桂西地區農產品中農藥殘留降解方法的分析及建立

朱峻逸，楊水平

1.百色市食品藥品檢驗所（百色 533000）；2.百色市森林保護檢疫站（百色 533000）

農藥在改善人類生活方面起到重要作用。但是，現今農藥的濫用現象也愈發嚴重，我國是農藥使用大國，農藥防治面積也居世界前列[1]。我國農藥的使用結構不合理，主要體現在殺蟲劑、有機磷殺蟲劑以及甲胺磷等高毒有機磷殺蟲劑的各自占比均高于70%[2]，加上監管不力等多種原因，農藥殘留對人體健康造成很大威脅[3-6]。

農藥在自然環境中完全降解需要時間很長，有些農藥甚至根本不能自然降解[7]，農藥會在身體中沉積，不僅給人體健康帶來潛在威脅，還會誘發心腦血管病等一系列慢性病癥，這些都與農藥殘留有關系，甚至還會傳給下一代，危及子孫后代的身體健康[8-11]。

現有農藥殘留降解的方法存在效率低、易引起產品營養損失等缺點，并且對品質造成影響[12-18]。桂西地區由于當地的氣候和地理特征的特殊性，農產品和農藥的使用也與其他地方有一定的差異性，因此，亟須對桂西地區的食用農產品中農藥的降解方法進行總體研究，同時對降解效果做出客觀評價，給社會及百姓提出最高效、最便捷且用時最短的降解方法。

高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）作為近幾年興起的分析檢測技術，因其具有分析范圍廣等優勢，被廣泛應用于化學和測繪科學技術等領域復雜有機混合物的各種檢測中[19-21]。桂西地區食用農產品和環境中的農藥殘留情況尚未有較為有效的降解方法，而且對于使用高效液相色譜-質譜聯用法（HPLCMS）檢測桂西地區食用農產品中農藥殘留的方法還需要進行相應優化，這種優化處理的方法在國內尚數首例。因此，試驗向15類食用農產品中加入11種不同濃度農藥，利用不同物理、化學、微生物等方法進行降解處理，采用高效液相色譜-質譜聯用法（HPLCMS）檢測其中農藥殘留并進行相應研究討論，分析篩選出最高效、最便捷且用時最短的農藥殘留降解方法，為更好降解農藥殘留提供相關科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent Technologies 6460高效液相色譜-質譜聯用儀（HPLC-MS，美國Agilent公司）；XS205DU型分析電子天平（美國Mettler Toledo公司）；TXB622L型電子天平（株式會社島津制作所）；ST4R PLUS型冷凍高速離心機（美國ThermoFisher Scientific公司；PN545-10000-00-2型渦旋混合器（德國海多爾夫公司）；SK8200HP型超聲機（上海科導超聲儀器有限公司）；超純水機（明澈Dirext-Q3，艾威儀器科技有限公司）；JP39V-1300型組織搗碎機（浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司）；SHA-B型水浴恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；HW-I型紅外線滅菌器（山東博科科學儀器有限公司）；BK-UVC-30A型紫外線殺菌燈（山東博科科學儀器有限公司）。

敵敵畏、苯醚甲環唑、酰烯嗎啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基異柳磷、甲霜靈、甲胺磷、多菌靈、辛硫磷標準品（質量濃度均為100 μg/mL）；無水硫酸鎂（≥98.0%）；氯化鈉（≥99.5%）；無水碳酸鈉（≥99.8%）；碳酸氫鈉（≥99.8%）；高錳酸鉀（≥99.5%）；檸檬酸鈉，二水合物（≥99.0%）；檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（≥99%）；甲酸（色譜純，≥98.0%）；乙腈（色譜純，≥99.95%）；雙氧水（優級純，≥30%）；鹽酸（優級純，10 mol/L）；氫氧化鈉（≥96%）；硫酸鐵（≥99%）。

枯草芽孢桿菌（≥4.0億/g活菌）；細黃鏈霉菌（≥2.0億/g活菌）；哈慈木霉菌淡紫孢菌（≥5.0億/g活菌）。

乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）固相萃取小柱（批號：M00076）；石墨化炭黑（GCB）固相萃取小柱（批號S196086001）；微孔濾膜（有機相，13 mm×0.22 μm）。

1.2 標準品溶液和空白溶液的制備

敵敵畏、苯醚甲環唑、酰烯嗎啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基異柳磷、甲霜靈、甲胺磷、多菌靈、辛硫磷標準溶液（1 μg/mL）制備：精準吸取1 mL的100 μg/mL標準品于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

空白溶液制備：乙腈作為空白溶液。

1.3 材料及其制備

15類食用農產品。其中，豆芽選用黃豆芽，鱗莖類蔬菜選用韭菜，鮮食用菌選用金針菇；蕓薹屬類蔬菜選用結球甘藍，葉菜類蔬菜選用大白菜，茄果類蔬菜選用茄子，瓜類蔬菜選用黃瓜，根莖類蔬菜選用胡蘿卜，薯芋類蔬菜選用馬鈴薯，水生類蔬菜選用蓮藕，豆類蔬菜選用菜豆，仁果類水果選用蘋果，核果類水果選用桃，柑橘類水果選用橙，漿果和其他小型水果選用葡萄。果蔬購于桂西地區各地不同的農貿市場和超市，食用菌、水生蔬菜、莖菜類蔬菜、豆類蔬菜、核果類水果、瓜類蔬菜及其他蔬菜和水果取樣量及處理方法均參考GB 23200.121—2021《食品安全國家標準植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定液相色譜-質譜聯用法》[22]中6.1中試樣制備的相關內容，制備后充分混勻，用四分法取一部分樣品或全部用組織搗碎機勻漿后，轉入聚乙烯瓶中備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備

使用天平稱取10 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈及1顆陶瓷均質子，劇烈振蕩1 min，加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉二水合物、0.5 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，劇烈振蕩1 min后按4200 r/min離心5 min。定量吸取上清液，用PSA固相萃取小柱凈化，加入150 mg無水硫酸鎂后再用GCB固相萃取小柱凈化，凈化后的液體裝入50 mL離心管中，渦旋混勻1 min，按4200 r/min離心5 min，吸取上清液過微孔濾膜后直接在HPLC-MS上進樣分析檢測。同時采用相同的方法處理空白溶液制備成為樣品空白。

1.4.2 加標樣品制備

使用天平分別稱取15類食用農產品，每類均稱取10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，分別加入0.2，0.4和0.8 mL敵敵畏、苯醚甲環唑、酰烯嗎啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基異柳磷、甲霜靈、甲胺磷、多菌靈、辛硫磷標準溶液，加入10 mL乙腈及1顆陶瓷均質子后，劇烈振蕩1 min，備用。

1.4.2.1 加標樣品進行化學降解處理

在每類加標處理后的樣品中分別加入1 mL氫氧化鈉溶液（2 mol/L）、1 mL鹽酸溶液（2 mol/L）、1 mL雙氧水（30%）、1 mL氯化鈉溶液（2 mol/L）、2 g碳酸氫鈉、2 g碳酸鈉、2 g高錳酸鉀、2 g硫酸鐵，劇烈振蕩1 min，靜置1 d后，參照1.4.1的后續處理方法進行。

1.4.2.2 加標樣品進行物理降解處理

將每類加標處理后的樣品分別放入超聲機，超聲6 h，放入陽光下照射8 h，放入紫外光下照射8 h，放入紅外光下照射8 h，放入恒溫水浴振蕩器中，在80℃的水加熱8 h，劇烈振蕩1 min，靜置1 d后，繼續參照1.4.1的后續處理方法進行。

1.4.2.3 加標樣品進行微生物降解處理

在每類加標處理后的樣品中分別加入5 g枯草芽孢桿菌、5 g細黃鏈霉菌和5 g哈慈木霉菌淡紫孢菌，劇烈振蕩1 min，放入28±2 ℃培養箱培養48 h后，繼續參照1.4.1的后續處理方法進行。

1.4.3 液相色譜條件

色譜柱（Agilent，C18，2.1 mm（內徑）×100 mm，粒徑1.8 μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL；流動相梯度條件見表1。

1.4.4 質譜條件

離子源類型為電噴霧離子源；掃描方式為正離子（electrosprayionization，ESI+）全掃描模式；電噴霧電壓為正離子4000 V；離子源溫度320 ℃；霧化氣32 psi；輔助加熱器15 psi；霧化氣流速10 L/min；輔助加熱氣流速3 L/min；輔助加熱氣溫度300 ℃；碰撞氣為高純氮；多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）：每種農藥分別選擇2個子離子。所有檢測的子離子按照出峰順序，分時段分別檢測。不同農藥選擇的反應監測母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表2。

表2 11種農藥的MRM質譜采集參數

精確吸取標準溶液，用空白溶液將標準溶液稀釋成質量濃度為0.005，0.010，0.020，0.050，0.100和0.200 mg/L的標準工作溶液，在上述高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）工作參數條件下，依次使用該方法對標準工作溶液、樣品空白溶液、樣品處理后溶液、加標樣品處理后溶液、加標樣品進行降解處理后的溶液分別進行測定，由HPLC-MS工作站軟件分析相關數據，儀器會自動繪制各個農藥的標準曲線，并且計算出樣品、加標樣品及加標降解后樣品中各個相對應的農藥含量。

2 結果與分析

2.1 前處理優化

2.1.1 提取凈化方式的優化

通過比對發現，普通高速離心會產生高溫從而影響農藥含量，而采用低溫高速離心提取的方法，能有效避免這種情況，因此，選擇采用低溫高速離心的方法提取樣品。另外，發現自行購買乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠和石墨化炭黑進行凈化容易帶入雜質，而且由于每次使用量會有差異，這就造成試驗結果的不穩定，相反成品的固相萃取小柱則能很好地避免這些問題，讓結果更加可靠，同時也更加方便快捷。通過購買多家生產的固相萃取小柱進行試驗，根據試驗結果的穩定性、凈化效果、雜質帶入情況、凈化效率等多方面因素的比較，最終選擇天津博納艾杰爾科技有限公司生產的乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）固相萃取小柱和廣州沃恩生物科技有限公司生產的石墨化炭黑（GCB）固相萃取小柱進行樣品的凈化。

2.1.2 試驗條件的優化

2.1.2.1 色譜條件的優化

對流動相通過對比發現，在有機相中，乙腈作為流動相相比于甲醇分離農藥更有優勢，保留時間相對更短，分離效率更高，分離峰形更好，這說明在乙腈中農藥的響應效率比在甲醇中更高。因此，有機相選擇乙腈不僅響應更好，而且更節約時間。在水相中，一定比例的酸性水相有利于促進化合物的分離，因此，對不同濃度甲酸水溶液、甲酸銨水溶液及其甲酸銨-甲酸水溶液的分離情況進行考察，結果發現0.1%甲酸水的水相和乙腈的有機相作為流動相時，分離農藥效果最好，化合物能明顯分開且峰形較好，分離效率較高，保留時間相對較短，且分離度均能達到要求。綜上所述，選擇0.1%甲酸水和乙腈作為流動相。

2.1.2.2 質譜條件的優化

用1.2的標準溶液，上機測試，同時參考GB 23200.121—2021《食品安全國家標準 植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質譜聯用法》[22]中質譜參數，11種農藥均采用電噴霧離子源的類型，進行正離子（electrosprayionization，ESI+）全掃描模式，根據11種農藥的化學結構及其特性，采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）的檢測模式，在保證檢測靈敏度、定量準確性、信號響應值，結合不同去簇電壓和碰撞氣能量下，不同農藥的正離子全掃描模式質譜圖，同時利用軟件自動調諧優化功能，確定質譜相關參數見表2。

2.2 線性關系考察

HPLC-MS的動態線性范圍較寬，能夠達到7個數量級。試驗中在優化后的儀器條件下采集一系列待測農藥標準溶液，由儀器自動繪制出標準曲線并給出線性關系。從結果中可以看出11種農藥的標準曲線線性關系良好，相關系數r均≥0.996，見表3。

表3 標準曲線方程、相關系數、線性范圍、定量限與信號噪聲比

表4 加樣回收率及相對標準偏差（n=6）

2.3 定量限、線性關系、回收率和精度度的考察

使用移液槍分別精密量取0.1 mL標準溶液（1 μg/mL）加入1.4.1的空白對照溶液中，按1.4.3和1.4.4的條件進行樣品測定，以其信號噪音比是否大于10來判定能否作為定量限，方程中Y代表含量，X代表樣品量，結果見表3。

2.4 精密度

使用移液槍量取1.4.4配制的質量濃度5 μg/L的標準品溶液，連續進樣測定6次，計算出11種農藥6次測得的質量濃度的SRSD。結果顯示，11種農藥相對強度的SRSD分別在0.61%～4.26%（n=6）之間，表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性

首先使用移液槍精密吸取待測樣品（白菜）溶液，分別于0，2，4，8，12和24 h后進樣測定計算各種農藥6次質量濃度的SRSD分別在0.57%～3.95%（n=6）之間，表明待測樣品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

2.6 重復性

使用分析天平精密稱取食用農產品樣品（白菜），共6份并分別做好標記，按1.4.1的方法制備供試品溶液，進樣測定計算6份樣品中含有的11種農藥，11種農藥質量濃度的SRSD分別在0.71%～3.85%（n=6）之間，表明試驗方法重復性好。

2.7 加樣回收率

使用按照1.4.2方法制備的加標樣品（白菜），共6份，同法制備試劑空白溶液，測定各個農藥含量，計算回收率，平均加樣回收率為95.45%～100.19%，表明該測定方法準確度良好，符合農藥測定要求。其中，加標量0.8 mL的加標樣品的結果見表2。

2.8 樣品加標降解后測定結果

分別用天平稱取約10 g 15類食用農產品，每類36份，每2份作為1組平行樣品，其中2份作為空白樣品對照，另外34份按照1.4.2的方法制備成加標溶液，將2份樣品作為加標樣品對照，另外32份樣品按照1.4.2.1、1.4.2.2和1.4.2.3的方法降解，分別測定多菌靈等11種農藥的含量。檢測結果已通過系統將空白樣品中的農藥含量扣除，所以，默認空白樣品中不含有農藥殘留。15類食用農產品加標后就用不同方法進行降解，結果顯示，15類農產品中農藥平均被降解率分別為超聲降解（10.52%～10.92%），陽光照射降解（0.23%～0.61%），紫外光照射降解（0.52%～0.82%），紅外光照射降解（0.51%～0.70%），水浴加熱降解（0.39%～0.58%），氫氧化鈉降解（86.39%～89.48%），鹽酸降解（58.85%～62.64%），雙氧水降解（72.64%～76.17%），氯化鈉降解（0.08%～0.39%），碳酸氫鈉降解（58.68%～62.54%），碳酸鈉降解（34.41%～38.91%），高錳酸鉀降解（69.37%～73.05%），硫酸鐵降解（38.64%～42.87%），枯草芽孢桿菌降解（22.46%～26.31%），細黃鏈霉菌降解（31.13%～35.48%），哈慈木霉菌淡紫孢菌降解（22.12%～25.58%）。其中，茄子加標后被降解的相關參數見表5。

表5 茄子中農藥被降解后的含量測定結果及農藥被降解率（n=18）

X0～X17分別為空白樣品、加標樣品、加標后超聲降解樣品、加標后陽光降解樣品、加標后紫外光降解樣品、加標后紅外光降解樣品、加標后水浴加熱降解樣品、加標后氫氧化鈉（2 mol/L）降解樣品、加標后鹽酸（2 mol/L）降解樣品、加標后雙氧水（30%）降解樣品、加標后氯化鈉（2 mol/L）降解樣品、加標后碳酸氫鈉降解樣品、加標后碳酸鈉降解樣品、加標后高錳酸鉀降解樣品、加標后硫酸鐵降解樣品、加標后枯草芽孢桿菌降解樣品、加標后細黃鏈霉菌降解樣品、加標后哈慈木霉菌淡紫孢菌降解樣品。

3 討論

采用高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）的檢測手段，在樣品前處理中采用低溫高速離心的方法提取樣品，有效解決普通高速離心產生高溫影響農藥含量的問題。另外，使用通過對比篩選好的成品固相萃取小柱來進行樣品凈化處理，有效降低自行填充凈化帶來的不穩定性及雜質的帶入，更好地保證檢測結果的穩定性。在儀器條件的優化中，通過對比、觀察、測試，選擇0.1%甲酸水-乙腈作為流動相，以及相應的色譜和質譜的參數條件，作為試驗的最優方法條件。相比于GB 23200.121—2021《食品安全國家標準植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定液相色譜-質譜聯用法》，試驗進行的優化條件更有利于快速準確地檢測出相應的結果，也很好地避免相關的試驗干擾因素，使得結果根據準確可靠。

試驗采用固相萃取+高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）檢測農藥，幾乎克服以往液相和氣相等分析方法的大多數缺點，不僅操作簡便，測定范圍廣，還可同時分析多種物質，且有速度快、靈敏性高、穩定性好、準確性高等特點，已在土壤、水源、農作物、食品、藥品、保健食品、化妝品及其相關產品的中農藥殘留控制、農藥分析及質量標準的制定等多方面進行廣泛應用[23-26]。試驗在15類食用農產品中加入敵敵畏、苯醚甲環唑、酰烯嗎啉、腈苯唑、氯吡脲、水胺硫磷、甲基異柳磷、甲霜靈、甲胺磷、多菌靈、辛硫磷11種標準溶液，使用物理降解方法（超聲、陽光照射、紫外光照射、紅外光照射、水浴加熱）、化學降解方法（氫氧化鈉、鹽酸、雙氧水、氯化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、高錳酸鉀、硫酸鐵）和生物降解方法（枯草芽孢桿菌，細黃鏈霉菌，哈慈木霉菌淡紫孢菌）對已加入標準溶液的食用農產品進行降解處理，采用固相萃取+高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）等檢測手段監測降解效果，通過最終的檢測數據可以看出，降解效果從優到差依次為氫氧化鈉＞雙氧水和高錳酸鉀＞鹽酸和碳酸氫鈉＞碳酸鈉、硫酸鐵、細黃鏈霉菌＞枯草芽孢桿菌、哈慈木霉菌淡紫孢菌＞超聲，陽光照射、紫外光照射、紅外光照射、水浴加熱、氯化鈉的降解效果幾乎沒有。由此可見，可將試驗結論運用到日常生活和環境的農藥殘留的降解中，減少農藥殘留對人體和環境的危害。另外，也可將優化的固相萃取+高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）的條件運用于其他領域的農藥檢測，充分發揮HPLC-MS在檢測中的優勢。

4 結論

通過試驗和討論內容可以得知，6類降解農藥殘留的方法在降解效果上有優劣之分，且在環境二次污染上又各有區別。所以，在日常生活和環境治理中，這6類降解農藥殘留的方法可以搭配使用，如物理方法搭配化學方法，物理方法搭配微生物方法，一種化學方法搭配另一種化學方法，一種微生物方法搭配另一種微生物等，這樣降解的效果就會更好，甚至達到事半功倍的效果。另外，在使用上述降解方法的時候，還應該考慮到環境因素，盡量選擇不會造成環境污染的方法。

試驗對農藥檢測方法的前處理和儀器條件進行優化，結果顯示：被測的11種農藥的線性關系良好，其線性范圍均為5～200 μg/L（r均≥0.996），定量限為0.01 mg/kg，信號噪聲比均大于10，精密度、穩定性、重復性試驗的SRSD≤4.26%，加標回收率為95.45%～100.19%（SRSD為0.52%～3.92%，n=6）。通過方法學考察結果顯示，高效液相色譜—質譜聯用法（HPLC-MS）操作簡單方便、效率高、分析速度快、靈敏度高，同時測定結果的精密度以及準確性較好。該法適合于桂西地區食用農產品中農藥殘留的測定，也可用于其他領域農藥殘留的檢測。通過測定結果，得到6類能有效降解桂西地區食用農產品中農藥殘留的降解方法，同時，這6類降解方法也可運用于日常生活和環境治理中，為保障人民身體健康發揮重要作用，但農藥殘留降解相關研究尚顯不足，有必要進行進一步探索和研究。