嬰幼兒配方食品中維生素D3檢測方法比較研究

周艷華，李濤 ，盧嵐，李萍

1.長沙環境保護職業技術學院（長沙 410004）；2.湖南省產商品質量檢驗研究院，食品安全監測與預警湖南省重點實驗室（長沙 410111）

維生素D具有類固醇的環戊氫稀環結構，是一種類固醇激素，對人體具有功能活性是維生素D2和維生素D3，經人體代謝為降鈣三醇后，與VDR結合發生作用[1-3]。維生素D主要功能為促進鈣吸收，調節鈣、磷代謝，促進骨骼健康[4-7]。此外，維生素D還在免疫調節[8]、心血管疾病[9]、炎癥反應[10]等方面發揮重要作用。維生素D在營養強化食品、保健食品、藥品和飼料中均應用廣泛[11-13]。研究表明維生素D對于嬰幼兒的過敏性疾病、自身免疫調節和呼吸系統疾病有重要影響[14-16]。由于維生素D獲取來源單一，嬰幼兒普遍存在維生素D缺乏[17]。嬰幼兒配方食品是嬰幼兒獲取維生素D的重要來源，產品通常營養強化維生素D3，且允許含量范圍相對較窄，因為過量攝入維生素D存在毒副作用[18-19]，因此準確檢測嬰幼兒配方食品中的維生素D具有重要意義。

食品中維生素D檢測方法主要有HPLC-UV法[20]、二維液相色譜法[21]、LC-MS/MS法[22-23]和免疫分析法[24]等，現有國家標準GB 5009.82—2016[25]中第三法為超高效液相聯用質譜法，第四法為正向制備-反向液相色譜法。嬰幼兒配方食品生產工藝復雜，應用現有檢測方法檢測嬰幼兒配方食品存在重復性差和取樣代表性不夠等問題，不適用于特殊醫學用途嬰幼兒配方食品檢測，現標準方法還存在操作復雜，試劑耗費量大且無法大批量樣品檢測等問題。此研究將著重于優化樣品前處理方法，解決樣品代表性不夠、無法批量檢測問題，應用于特殊醫學用途配方食品的檢測。對超高效液相聯用質譜法和液相色譜法進行了比較研究，評價兩種檢測方法的等效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉、嬰幼兒配方奶粉、特殊醫學用途配方食品、營養米粉（市售）；維生素D2（純度：99.3%）、維生素D3（純度：98.8%）：北京壇墨公司；維生素D3-d3（100 μg/mL，天津阿爾塔公司）；甲醇、乙酸銨、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇（色譜純）、氫氧化鈉、抗壞血酸、2,6-二叔丁基對甲酚、石油醚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantis型UPLC-MS/MS（美國賽默飛公司）；Vanquish液相色譜儀（美國賽默飛公司）；LC-6AD半制備液相色譜儀（日本島津公司）；BSA224S電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別精密稱取維生素D2和維生素D3，用無水乙醇溶解為質量濃度1.0 mg/mL的標準儲備液，參考國家標準附錄進行校正，并配制1.0 μg/mL的標準使用液和標準線性系列溶液。精密量取維生素D3-d3內標溶液，用甲醇配制1.0 μg/mL的內標使用液。

1.3.2 樣品前處理

試樣制備：準確稱取25 g樣品至250 mL玻璃瓶中，加入約200 g 45 ℃溫水，充分混合溶解（營養米粉需加入1.0 g淀粉酶，于60 ℃酶解30 min），準確稱取10.00 g（依據樣品質量和加水質量計算制備液中試樣質量）制備后的溶液至50 mL離心管。含試樣離心管中加入100 ng維生素D3-d3內標溶液或1.0 μg維生素D2溶液（液相色譜法），加入0.4 g抗壞血酸，并加入12 mL 0.2 g/100 mL BHT乙醇溶液和6 mL 50%氫氧化鉀（質量分數）溶液，渦旋30 s后放入恒溫振蕩器中，于80 ℃避光皂化30 min。

超高效液相聯用質譜法凈化：皂化液冷卻后加入20 mL正己烷，振蕩提取后離心，轉移上層清液并水洗至中性，上層正己烷提取液過硅膠固相萃取柱凈化液，凈化液氮吹至干，經1.0 mL甲醇復溶后過膜上機。

液相色譜法凈化：皂化液冷卻后加入20 mL石油醚，振蕩提取后離心取石油醚層，重復提取1次，合并石油醚層，石油醚提取液經水洗至中性，氮吹至干，用1.0 mL正己烷溶解，過膜后參考國家標準，用半制備高效液相凈化，凈化液氮吹至干，經0.5 mL甲醇復溶后過膜上機。

1.3.3 儀器條件

超高效液相聯用質譜法儀器條件：賽默飛GOLD C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱；流動相體系，流動相A為0.1%甲酸（含5 mmol/L乙酸銨溶液），流動相B為甲醇；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積為5 μL；梯度洗脫程序：0～2.0 min，90% B，2.0～3.0 min，90% B→100% B，3.0～7.0 min，100% B，7.0～7.1 min，100% B→90% B，7.1～10.0 min，90% B。在HESI離子源下，質譜參數見表1。

表1 維生素D3的質譜參數表

液相色譜法儀器條件：迪馬Diamonsil C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱；流動相體系，流動相A為水，流動相B為甲醇；流速0.8 mL/min；柱溫35℃；進樣體積為50 μL；等度洗脫程序：0～40.0 min，95% B，檢測波長：264 nm。

1.3.4 方法學驗證

在空白脫脂奶粉中添加適量濃度的維生素D3（超高效液相聯用質譜法添加水平為1.0 μg/100 g，液相色譜法添加水平2.0 μg/100 g），按照空白標準偏差法評估檢出限（LOD），即將空白樣品加入定量限濃度的加標樣品獨立測試10次，計算其檢測結果的標準偏差（S），3 s即為方法檢出限。在空白脫脂奶粉中加入一定濃度的維生素D3[超高效液相聯用質譜法添加水平為1.0，10和30 μg/100 g（n=6），液相色譜法添加水平為2.0，10和20 μg/100 g（n=6）]，測定結果并計算回收率和相對標準偏差值，研究方法準確度和精密度。

2 結果與分析

2.1 維生素D標準品色譜圖

配制標準溶液，按1.3.3小節儀器條件分別在超高效液相聯用質譜和液相色譜儀進樣，維生素D3液質定量離子色譜圖見圖1，維生素D2和維生素D3液相色譜圖見圖2。由圖1可知，液質聯用法檢測時維生素D3和維生素D3-d3保留時間一致，峰型與響應度均良好，維生素D3和其內標化學性質一致，可消除前處理操作的影響，也能降低液質檢測器帶來的基質效應，使得檢測結果準確可靠。由圖2可知，液相色譜法檢測維生素D3時，維生素D2作為內標，維生素D2和維生素D3分離度良好，不影響維生素D3的定性定量。嬰幼兒配方食品中營養強化維生素D時通常添加維生素D3，以維生素D2作為內標可保證定量結果準確的同時降低檢測成本。對比兩種方法可知，液質聯用法可在8 min內完成檢測，而液相色譜法需40 min才能完成檢測，液質聯用法更高效。

圖1 維生素D3標準溶液定量離子色譜圖

圖2 維生素D液相色譜圖

2.2 線性關系、檢出限和定量限結果分析

由表2可知：超高效液相聯用質譜法檢測維生素D3在20～400 μg/L內呈良好線性關系，相關系數R2=0.9987，檢出限（LOD）為0.264 μg/100 g，定量限（LOQ）為0.879 μg/100 g，液相色譜法檢測維生素D3在50～1000 μg/L內呈良好線性關系，相關系數R2=0.9998，檢出限（LOD）為0.405 μg/100 g，定量限（LOQ）為1.35 μg/100 g。對比兩種檢測方法可知，檢測維生素D3時液相色譜法檢測范圍更大，但檢出限和定量限高于超高效液相聯用質譜法，表明超高效液相聯用質譜法的靈敏度更高。

表2 維生素D3的線性、相關系數、檢出限和定量限

2.3 準確度和精密度結果分析

表3為超高效液相聯用質譜法檢測維生素D3的回收率與精密度，表4為液相色譜法檢測維生素D3的回收率與精密度。由表3可知：當維生素D3添加水平為1.0 μg/100 g時，回收率為93.2%，相對標準偏差SRSD為13.0%；當添加水平為5.0 μg/100 g時，回收率為88.0%，相對標準偏差SRSD為4.8%；當添加水平為10.0 μg/100 g時，回收率為97.6%，相對標準偏差SRSD為9.9%。由表4可知：當維生素D3添加水平為2.0 μg/100 g時，回收率為89.8%，相對標準偏差SRSD為3.8%；當添加水平為10.0 μg/100 g時，回收率為93.8%，相對標準偏差SRSD為2.0%；當添加水平為20.0 μg/100 g時，回收率為100.3%，相對標準偏差SRSD為3.5%。對比兩種檢測方法可知，采用超高效液相聯用質譜法和液相色譜法測定維生素D3在低、中、高三個添加水平下有良好的加標回收率和精密度，符合GB/T 27404—2008[26]中檢測方法確認技術要求。優化后前處理方法在保證樣品具有代表性的同時不影響檢測結果的準確度，結果表明檢驗方法準確可靠，滿足方法學要求。

表3 維生素D3回收率和精密度（超高效液相聯用質譜法）

表4 維生素D3回收率和精密度（液相色譜法）

2.4 不同檢測方法對比研究

從市場采購5份不同嬰幼兒配方食品，包括營養米粉、嬰幼兒配方奶粉和特殊醫學用途配方奶粉，樣品覆蓋所有嬰幼兒配方食品類別，運用超高效液相聯用質譜法和液相色譜法進行檢測，對比檢測結果，結果見表5。由表5可知，兩種檢測方法檢測蛋白深度水解配方奶粉的結果差異最小，SRSD為0.66%，檢測嬰兒配方奶粉的結果差異最大，SRSD為9.7%，結果符合GB/T 27404—2008[26]中檢測方法確認技術要求。

表5 嬰幼兒配方食品中維生素D3含量測定結果（n=6）

3 結論

優化了嬰幼兒配方食品中維生素D3的檢測方法，解決了現有標準中樣本代表性不夠，不能批量檢測的問題，并應用于營養米粉、嬰幼兒配方奶粉和特殊醫學用途配方奶粉的檢測。樣本采用大樣量稀釋復溶為液體乳狀態，保證了樣本的代表性，并采用小樣量皂化提取，可適用于批量檢測，節約了大量試劑，提高了檢驗效率。研究還比較了超高效液相聯用質譜法和液相色譜法的檢出限、定量限、線性范圍、回收率和精密度，結果均符合相關標準要求。運用超高效液相聯用質譜法和液相色譜法檢測了5種代表性嬰幼兒配方食品，維生素D3檢驗結果無顯著性差異，表明兩種方法的具有等效性，可應用于特殊醫學用途配方食品的檢測。超高效液相聯用質譜法較液相色譜法靈敏度更高，檢測效率更高，但維生素D3內標昂貴，液相色譜法需半制備液相，不同實驗室可以依據現有條件選擇方法進行嬰幼兒配方食品的檢測。研究表明維生素D對光照敏感[27]，為保證檢測結果準確性，樣品檢測全程應在無紫外線光下進行。