicolor）是一種大型真菌，富含多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和多種無機(jī)鹽等物質(zhì)。云芝的藥用價(jià)值高，具有降血脂、抗腫瘤、抗衰老、免疫增強(qiáng)和保肝等功效[8-10]。柴新義等[11]研究發(fā)現(xiàn)，云芝多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黃曲霉菌具有抑制作用。王星光等[12]研究發(fā)現(xiàn)，云芝糖肽具有抗腫瘤的作用，其對(duì)抗腫瘤藥物具有增敏的作用。王康樂等[13]研究發(fā)現(xiàn)云芝多糖具有保肝作用，云芝多糖能夠降低酒精性肝損傷小鼠血清中總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、甘油三酯和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平。

研究以云芝多糖為原料，探究云芝多糖對(duì)腸道益生菌生長的影響，并且評(píng)估云芝多糖對(duì)4種益生菌在體外模擬胃液和體外模擬腸液中的影響。該研究能夠?yàn)樵浦ザ嗵堑倪M(jìn)一步開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

云芝多糖（上海源葉生物科技有限公司）；胰蛋白酶、胃蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）菌株（ATCC8014）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）菌株（ATCC14485）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）菌株（ATCC25755）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）菌株（ATCC15703）：廣東省微生物菌種保藏中心；TPY肉湯、TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基（不含瓊脂）、MC培養(yǎng)基、MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基、丁酸梭菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HFsafe1200LC生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；UPT-ⅠⅠ-20T實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；DHP-9272A電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海飛越實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌液的制備

分別取單環(huán)菌液（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基、TPY肉湯、MC培養(yǎng)基（不含瓊脂）和MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代后得到相應(yīng)活化的菌株。每次試驗(yàn)前，分別取100 μL上述4株菌液（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至不同的液體培養(yǎng)基。將接種后的菌液置于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h。

2.2 生長試驗(yàn)

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至液體培養(yǎng)基中（CK）與添加2%云芝多糖的液體培養(yǎng)基。將接種后的樣品保存于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，按預(yù)設(shè)時(shí)間間隔取樣，以測定其生長濃度。樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.3 體外胃腸模擬液的制備

采用0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.4）配制不同的液體培養(yǎng)基，用鹽酸將液體培養(yǎng)基的pH調(diào)至3，在121 ℃條件下高溫高壓處理15 min。分別取0.5 g胃蛋白酶加入100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中，即得體外模擬胃液。

采用0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.4）配制不同的液體培養(yǎng)基，用鹽酸將液體培養(yǎng)基的pH調(diào)至7，在121 ℃條件下高溫高壓處理15 min。分別取1 g胰蛋白酶加入100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中，即得體外模擬腸液。

2.4 云芝多糖對(duì)4種益生菌的影響試驗(yàn)

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至液體培養(yǎng)基中（CK）與分別添加0.5%，1%和2%云芝多糖的液體培養(yǎng)基。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板中，其中，TPY瓊脂培養(yǎng)基用于測定青春雙歧桿菌菌落數(shù)，MC培養(yǎng)基用于測定嗜熱鏈球菌菌落數(shù)，MRS培養(yǎng)基用于測定植物乳桿菌菌落數(shù)，丁酸梭菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基用于測定酪丁酸梭菌菌落數(shù)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.5 云芝多糖對(duì)益生菌在模擬胃液中的耐受性試驗(yàn)

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至體外模擬胃液中（CK）與添加2%云芝多糖的體外模擬胃液。將接種后的樣品保存于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)0 h和3 h。樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.6 云芝多糖對(duì)益生菌在模擬腸液中的耐受性試驗(yàn)

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至體外模擬腸液中（CK）與添加2%云芝多糖的體外模擬腸液。將接種后的樣品保存于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)0 h和3 h。樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基平板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為3次，并且取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。顯著性分析采用SPSS 20軟件，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 云芝多糖含量對(duì)4種益生菌生長的影響

由圖1可知，2%的云芝多糖能夠顯著增加青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量（P＜0.05）。與CK組相比，隨著云芝多糖添加量的增加，青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量也隨之增加。與CK組相比，云芝多糖的添加量越高，酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量也越多。2%的云芝多糖能夠顯著增加酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量（P＜0.05）。云芝多糖添加量為2%時(shí)，植物乳桿菌的菌落數(shù)量與云芝多糖添加量為0.5%和1%的植物乳桿菌的菌落數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。云芝多糖不同的添加量（5%，1%和2%）的嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量與CK組沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 云芝多糖含量對(duì)四種益生菌生長的影響

3.2 4種益生菌的生長曲線

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為0～7 h時(shí)，云芝多糖處理組中的酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量與CK組中酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量相近。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為12～24 h時(shí)，云芝多糖能夠增加酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為0～24 h時(shí)，云芝多糖處理組嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量與CK組的嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量相近，云芝多糖對(duì)嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量沒有顯著影響（P＞0.05）。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為0～24 h時(shí)，云芝多糖處理組與CK組中植物乳桿菌的菌落數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為0～1 h時(shí)，云芝多糖處理組中青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量與CK組的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量相近。與CK組相比，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為3～24 h時(shí)云芝多糖能夠增加青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量。

圖2 酪丁酸梭菌的生長曲線

圖3 嗜熱鏈球菌的生長曲線

圖4 植物乳桿菌的生長曲線

圖5 青春雙歧桿菌的生長曲線

3.3 云芝多糖對(duì)4種益生菌在模擬胃液中的影響

青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌在體外模擬胃液中耐受性結(jié)果如表1所示。在培養(yǎng)時(shí)間為0 h時(shí)，添加云芝多糖與未添加云芝多糖處理組的青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌的菌落數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05）。由此可知，初始接種的菌落數(shù)量相近。青春雙歧桿菌在未添加云芝多糖的模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，其菌落數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。云芝多糖處理組的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量顯著高于未添加云芝多糖處理組的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量（P＜0.05），并且云芝多糖處理組中的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量與0 h沒有顯著差異（P＞0.05）。嗜熱鏈球菌在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后未能檢測出。模擬胃液中添加云芝多糖對(duì)植物乳桿菌和酪丁酸梭菌的生長影響不大。由此可知，云芝多糖能夠增強(qiáng)青春雙歧桿菌對(duì)體外模擬胃液的耐受性，而對(duì)植物乳桿菌、嗜熱鏈菌和丁酸梭菌的改善作用不顯著（P＞0.05）。

表1 4種益生菌在云芝多糖的模擬胃液中的生長情況

3.4 云芝多糖對(duì)4種益生菌在模擬腸液中的影響

青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌在體外模擬腸液中耐受性結(jié)果如表2所示。青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌在模擬腸液中培養(yǎng)3 h，其菌落數(shù)量與0 h沒有顯著差異（P＞0.05）。模擬腸液中添加云芝多糖對(duì)青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。由此可知，模擬腸液中添加云芝多糖對(duì)植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和丁酸梭菌的生長無明顯的促進(jìn)作用。

表2 4種益生菌在云芝多糖的模擬腸液中的生長情況

4 結(jié)論

云芝多糖具有很高的藥用價(jià)值，已有研究表明云芝多糖具有保肝、抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能等功效[14-17]。云芝多糖可以作為腸道內(nèi)的益生菌的營養(yǎng)來源，并且能夠促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長和繁殖。云芝多糖與益生菌結(jié)合后，可以提高益生菌的鹽耐性和酸耐性，在腸道微生物平衡中起到積極作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)云芝多糖能夠增加青春雙歧桿菌和酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量。由此可知，云芝多糖可通過促進(jìn)青春雙歧桿菌和酪丁酸梭菌的生長和繁殖，從而維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。通過模擬胃腸液試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)云芝多糖能夠增強(qiáng)青春雙歧桿菌在體外模擬胃液中的耐受性。此次研究能夠?yàn)樵浦ザ嗵窍嚓P(guān)功能性保健品和食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。當(dāng)然，此次研究關(guān)于云芝多糖調(diào)節(jié)腸道微生物作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。