赤水河河源段魚類資源現狀調查

陳文善，陳泊霖，盧 群，劉建虎*，何 滔，楊 峰

(1.長江上游珍稀特有魚類國家級自然保護區云南管護局，云南 昭通 657000；2.西南大學水產學院，重慶 400715；3.樅陽南方材料有限公司，安徽 銅陵 246700)

生物通過產生糞便、尿液、唾液、皮膚細胞的方式將DNA排出或脫落到周圍環境中，這類大量存在于環境中的DNA片段總和被稱為環境DNA (Environmental DNA，eDNA)[6]。eDNA技術是指直接從水體、土壤、沉積物等環境樣本中提取DNA片段，然后通過DNA測序和qPCR等分子生物學檢測技術來定性或定量目標生物，從而確定目標生物在該環境中的分布及功能特征的研究方法。該方法應用在魚類資源調查上具有一定的創新性，調查過程不依賴動物樣本，不受禁捕的限制，可以大量采樣[7]；eDNA技術進行資源調查相對傳統調查成本較低，對分類學鑒定專業知識要求較低，生態環境侵入性低、影響較小[8]；eDNA技術能檢測出傳統魚類多樣性調查手段難以捕獲的物種，但因假陽性和DNA污染等情況的存在，其適合作為魚類資源調查的一個重要補充手段[9]。利用eDNA進行資源調查不能完全替代傳統的魚類調查方法，但該技術具有對生物體以及生態環境無害、操作簡單、高靈敏度以及高檢測率等諸多優勢，隨著數據庫的持續完善，其適用性會越來越強[10]。

本次調查采用傳統捕撈方式和采集水樣檢測環境DNA相結合的技術方法，于2020—2021年對赤水河河源段的魚類資源現狀進行調查，分析其種類組成和數量結構、優勢種、生物多樣性及魚類棲息分布狀況，既彌補了傳統捕撈方法調查不夠全面的不足，也在一定程度解決了eENA技術出現假陽性的問題，旨在為保護區魚類生物多樣性保護提供管理依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在赤水河河源段的保護區水域布設18個調查站位(表1)，其中赤水河干流10個、支流8個，利用籠壺、拋撒掩網和定置三重刺網3種類型漁具對該區域的魚類進行捕撈。同時在赤水河河源段主要支流及干流設置的18個采樣點中選取7個點(魚洞、羅甸、小三峽、天生橋、石坎、河口、苦竹塘)采集eDNA水樣。

表1 赤水河河源段魚類資源調查站位分布表Tab.1 Characteristics of biodiversity monitoring stations

續表1

1.2 樣品鑒定與檢測

對采集到的漁獲物進行現場鑒定，并測量體長和體質量，對于疑難物種采用甲醛固定后帶回鑒定。標本鑒定和分類主要依據《四川魚類志》[11]、《長江魚類》[12]、《貴州魚類志》[13]、《中國內陸魚類物種與分布》[14]。

eDNA水樣按照Omega Soil DNA Kit試劑盒提取DNA，同時利用液氮進行保存，再帶回實驗室，并利用MiFish引物擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶檢測濃度。如滿足條件則運用高通量測序 (High-throughput sequencing，HTS)技術，同時對環境樣本中存在的多個物種進行識別[15]。滿足檢測條件后隨機檢測樣本OTU數并繪制OTU稀疏曲線，若有OTU無法比對至種的水平，則向上一級如屬、科等進行統計[16]。

1.3 數據分析

使用相對重要性指數(IRI)[17]計算魚類群落優勢種的成分：

IRI=(N+W)×F

(1)

式(1)中：N為某種魚類尾數占總尾數的百分比；W為某種魚類重量占總重量的百分比；F為某種魚類在調查站位出現的次數占在總站位中的百分比。將IRI>1 000的種類作為優勢種；100

采用Shannon-Wiener多樣性指數(H′)[18]、Margalef種類豐富度指數(D)[19]和Pielou均勻度指數(J)[20]研究調查海域魚類群落的生物多樣性，計算公式如下：

(2)

D=(S-1)∕lnW

(3)

J=H′/lnS

(4)

式(2)～(4)中：S為調查所獲魚類種數；W為該調查總漁獲重量；Pi為第i種重量占總漁獲重量的比例。

2 結果與分析

2.1 種類組成

表2 調查期漁獲物名錄Tab.2 List of catch during monitoring period

續表2

表3 漁獲物結構Tab.3 Structure of the catch

eDNA技術分析檢測出魚類4目8科38屬40種，其中石坎共有魚類3目8科17屬17種；河口共有4目8科20屬21種；苦竹塘共有3目7科17屬17種；小三峽共有4目8科25屬28種；天生橋共有3目7科18屬18種；羅甸共有3目7科30屬34種；魚洞共有4目8科19屬19種(表4)。

表4 基于eDNA檢測各站位的魚類序列比對結果Tab.4 Sequence alignment results of fish based on eDNA detection at each station

2.2 魚類資源分布特征

本次調查以2020年為主，因甲方資金問題，而順延至來年，但2021年采樣期間為雨季，因此漁獲物少，導致無法作多樣性分析。在2020年度調查期間采集魚類19種，占本次調查總數的82.6%，其中銅車河采集魚類13種，占總數的56.5%；倒流河采集魚類5種，占總數的21.7%；石坎河采集魚類3種，占總數的13.0%。各河段魚類組成存在差異，干流>銅車河>倒流河>石坎河，干流魚類物種更加豐富。

調查期間干流各個站點平均魚類捕獲重量為2 636 g，個體全長分布在2.1～37.0 cm之間，大個體占比較高；銅車河站點平均魚類漁獲重量為748 g，個體全長分布在2.8～22.5 cm之間；倒流河站點平均魚類漁獲重量為242 g，個體全長分布在4.6～13.5 cm之間；石坎河上游各個站點平均魚類漁獲重量為58.5 g，個體全長分布在4.0～15.0 cm之間；支流受流量、餌料生物及生態環境因素影響，其魚類個體整體偏小。干、支流在魚類資源量方面存在差異。

2.3 魚類多樣性分析

Shannon-Wiener多樣性指數基于物種數量反映群落種類多樣性，群落中生物種類增多代表了群落的復雜程度增高，即H′值愈大，群落所含的信息量愈大[18]。2020—2021年度調查河段漁獲物Shannon-Wiener多樣性指數為2.99，表明該河段總體魚類資源相對豐富，群落結構相對穩定。Margalef豐富度指數指一個群落或環境中物種數目的多寡，亦表示生物群聚(或樣品)中種類豐富度程度的指數[19-21]。調查河段總漁獲物Margalef豐富度指數(D)為3.31，表明調查區域魚類資源種類數相對豐富，生物多樣性結構相對完好，魚類組成及種群結構穩定。Pielou均勻度指數(J)是一個用于反映物種個體數目在群落中分配的均勻程的指數[19-21]，調查河段總漁獲物均勻度指數為0.66，種群結構分布較均勻，群落結構穩定(表5)。

表5 漁獲物生物多樣性指數Tab.5 Biodiversity indexes of catches

基于eDNA檢測各站位的魚類群落多樣性指數分析結果如表6所示，從中可知，魚洞、羅甸和小三峽的魚類多樣性更加豐富，魚洞位于調查區干流上游，羅甸位于調查區干流中游，小三峽位于調查區干流下游，其他采樣點則是分布于主要支流。調查區域干流的魚類資源比支流區域更豐富，魚類多樣性也更高。

表6 基于eDNA檢測各站位的魚類群落多樣性指數Tab.6 Fish community diversity indexes based on eDNA detection at each station

3 討論

本次eDNA調查，共檢測出4目8科28屬40種。考慮到網具、捕魚技術、魚類生活習性和魚類數量等因素，利用eDNA檢測的種類數較傳統捕撈方式更加全面。郭寧寧等[24]利用eDNA技術于2021年9月對赤水河流域開展了魚類多樣性、分布及其特征調查，設置了52個采樣點，其采樣點設置比本研究eDNA技術調查采樣點(7個)多45個，共調查到6目18科62屬77種魚類，比本次河源段調查(40種)多出37種。經分析，存在差異可能是郭寧寧等[24]調查的范圍更大，調查頻次更加密集，且調查區域不同導致的。本次調查區域部分支流存在水量較少等情況，幾條支流存在只有雨季才有的現象，這部分支流的魚類多樣性不高，魚類資源不夠豐富，導致調查出的魚類種類數量較少。本研究eDNA分析結果顯示，羅甸和小三峽的魚類種類最多，分別為34種和28種，其中羅甸采樣點處于妥泥河河口處，小三峽處于干流下流區域。干流區域的魚類種類更加豐富，與漁獲物種類分析結果一致。

在2020—2021年調查過程中，小三峽、魚洞調查點基因含量水平較高，物種相對豐富，而且小三峽段還檢測到部分洄游性魚類基因片段，證明赤水河下游魚類在繁殖季節可上溯至此，下一步應有針對性地加強重點物種調查，加強保護措施。在上游魚洞調查水域檢測到有銅魚基因片段信息，可能是放流品種在此區域活動停留導致的。在檢測過程中檢測到四大家魚、鯉、鯽和鱘魚，可能是養殖或者食用品種基因片段混雜導致的。考慮到采樣點的分布集中在干、支流區域，因此分別對干、支流的資源量進行統計，發現干、支流在魚類資源量方面存在顯著差異，干流的魚類種類數目比支流更加豐富，同時在干、支流的同種類魚類中，干流的魚體顯著大于支流，推測是受流量、餌料生物、生態環境因素和保護力度的影響。在后期魚類多樣性保護上，應加強干流保護區核心區的保護，逐步加強支流資源量恢復措施，提升整體資源水平。