利用乳酸乳球菌發(fā)酵大豆蛋白產(chǎn)低聚肽的研究

盧美歡，仝澤方，馬英輝，張美麗，李利軍

（陜西省微生物研究所，陜西西安 710043）

大豆是我國主要經(jīng)濟作物，含有豐富的油脂和植物蛋白等，蛋白含量達到35%～40%，具有很好的營養(yǎng)價值和生物活性[1]。大豆蛋白肽是大豆蛋白經(jīng)酸解或酶解作用后，通過分離、精制等特殊處理而得到的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，而低聚肽則通常是由3～6 個氨基酸組成，且相對分子質(zhì)量低于1000 Da 的低肽混合物[2]。大豆蛋白肽進入人體腸胃后不需要經(jīng)過消化酶作用，可以直接被吸收，利用效果優(yōu)于游離氨基酸，因此對于病弱人群是理想的蛋白營養(yǎng)源。同時大豆蛋白肽還具有較低的抗原性、調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、降低膽固醇、降血壓、抗氧化等生物活性和生理功能[3-4]。目前，常采用酶解法和微生物發(fā)酵法生產(chǎn)大豆蛋白肽，但酶制劑價格昂貴導致酶解法生產(chǎn)成本高，同時酶解后容易產(chǎn)生苦味肽，影響產(chǎn)品口感，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白肽則可以把酶的生產(chǎn)和應用合二為一，成本更低，而且發(fā)酵生產(chǎn)過程中可以去除大豆肽苦味，具有更好的口感[5-8]。目前報道可用于大豆蛋白水解的微生物有枯草芽孢桿菌[9]、植物乳桿菌[10]、蛹擬青霉[11]、酵母[12]、米曲霉[13]、短小芽孢桿菌[14]等。

乳酸乳球菌是常用的食品微生物，應用領(lǐng)域有乳品發(fā)酵、奶酪加工、泡菜和酸面團等[15]。乳酸乳球菌應用于乳品發(fā)酵研究較成熟，它可以將乳品中的乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，同時自身的肽酶和分泌的蛋白酶可以促進乳品的蛋白質(zhì)水解[16]。隨著植物蛋白應用越來越廣泛，乳酸乳球菌也開始逐漸用于植物蛋白的發(fā)酵分解，相對于其他發(fā)酵菌，利用乳酸乳球菌生產(chǎn)植物蛋白制品更安全，具有低免疫原性、降低大豆蛋白肽系酸力的優(yōu)點，乳酸乳球菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸菌素也可以起到天然防腐的作用[17]。同時由于乳酸乳球菌良好的遺傳穩(wěn)定性，是產(chǎn)業(yè)化理想的生產(chǎn)菌株[18-19]。

為深入開發(fā)大豆蛋白資源，從自制泡菜中篩選了一株蛋白轉(zhuǎn)化能力好的菌株P(guān)Z1，經(jīng)鑒定為乳酸乳球菌，對該菌進行了全基因組測定，并分析了該菌株的蛋白分解能力，利用該菌發(fā)酵大豆分離蛋白產(chǎn)低聚肽，對低聚肽進行了抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）PZ1 從自制泡菜中分離獲得，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M 2 022398；米曲霉（Aspergillus oryzae）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）本實驗室保存菌種；MRS 培養(yǎng)基 蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉4 g、葡萄糖2 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂15～20 g、水1000 mL，pH6；大豆分離蛋白培養(yǎng)基 大豆分離蛋白2%，葡萄糖0.5%；98%大豆分離蛋白、Gly-Gly-Tyr-Arg、維生素C（VC）上海源葉生物科技有限公司；DNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；DPPH Sigma公司；硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、乙醇 天津市天力化學試劑有限公司；過氧化氫 成都市科龍化工試劑廠；鹽酸 成都市科隆化學品有限公司；聚乙二醇標準品 上海子起生物科技有限公司。

FA2104N 電子天平 上海精其儀器有限公司；722 分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；DHP-9162 恒溫培養(yǎng)箱 太倉科教儀器廠；TH2-C 恒溫搖床 太倉市實驗設備廠；GeneAmp PCR Syetem 9700 基因擴增儀 美國ABI 公司；HC-2518R 高速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器有限公司；BONAGM-011 超濾儀 山東博納生物科技集團有限公司；PL-GPC 220 凝膠滲透色譜儀 美國Agilent 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選 從自制泡菜中收集液體，對液體進行梯度稀釋，分別將102、103、104倍稀釋液100 μL，涂布于MRS 培養(yǎng)基中，32 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，挑取單菌落繼續(xù)在MRS 培養(yǎng)基中劃線純化，獲得純菌株，在大豆分離蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以大豆多肽含量為指標考察菌株對大豆分離蛋白的發(fā)酵分解效果，選取效果最好的一株菌命名為PZ1。

1.2.2 菌株鑒定 形態(tài)鑒定：PZ1 菌株在MRS 平板上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，具體方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]。

16S rDNA 鑒定：利用細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取菌株P(guān)Z1 的總DNA，采用16S rDNA通用引物7F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'和1540R：5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'進行PCR擴增，擴增程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72℃ 1 min，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工公司測序，獲得的16S rDNA 基因序列在NCBI 網(wǎng)站上進行比對分析。

1.2.3 菌株P(guān)Z1 全基因組測定及蛋白水解相關(guān)酶分析 將菌株P(guān)Z1 送北京百邁克公司Nanopore 測序技術(shù)平臺進行全基因組測序。全基因組序列提交GenBank，登錄號為PRJNA912843。利用基因和蛋白注釋數(shù)據(jù)庫對PZ1 的蛋白酶和肽酶等蛋白水解相關(guān)基因進行分析。

1.2.4 不同微生物發(fā)酵大豆分離蛋白產(chǎn)多肽的比較

將米曲霉、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌（納豆菌）和乳酸乳球菌PZ1 分別接種至大豆分離蛋白培養(yǎng)基，32 ℃發(fā)酵2 d，發(fā)酵液測大豆多肽含量和蛋白總量，計算多肽轉(zhuǎn)化率，多肽轉(zhuǎn)化率（%）=肽含量/蛋白總量×100。蛋白總量采用凱氏定氮法測定[21]。

1.2.5 大豆多肽含量測定

1.2.5.1 標準曲線的制作 大豆多肽含量測定參照雙縮脲法測定[22]。稱取Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽20 mg，加入10 mL 5%的TCA 溶解，即為四肽標準溶液。用5% TCA 分別配制濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 和 1.8 mg/mL 的 Gly-Gly-Tyr-Arg 標準溶液。分別取標準溶液0.75 mL，加入0.5 mL 雙縮脲試劑，在漩渦混合器振蕩混合均勻，靜置10 min，2000 r/min，離心10 min，取上清液在540 nm 下測定OD 值，以不加四肽標準溶液管為空白對照測吸光度值，每個濃度做2 個平行。以四肽的濃度作橫坐標x（mg/mL），吸光度（OD 值）作縱坐標y，制作標準曲線。得到標準曲線方程為y=0.1026x-0.0086，R2=0.9933。

1.2.5.2 多肽的測定 大豆分離蛋白經(jīng)微生物發(fā)酵后，測定發(fā)酵液中多肽含量，樣品用蒸餾水配成一定濃度后，取1.0 mL，加入1.0 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液，混合均勻后靜置10 min，離心機4000 r/min 離心15 min，取0.75 mL 上清液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中，加入0.5 mL 雙縮脲試劑，后續(xù)操作同1.2.5.1，吸光值與標準曲線對照，即可得到樣品的多肽含量（mg/mL）。

1.2.6 大豆多肽的分子量分析 采用安捷倫PLGPC 220 凝膠滲透色譜儀進行大豆多肽的分子量分析，檢測器為PL-GPC 50（RI），色譜柱為PL aquqgel-OH MIXED 8 μm 兩根串聯(lián)，洗脫液為超純水，流速1 mL/min，溫度30℃，樣品用蒸餾水溶解后配成濃度1 mg/mL，用0.22 μm 膜過濾，取10 μL 上樣測試。以聚乙二醇分子量標準品進行分子量分析。

1.2.7 大豆低聚肽的制備 乳酸乳球菌PZ1 轉(zhuǎn)接至MRS 斜面活化24 h，用接種環(huán)取2 環(huán)接種至滅菌的大豆分離蛋白培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)48 h，得大豆蛋白發(fā)酵液PZ1，將大豆蛋白發(fā)酵液放置在-20 ℃冰箱冷凍12～24 h，取出室溫解凍，超聲破碎15 min，超聲功率為800 W，用離心管裝超聲后的溶液在離心機中以10000 r/min，離心10 min。取上清液在超濾裝置中進行超濾，分別過5000、1000 和300 Da 的有機膜，收集300～1000 Da 之間的濾液，得低聚肽粗品，冷凍干燥后保存（-20 ℃）備用。采用1.2.5 方法測定粗品中低聚肽含量，并配成合適濃度進行活性測定。

1.2.8 低聚肽抗氧化活性測定 低聚肽、大豆分離蛋白和陽性對照維生素C（VC）分別用蒸餾水稀釋，配成濃度梯度為2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.1 mg/mL。參考盧美歡等[23]測定低聚肽、大豆分離蛋白和VC的抗氧化活性，分別檢測對DPPH 自由基、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）的清除效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2021 和DPSv7.05 數(shù)據(jù)系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，顯著性水平分析采用 Duncan’s 新復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株P(guān)Z1 的鑒定

PZ1 菌株在MRS 平板上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色。菌落形態(tài)如圖1 所示，菌落凸起，乳黃色，表面光滑，濕潤，革蘭氏染色顯紫色，為陽性菌。顯微觀察菌株形態(tài)為圓球狀，大小約0.5 μm。

圖1 PZ1 菌株的菌落形態(tài)（左）和革蘭氏染色顯微圖片（×1000）（右）Fig.1 Colony morphology of strain PZ1 (left) and Gram stain micrograph (×1000) (right)

提取PZ1 菌株DNA，以該DNA 為模板，采用16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增，電泳檢測獲得約1400 bp 的單一特異性條帶（圖2A）。PCR 產(chǎn)物進行測序，序列長度為1441 bp，通過NCBI 在線比對，顯示菌株P(guān)Z1 與乳酸乳球菌基因序列同源性達100%，初步判定菌株P(guān)Z1 為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。提取乳酸乳球菌PZ1 的總DNA，利用Nanopore 測序技術(shù)平臺進行全基因組測序。對乳酸乳球菌PZ1 的全基因組序列進行Nr 同源物種分布分析，結(jié)果顯示與乳酸乳球菌的同源性為98.34%（圖2B），系統(tǒng)進化樹分析顯示菌株P(guān)Z1 和乳酸乳球菌的親緣最近（圖2C）。將乳酸乳球菌PZ1 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO.M 2022398。

圖2 PZ1 菌株的16S rDNA PCR 擴增結(jié)果（A）、Nr 同源物種分布（B）和系統(tǒng)進化樹分析（C）Fig.2 PCR amplification of the 16S rDNA fragmen (A),Nr homologous species distribution (B) and phylogenetic tree analysis of strain PZ1 (C)

2.2 乳酸乳球菌PZ1 的全基因組分析

乳酸乳球菌PZ1 的全基因組測序共得到4083885878 bp Clean Data，組裝后完整基因組總長2136240 bp，GC 含量（鳥嘌呤G 和胞嘧啶C 所占的比率）為34.86%。通過Nr 數(shù)據(jù)庫注釋（表1），搜索和肽酶、蛋白酶相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)PZ1 含有肽酶Peptidase、二肽酶Dipeptidase、內(nèi)肽酶Endopeptidase、羧肽酶Carboxypeptidase、氨肽酶Aminopeptidase 等肽酶基因。通過Swissprot 數(shù)據(jù)庫注釋，乳酸乳球菌PZ1 除了存在多種肽酶基因，還發(fā)現(xiàn)了多種蛋白酶protease 基因。已有研究表明，蛋白酶的作用是將外源蛋白進行降解，生成大分子肽，肽酶則將大分子肽水解為小分子肽和氨基酸[24]。內(nèi)肽酶可以切除肽鏈內(nèi)部的氨基酸，氨肽酶和羧肽酶都屬于外切蛋白酶，氨肽酶在肽鏈N-末端切除氨基酸，羧肽酶則專一性從肽鏈的C-末端切除氨基酸，同時羧肽酶可以將短肽末端的疏水性氨基酸切除，達到脫苦的目的[25]。結(jié)合以上分析可見乳酸乳球菌PZ1 既能產(chǎn)生蛋白酶和多種肽酶將大分子蛋白質(zhì)分解成短肽，也能產(chǎn)生羧肽酶達到脫苦的目的。

表1 菌株P(guān)Z1 在Nr 和Swissprot 數(shù)據(jù)庫注釋的蛋白酶相關(guān)基因Table 1 Protease-related genes in strain PZ1 annotated in Nr and Swissprot databases

2.3 不同微生物發(fā)酵大豆分離蛋白產(chǎn)多肽的比較

分別采用3 株米曲霉，植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌（納豆菌）和乳酸乳球菌PZ1 發(fā)酵大豆分離蛋白，測發(fā)酵后的多肽含量，計算多肽轉(zhuǎn)化率見圖3。3 株米曲霉對大豆分離蛋白的多肽轉(zhuǎn)化率均低于20%，枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化率為47.84%，植物乳桿菌的多肽轉(zhuǎn)化率為85.08%，乳酸乳球菌PZ1 的轉(zhuǎn)化率最高，為88.27%，說明PZ1 可以較好地分解大豆蛋白。該結(jié)果進一步證實了PZ1 存在蛋白酶和肽酶基因，可以將蛋白分解為多肽。其他研究也表明乳酸菌可以有效分解大豆蛋白，如劉海燕[26]利用乳酸菌發(fā)酵豆粕，可以將豆粕中大分子蛋白質(zhì)降解為小分子肽，而且增加了豆粕中游離氨基酸含量。何勇錦等[27]利用乳酸短桿菌KLDS-1 降解豆粕粉，經(jīng)生料厭氧發(fā)酵后小肽含量達26.12%，比發(fā)酵前提高了22.81%。聶慶杰等[28]采用乳酸乳球菌17 發(fā)酵豆粕取得良好的發(fā)酵效果，大豆球蛋白降解率為37.29%。和現(xiàn)有研究相比，本研究乳酸乳球菌PZ1 分解大豆蛋白的效率更高，值得進一步開發(fā)利用。

圖3 不同微生物發(fā)酵大豆分離蛋白產(chǎn)多肽的轉(zhuǎn)化率Fig.3 Conversion rate of polypeptides from soybean protein isolate fermented by different microorganisms

2.4 乳酸乳球菌PZ1 發(fā)酵大豆分離蛋白的分子量分析

乳酸乳球菌PZ1 在大豆分離蛋白培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后，分別將發(fā)酵前和發(fā)酵后的蛋白溶液進行凝膠滲透色譜分析，色譜圖見圖4（A）。經(jīng)PZ1 發(fā)酵后的大豆分離蛋白出峰時間更滯后，說明大豆分離蛋白被分解成小分子的多肽。將發(fā)酵前和發(fā)酵后的蛋白分子量分布進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖4（B）所示。結(jié)果表明，發(fā)酵前的大豆蛋白分子量主要集中在5000 Da以上，占比為76%，分子量1000 Da 以下僅占1%；經(jīng)PZ1 分解后大豆多肽分子量≤1000 Da 的比例達85%，而分子量在3000～5000 Da 的多肽則只有1%，此外，分子量1000～3000 Da 比例為14%。WEN 等[29]采用中性蛋白酶和堿性蛋白酶對大豆蛋白進行混合酶解，獲得87.92%分子量≤1000 Da 的大豆肽，1000～3000 Da 的比例為11.03%，和本研究的分解效果接近，說明采用乳酸乳球菌PZ1 發(fā)酵大豆蛋白可以獲得較好的降解效果。有資料表明，乳酸菌發(fā)酵過程中可以將外源蛋白水解為能直接利用的氨基酸，從而維持自身的正常生長[30]。本研究使用的大豆蛋白培養(yǎng)基只含少量的碳源，其余都是大豆蛋白，營養(yǎng)要素匱乏促使乳酸乳球菌PZ1 分泌大量的蛋白酶類對大豆蛋白進行水解，在維持自身生長的同時也產(chǎn)生了大量小分子低聚肽。

圖4 大豆分離蛋白發(fā)酵前和PZ1 發(fā)酵后的凝膠滲透色譜分析（A）及分子量分布（B）Fig.4 Gel permeation chromatography analysis (A) and molecular weight distribution (B) of soy protein isolate before and after fermentation of PZ1

2.5 低聚肽抗氧化活性測定

根據(jù)資料報道，分子量在多肽的生物活性中起著關(guān)鍵作用，分子量低于1000 Da 的低聚肽具有更高的生物活性[31]，在增強免疫力、抗氧化作用、吸收性方面均優(yōu)于分子量較大的多肽[32]。本文通過微生物降解大豆分離蛋白為低聚肽，研究其抗氧化活性。乳酸乳球菌PZ1 發(fā)酵大豆分離蛋白后，按照1.2.7 方法進行低聚肽的制備。同時配制相同濃度的大豆分離蛋白和VC測定抗氧化活性。結(jié)果顯示，在0.1～2 mg/mL 范圍內(nèi)，大豆低聚肽清除DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基能力均大于大豆分離蛋白（見圖5）。而且隨著蛋白溶液濃度的增大，清除率也逐漸增大。濃度為2 mg/mL 時，大豆低聚肽和大豆分離蛋白清除DPPH 自由基能力分別為79.31%和59.92%，清除羥基自由基能力分別為78.27%和60.18%，清除超氧陰離子自由基能力分別為84.62%和66.49%，可見低聚肽的抗氧化活性優(yōu)于大豆分離蛋白，說明低聚肽具有更好的保健功效。大豆低聚肽清除DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的IC50分別為0.32、0.36、0.26 mg/mL。與陽性對照維生素C（VC）相比，在0.1～2 mg/mL 范圍內(nèi)，VC對DPPH 自由基清除能力優(yōu)于大豆低聚肽，對羥基自由基清除能力兩者沒有較大差別，對超氧陰離子自由基清除能力則大豆低聚肽優(yōu)于VC。

圖5 大豆低聚肽和大豆分離蛋白對DPPH自由基、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率Fig.5 Scavenging rate of soy oligopeptide and soy protein isolate on DPPHfree radical,hydroxyl freeradical (·OH) and superoxidefreeradical (O2-·)

3 結(jié)論

本研究從泡菜中分離出一株乳酸乳球菌PZ1，具有分解大豆蛋白的能力，全基因組分析PZ1 菌株具有多種肽酶和蛋白酶基因，包括肽酶、二肽酶、內(nèi)肽酶、羧肽酶、氨肽酶等基因。利用PZ1 發(fā)酵大豆分離蛋白，產(chǎn)生的多肽分子量集中在1000 Da 以下，達到85%，分子量1000～3000 Da 比例為14%。通過對大豆分離蛋白發(fā)酵液的超濾純化，獲得了300～1000 Da 的低聚肽。研究了大豆低聚肽的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)大豆低聚肽清除自由基能力均大于大豆分離蛋白，濃度為2 mg/mL 時，大豆低聚肽對DPPH自由基、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率分別為79.31%、78.27%和84.62%。綜上所述，乳酸乳球菌PZ1 可作為大豆蛋白的降解菌株，在生產(chǎn)功能性低聚肽產(chǎn)品具有潛在的應用價值。