基于細胞模型和網絡藥理學探究兒茶素抗炎、抗癌的構效關系

應思慧，魯 森，陳忠正，張媛媛，李 斌，林曉蓉

（華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）

茶葉為當今世界三大無酒精飲料之一，以其抗氧化[1]、抗炎[2]、抗癌[3]、益思提神[4]、降壓減脂[5-6]等健康功效而廣受人們喜愛。茶多酚是茶葉中具有突出健康功效的主要理化組分，其含量約占茶葉干重的18%～36%，其中以兒茶素類占比最高，達茶多酚類總量的70%～80%[7]。兒茶素是一類以2-苯基苯并二氫吡喃環為基本結構的黃烷醇類化合物，包括表兒茶素（epicatechin，EC）、兒茶素（catechin，C）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）等8 種主要單體（圖1），具有抗氧化、消炎、抗癌、神經保護與抗腫瘤細胞血管生成等多種功能特性[8]。根據B 環羥基數目，可將8 種兒茶素單體分為焦酚型（B 環為含有三個羥基的沒食子基，包括EGC、GC、EGCG、GCG）和兒茶酚型（B 環為含有兩個相鄰羥基的兒茶酚基，包括EC、C、ECG、CG）；根據C 環C3連接基團，可分為酯型（C 環C3的-OH 與沒食子酸酯化形成沒食子酰基，包括ECG、CG、EGCG、GCG）和非酯型（EC、C、EGC、GC）；根據C 環C2、C3不同取代基的空間位置，又可分為順式構象（C2上的B 環和C3上的羥基或沒食子酰基在環平面的同一側，包括EC、EGC、ECG、EGCG）和反式構象（C2上的B 環和C3上的羥基或沒食子酰基不在環平面的同一側，包括C、GC、CG、GCG）[7]。

圖1 8 種兒茶素單體的化學結構Fig.1 Chemical structure of eight catechin monomers

兒茶素的功能活性與其化學結構密切相關。研究表明，酯型兒茶素比非酯型兒茶素具有更強的抗氧化[9-10]、抗腫瘤增殖[11-13]、抗肥胖[14-15]、抗過敏[16]等活性；焦酚型兒茶素B 環的鄰苯三酚結構有助于增強其抗氧化[17-18]、抗腫瘤[19]活性，但焦酚型兒茶素抑制口腔腫瘤細胞增殖[20]和自由基引起的大鼠肝臟微粒過氧化等活性[21]低于兒茶酚型結構；反式兒茶素GCG 的抗動脈粥樣硬化[22]、抗糖尿病[23]、降膽固醇和降血脂[24]等作用均比其順式構象EGCG 更強，但二者抗癌[25]、抗過敏活性[26]相當。這些研究說明，兒茶素B 環、C 環的取代基類型和空間位置會影響其抗氧化、抗癌等生物活性的發揮，但這種構效關系背后的分子機制尚未完全闡明。網絡藥理學是基于系統生物學、多向藥理學、生物信息學、網絡科學等多學科發展起來的新興學科，主要利用基因、蛋白質、疾病、藥物等網絡數據庫的豐富信息，通過計算機、分析軟件、算法等，分析藥物對基因、靶點、通路和疾病的干預和影響，從而闡釋藥物的系統性藥理機制，指導多靶點新藥的設計和研發[27-28]，為揭示兒茶素等天然產物、藥物等多靶點、多途徑的分子作用機制提供了新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人結腸癌細胞HCT116、小鼠巨噬細胞RAW 264.7 中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%）、羅斯韋爾公園紀念研究所1640 培養基（RPMI 1640）、杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS，pH 為7.0～7.3）、南美胎牛血清（FBS）美國Gibco 公司；杜氏改良伊格爾培養基高糖培養基（DMEM，含酚紅）、青霉素（100 U/mL）/鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺 美國Hyclone 公司；EC（≥98%）、C（≥98%）、EGC（≥98%）、GC（≥98%）、ECG（≥98%）、CG（≥98%）、EGCG（≥98%）、GCG（≥98%）、臺盼藍、噻唑藍粉末（MTT）上海源葉生物科技有限公司；LPS、二甲基亞砜（DMSO）美國Sigma-Aldrich 公司；25 cm2細胞培養瓶 丹麥Nunc公司；Coster 96 孔細胞培養板 美國Corning 公司。

BS 124S/ BT 25S 電子天平 瑞士Mettle Toledo公司；Milli-Q Integral 3 純水機 德國Merck-Millipore 公司；VersaMax 酶標儀 美國Molecular Devices 公司；AIRTECH 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；GHP-9080 隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；HERAcell 150i CO2培養箱 美國Thermo 公司；QYC-200 恒溫培養搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；Vortex-5 渦旋混合儀 江蘇麒麟醫用儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 小鼠巨噬細胞RAW264.7 經解凍復蘇后，置于含5%的CO2培養箱（37 ℃）中培養，培養液成分為88%的DMEM 高糖培養基（含酚紅）、1%青霉素（100 U/mL）/鏈霉素（100 μg/mL）溶液（雙抗）、10%胎牛血清（FBS）與1% L-谷氨酰胺（4 mmol/L），每2～3 d 繼代一次；人結腸癌細胞HCT116 經解凍復蘇后，置于含5%的CO2培養箱（37 ℃）中培養，培養液組成為89% RPMI 1640 培養基、10% FBS 及1%雙抗，每3～4 d 繼代一次。

1.2.2 兒茶素體外抗炎活性評價 參考Zhang 等[29]方法并作適當調整，具體操作如下：RAW264.7 細胞以5×105個/mL 的濃度接種到96 孔培養板中，每孔細胞液體積為200 μL，于5%的CO2培養箱（37 ℃）中培養24 h。吸去舊培養基，按順序添加100 μL 不同濃度的兒茶素溶液及100 mL LPS 溶液（終濃度為1 μg/mL），混勻，于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養24 h。

1.2.2.1 NO 產生百分比測定 吸取100 μL 上清液至新的96 孔培養板，并加入100 μL 的Griess 試劑，避光靜置10 min 后，用酶標儀測定其在542 nm 波長處的吸光值，按照公式（1）計算NO 產生百分比（%）。

式中：ALPS表示僅添加LPS、未添加樣品時的吸光值，ALPS顏色對照表示未添加細胞、僅添加LPS 時的吸光值；A樣品表示添加LPS 和樣品共培養后的吸光值，A樣品顏色對照表示無細胞情況下添加LPS 和樣品時的吸光值。計算空白組的NO 產生量時，A樣品表示未添加樣品時培養基的吸光值，并將LPS 組的NO 產生量記為100%。

1.2.2.2 細胞存活率測定 參考Mosmann[30]的方法并作適當調整，具體操作如下：將舊96 孔培養板中剩余細胞液棄去，每孔加入0.05 mg/L 的MTT 溶液100 μL，37 ℃培養1 h，棄去MTT 溶液，每孔加入200 μL 的DMSO 溶液，于37 ℃、轉速100 r/min 的搖床中振蕩處理15 min。吸取150 μL 上清液，用酶標儀測定其在波長550 nm 處的吸光值，按照公式（2）計算細胞存活率（%）。

那年部隊來征兵，招財報名，所幸的是老支書慶高伯卸職去公社林場了，不然的話會是第一個就被刷下來。他在部隊幾年，是站崗、放哨？還是練武、殺鬼子？誰也不知道。他娘桃娭毑也不知道。他雖然小時候讀過三個一年級，兩個二年級，后來還混到四年級，可他不會寫信，就是寫了信寄回來，桃娭毑也不會看，她扁擔倒地，一字不識。

式中：A樣品表示細胞與樣品共培養時的吸光值，A空白表示未添加樣品，細胞單獨培養時的吸光值。

1.2.3 兒茶素體外抗癌活性評價 將HCT116 細胞以2.5×104個/mL 的濃度接種到96 孔培養板中，每孔細胞液體積為200 μL，于含5%的CO2培養箱（37 ℃）中培養24 h。吸出100 μL 上清液至新的96 孔培養板，每孔加入50 μL 兒茶素溶液與50 μL含FBS 的培養基，空白組每孔加入100 μL 含FBS培養基，充分混勻，于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養48 h。

1.2.3.1 細胞存活率測定 參考Mosmann[30]的方法并作適當調整，具體操作如下：取出96 孔培養板并棄去細胞液，每孔加入0.25 mg/L 的MTT 溶液100 μL，37 ℃培養2 h，棄去MTT 溶液，每孔加入200 μL 的DMSO 溶液，于37 ℃、轉速100 r/min 搖床中振蕩處理15 min。吸取150 μL 上清液，用酶標儀測定其在波長550 nm 處的吸光值，按照公式（2）計算細胞存活率。

1.2.4 兒茶素抗炎、抗癌作用機制預測

1.2.4.1 抗炎、抗癌靶點篩選 參考王騰飛等[31]的方法并作調整，具體操作如下：使用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索8 種兒茶素的SMILES 號，將其導入SIWSS 數據庫（http://swisstargetprediction.ch/）中，預測其作用靶點，去除重復靶點后，作為兒茶素的潛在作用靶點。以“inflammation”、“cancer”為關鍵詞，分別在人類基因GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）、孟德爾遺傳代謝OMIM 數據庫（https://omim.org/）、DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/）和TTD數據庫（http://bid.nus.edu.sg/group/cjttd/）中進行檢索，收集炎癥、癌癥相關靶點，合并去除重復后，使用Venny 2.1.0 網站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制兒茶素潛在作用靶點與炎癥、癌癥相關靶點的韋恩圖，根據二者交集確定8 種兒茶素的潛在抗炎、抗癌作用靶點。利用STRING 數據庫（https://string-db.org/）對潛在靶點做蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）分析，物種設定為“Homo sapiens”，將得到的蛋白相互作用網絡導入Cytoscape 3.8.0 軟件，根據拓撲學參數篩選關鍵抗炎、抗癌靶點。

1.2.4.2 GO 功能富集和 KEGG 通路富集 利用計算機R 語言中“ClusterProfiler”、“enrichplot”和“org.s.eg.db”等程序包對兒茶素的潛在抗炎、抗癌靶點進行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，根據P值大小（P值＜0.05）分別篩選生物過程（BP）、細胞組成（CC）與分子功能（MF）的富集結果，并通過富集條目數的可視化顯示排名前10 的功能和通路。

1.2.4.3 組分-靶點-通路-疾病網絡構建 將8 種兒茶素及其潛在抗炎、抗癌作用靶點導入Cytoscape3.8.0 軟件，繪制其組分-靶點-通路-疾病網絡圖，節點（node）代表兒茶素、通路、疾病和作用靶點，邊（edge）代表組分、通路、疾病和作用靶點之間的相互作用關系。

1.2.4.4 分子對接 以8 種兒茶素為配體，以其抗炎、抗癌關鍵靶點為受體，利用AutoDock 分子模擬軟件進行分子對接模擬，根據對接結合能分析兒茶素與關鍵靶點的結合能力，利用PyMOL 軟件對結合能最低的組合進行可視化處理，并利用Discovery Studio 2019 Client 軟件作二維示意圖。

1.3 數據處理

所有實驗含三次平行、兩次重復，結果以平均值±標準差表示，組間差異采用鄧肯多重檢驗進行顯著性分析，不同小寫字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 8 種兒茶素的體外抗炎活性比較

巨噬細胞經LPS 刺激會產生大量的炎癥介質NO，通過檢測細胞上清液中NO 的產生百分比，能夠反映細胞內炎癥反應的強弱程度[32]。為初步分析兒茶素的體外抗炎活性及其構效關系，本研究采用MTT 法和Griess 試劑法比較分析了8 種兒茶素對LPS 處理的RAW 264.7 細胞存活率及炎性介質NO 產生百分比的影響，結果如圖2 所示。

圖2 8 種兒茶素處理RAW 264.7 細胞的存活率和NO 產生百分比Fig.2 Cell viability and production percentage of NO of RAW 264.7 cells treated with eight catechins

由圖2 可知，與LPS 單獨處理組相比，空白組的NO 產生百分比不足3.83%；與空白組相比，LPS單獨處理對RAW264.7 的細胞存活率無顯著影響，說明LPS 處理24 h 能夠顯著刺激RAW264.7 細胞產生炎性介質NO，且不存在明顯的細胞毒性，表明體外炎癥細胞模型建立成功。與LPS 單獨處理組相比，CG、ECG、GC、EGC、C、EC 在15～480 μg/mL濃度范圍，GCG、EGCG 在5.625～180 μg/mL 濃度范圍內，細胞存活率均大于50%，而其NO 產生百分比隨兒茶素濃度升高而不斷降低，說明8 種兒茶素單體均能有效抑制LPS 誘導巨噬細胞產生NO；但不同兒茶素對NO 產生的抑制作用存在明顯差異，根據其抑制NO 產生的IC50，各兒茶素單體對NO 的抑制作用強弱依次為：GCG＞EGCG＞GC＞CG＞EGC＞ECG＞C、EC。這一結果表明，當其他取代基類型和空間位置相同時，酯型兒茶素的體外抗炎活性強于其非酯型結構（GCG＞GC，EGCG＞EGC，CG＞C，ECG＞EC），焦酚型兒茶素的體外抗炎活性強于兒茶酚型（GCG＞CG，EGCG＞ECG，GC＞C，EGC＞EC）；對于酯型兒茶素或焦酚型兒茶素，反式構象強于其順式構象（GCG＞EGCG，GC＞EGC，CG＞ECG）。由此可知，D 環沒食子酰基、B 環的鄰苯三酚結構能夠增強兒茶素的體外抗炎活性，且當D 環和B 環不在同一側時更利于兒茶素體外抗炎活性的發揮。

2.2 8 種兒茶素的體外抗癌活性比較

為探討兒茶素結構與抗癌活性的關系，本研究采用MTT 法比較分析了8 種兒茶素單體對人結腸癌細胞HCT116 增殖的影響，結果如圖3 所示。

圖3 8 種兒茶素單體和人結腸癌細胞HCT116 共培養的細胞存活率Fig.3 Cell viability of human colorectal carcinoma cells HCT116 co-cultured with eight catechin monomers

由圖3 可知，人結腸癌細胞HCT116 與8 種兒茶素單體共培養48 h 后，GC、EGC、GCG、EGCG、CG、ECG 在20～80 μg/mL 的濃度，EC、C 在50～400 μg/mL 的濃度范圍內，細胞存活率隨兒茶素濃度升高而顯著降低，說明8 種兒茶素單體均能有效抑制HCT116 細胞的增殖；根據其抑制細胞增殖的IC50值，8 種兒茶素單體對HCT116 細胞增殖的抑制作用大小依次為：GC＞EGC＞GCG＞EGCG＞CG＞ECG＞EC＞C。構效關系分析顯示，所有焦酚型兒茶素（GC、EGC、GCG、EGCG）的體外抗腫瘤增殖活性均強于兒茶酚型（CG、ECG、C、EC）；在4 種焦酚型兒茶素中，非酯型結構的抗腫瘤活性強于酯型結構，但在4 種兒茶酚型兒茶素中，酯型結構的體外抗腫瘤活性比非酯型更強，對于酯型兒茶素或焦酚型兒茶素，反式構象的抗腫瘤活性強于其順式構象（GC＞EGC，GCG＞EGCG，CG＞ECG）。這些結果表明，鄰苯三酚結構是兒茶素發揮抗腫瘤活性的關鍵結構，其中，B 環具有鄰苯三酚結構能夠增強不同結構兒茶素的抗腫瘤增殖活性，但D 環沒食子酰基僅在B 環為鄰苯雙酚結構時才能增強兒茶素的抗增殖活性；當D 環和B 環不在同一側時更利于兒茶素發揮其體外抗腫瘤活性。

2.3 8 種兒茶素的抗炎、抗癌作用機制預測

為進一步探究8 種兒茶素抗炎、抗癌的構效機制，本研究利用網絡藥理學預測并篩選其抗炎、抗癌的關鍵靶點，結果如圖4 所示。由圖4a 可知，通過GeneCards、TTD、OMIM 和DisGeNET 等數據庫篩選出炎癥靶點3092 個、癌癥靶點6715 個，通過SWISS 數據庫預測獲得8 種兒茶素的潛在作用靶點86 個，通過韋恩圖分析三者交集靶點，篩選出兒茶素的抗炎、抗癌靶點各59 個，其中相同靶點48 個。對兒茶素抗炎、抗癌靶點的PPI 分析結果顯示，8 種兒茶素發揮抗炎活性涉及IL6、原癌基因表達蛋白JUN、MMP-2、基質金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）、過氧化物酶體增殖物活化受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、前列腺素內過氧化物合酶-2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、TNF、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase1，AKT1）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、趨化因子配體-2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、上皮鈣黏蛋白（E cadherin，CDH1）、雌激素受體-1（estrogen receptor 1，ESR1）、缺氧誘導因子1-α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1A）和熱休克蛋白（heat shock protein 90-alpha，HSP90AA1）共16 個靶點（圖4b）；抗癌活性涉及IL6、JUN、MMP-9、PPARG、PTGS2、TNF、VEGFA、AKT1、CASP3、CCL2、CDH1、ESR1、HIF1A、HSP90AA1 等14 個關鍵靶點（圖4c），且14 個癌癥靶點均包含于16 種關鍵炎癥靶點中。炎癥的持續發展有可能導致癌癥的發生，這與許多慢性炎癥的誘因會增加癌癥感染的風險有關，大多數誘因的關鍵在于包括IL1、IL6、TNF、IL23 等炎癥細胞因子和NF-κB 等轉錄因子在內的炎性介質聚集于腫瘤組織中，從而誘發組織中惡性細胞的增殖、促進血管生成及腫瘤轉移[33-37]。由此說明，8 種兒茶素單體可通過作用于相關炎癥、癌癥靶點發揮抗炎、抗癌活性。

圖4 8 種兒茶素單體的抗炎、抗癌靶點Fig.4 Anti-inflammatory and anti-cancer targets of eight catechin monomers

根據上述8 種兒茶素單體的48 個抗炎、抗癌靶點，采用GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，并對排名前10 的條目和通路進行可視化處理，結果如圖5 所示。

圖5 8 種兒茶素單體抗炎、抗癌靶點的GO 功能富集（a）和KEGG 通路富集（b）Fig.5 GO functional enrichment (a) and KEGG pathway enrichment (b) of the anti-inflammatory and anti-cancer targets of eight catechin monomers

GO 功能注釋分析顯示生物過程相關條目1586個、細胞組成相關條目46 個、分子功能相關條目95 個，KEGG 富集顯示相關通路20 條。由圖5 可知，8 種兒茶素單體的抗炎、抗癌靶點參與氧化應激響應、平滑肌細胞凋亡的正向調節、白細胞遷移、腺體發育、缺氧響應、多肽響應、金屬離子響應等生物過程，位于膜筏、γ-氨基丁酸A 型受體、肽酶抑制劑復合物、膜微區、細胞前沿、髓鞘、離子通道復合物、細胞質囊泡等細胞結構組成部位，富集的分子功能涉及調節絲氨酸型內肽酶、絲氨酸水解酶、內肽酶等酶活性，調控遞質門控離子通道活性與細胞外配體門控離子通道活性，促進轉錄共調節因子、細胞因子受體及轉錄共激活因子的結合，參與介導氮代謝、HIF-1 信號通路、甲狀腺激素信號通路、AGE-RAGE 信號通路、癌癥轉錄失調、腫瘤miRNA、腫瘤蛋白聚糖、膀胱癌及胃癌的相關腫瘤信號通路等通路。此分析顯示，兒茶素的抗炎、抗癌功效具有多靶點、多通路的特性。

進而利用8 種兒茶素及其抗炎、抗癌靶點和KEGG 通路富集的前20 條通路，構建兒茶素抗炎、抗癌的“組分-靶點-通路”網絡模型，結果如圖6 所示，其中，藍色、紅色、紫色節點分別表示組分、靶點、通路。通過分析度值、平均最短路徑及介值等拓撲學參數，比較各兒茶素的抗炎、抗癌活性，結果如表1 所示。由表1 度值比較可知，各兒茶素單體的抗炎活性強弱依次為：CG＞GCG＞ECG＞EGCG＞EC＞C＞EGC、GC；抗癌活性強弱依次為：CG＞GCG＞ECG、EGCG＞EC＞C＞EGC＞GC。8 種兒茶素的抗炎、抗癌活性顯示了相近的變化趨勢，即4 種酯型兒茶素（CG、GCG、ECG、EGCG）的抗炎、抗癌活性強于非酯型兒茶素（EC、C、EGC、GC）；酯型兒茶素中，反式構象（CG、GCG）的抗炎、抗癌活性強于順式構象（ECG、EGCG），但非酯型兒茶素以順式構象的活性更強；當其他取代基類型和空間位置相同時，兒茶酚型兒茶素的抗炎活性強于焦酚型（CG＞GCG，ECG＞EGCG，EC＞EGC，C＞GC）；除ECG 外，其他兒茶酚型兒茶素的抗癌活性強于其焦酚型結構（CG＞GCG，EC＞EGC，C＞GC）。這些預測結果提示，D 環沒食子酰基是兒茶素與多靶點相互作用的關鍵基團，該結構有利于兒茶素作用于多個抗炎、抗癌靶點；當C 環的C3連接D 環時，D 環和B 環上不在同一側有利于兒茶素與其抗炎、抗癌靶點結合，如果C3連接羥基，則羥基與B 環在同一側更利于兒茶素與靶點相互作用；B 環鄰苯三酚結構不利于大部分兒茶素與其抗炎、抗癌靶點相互作用。

表1 8 種兒茶素單體抗炎、抗癌活性的拓撲學參數Table 1 Topological parameters of the anti-inflammatory and anti-cancer activities of eight catechin monomers

圖6 兒茶素抗炎（a）和抗癌（b）的組分-靶點-通路網絡Fig.6 Component-target-pathway networks of catechins for anti-inflammatory (a) and anti-cancer (b)

2.4 8 種兒茶素與關鍵靶點蛋白的相互作用

為進一步探究8 種兒茶素的抗炎、抗癌作用機制，在上述網絡藥理學篩選出的關鍵抗炎、抗癌靶點基礎上，本研究選取其中度值最高的IL6、TNF 和AKT1 三個靶點蛋白，采用分子對接技術模擬兒茶素與3 個靶點蛋白的相互作用，計算二者的結合能，并選取其中結合能最低的組合進行可視化處理，結果如表2 和圖7 所示。

表2 8 種兒茶素單體與3 種靶蛋白的結合能（kcal/mol）Table 2 Binding energy of eight catechin monomers to three target proteins (kcal/mol)

圖7 ECG-TNF（a）、CG-IL6（b）、EGCG-AKT1（c）的分子結合可視化圖Fig.7 Visualization of molecular binding of ECG-TNF (a),CG-IL6 (b),and EGCG-AKT1 (c)

由表2 可知，8 種兒茶素和IL6、TNF 和AKT1三個靶點蛋白的結合能均小于-5.5 kcal/mol，表明各兒茶素與3 個靶點蛋白均有較強的結合能力；各組分中，以ECG-TNF、CG-IL6 和ECG-AKT1 的結合能最低；8 種兒茶素與IL6 的結合能力大小依次為：CG＞GCG、EGCG＞C＞ECG＞GC＞EC、EGC；與TNF的結合能力強弱依次為：ECG＞EGCG＞CG＞GC＞GCG、C＞EC＞EGC；與AKT1 的結合能力大小依次為：ECG＞CG、EGCG＞GCG、C＞EGC、EC＞GC。這一結果說明，4 種酯型兒茶素與3 個關鍵靶蛋白的結合能力整體強于非酯型兒茶素；C2、C3立體構象對兒茶素與靶點蛋白結合的影響因靶蛋白不同而異，順式構象利于兒茶素與TNF、AKT1 結合，但反式兒茶素與IL6 的相互作用強于其順式構象；B 環羥基數目對兒茶素-靶蛋白相互作用的影響較復雜，但大部分兒茶酚型兒茶素與三個關鍵靶蛋白的結合能力強于其焦酚型結構。進而，利用PyMol 軟件對ECGTNF、CG-IL6、EGCG-AKT1 這3 組對接結合能較低的靶點與組分間的分子對接結果進行可視化處理，由圖7 可知，ECG 通過氫鍵與TNF 的亮氨酸26、色氨酸28 和天冬酰胺46 結合，鍵長均為2.4；通過氫鍵與TNF 的丙氨酸134、異亮氨酸136 結合，鍵長分別為2.6、2.2。CG 與IL6 的精氨酸30、谷氨酰胺175 以氫鍵結合，鍵長分別為2.7、2.3；與IL6 的精氨酸179 形成3 個氫鍵，鍵長分別為2.5、2.6 和2.8；與IL6 的精氨酸182 形成2 個氫鍵，鍵長分別為2.0、2.4。EGCG 通過氫鍵與AKT1 的谷氨酸17、酪氨酸18、異亮氨酸19、精氨酸23、精氨酸25、天冬酰胺54 及精氨酸86 結合，鍵長均小于2.6。說明三種酯型兒茶素單體通過多個氫鍵與關鍵抗炎、抗癌靶點蛋白的不同氨基酸殘基結合，且鍵長均小于2.8，結合作用較強。

結合上述體外細胞模型、網絡藥理學預測結果可知：a.與非酯型兒茶素相比，酯型兒茶素與關鍵靶蛋白的結合能力更強、作用靶點更多，體外抗炎、抗腫瘤活性更強，Fechtner 等[38]研究同樣發現，酯型兒茶素EGCG 對人類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞、鼻粘膜成纖維細胞和A549 支氣管上皮細胞[39]的體外抗炎活性強于非酯型兒茶素EGC、EC、C；Kinjo等[10]亦指出，D 環沒食子酰基能夠增強兒茶素對人胃癌細胞MK-1 的抑制活性。酯型兒茶素與關鍵抗炎、抗癌靶蛋白具有更強的結合能力，與其具有更多的羥基，更易與靶蛋白形成氫鍵有關，陳榆[40]指出酯型兒茶素（EGCG 和ECG）較非酯型兒茶素（EC 和EGC）與黃嘌呤氧化酶的催化活性中心有更多π-π 疏水相互作用力和氫鍵作用，說明酯型兒茶素與其結合的作用更強，從而阻礙底物黃嘌呤進入活性位點，起到競爭性抑制，進而阻礙黃嘌呤氧化成尿酸。b.兒茶酚型兒茶素的抗炎、抗癌靶點較焦酚型更多，與關鍵靶蛋白的結合能力更強。但焦酚型兒茶素的體外抗炎、抗癌活性更強，提示了除作用靶點數目及與IL6、TNF、AKT1 的結合能力外，存在其他因素調控B 環對兒茶素抗炎、抗癌活性的影響。雷志偉等在比較兒茶素及其類似物抗流感病毒活性的構效關系時發現，多酚B 環羥基的數目并非與其抗病毒活性呈正相關，B 環的多羥基結構會引起空間位阻，不利于兒茶素活性的發揮[41]。此外，Babich 等[20]發現B 環的鄰苯三酚結構可能會削弱酯型兒茶素對口腔腫瘤細胞HSC-2 的增殖抑制作用，這種現象可能與不同結構兒茶素的親疏水性差異有關[19]，沒食子酰基能夠提高兒茶素的疏水性，增強其與細胞膜的磷脂雙分子層結合[14,42-43]，但B 環的鄰苯三酚結構卻降低了兒茶素與磷脂雙分子層的親和力[44]。c.反式兒茶素與IL6 的結合能力較順式構象更強，抗炎活性更突出。本課題組前期研究發現，GCG 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞產生NO 的抑制作用強于EGCG，但后者對NO 合成酶（nitric oxide synthase，iNOS）的蛋白及mRNA 表達、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、IL6 的分泌等的抑制作用均強于GCG[45]，提示了GCG 可能通過調控iNOS、TNF-α、IL6 以外的其他靶點抑制NO 的產生。Li等[46]研究發現，EGCG 抑制LPS 誘導的脂肪細胞3T3-L1 產生單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）產生的作用強于GCG，但二者對炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL6）、活化的B 細胞核因子κ-輕鏈增強子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NFκB）的抑制作用相當。這些結果表明，順/反式兒茶素的抗炎活性可能因模型不同而存在差異，且可能通過多種途徑調控抗炎活性的發揮。

3 結論

本研究利用體外小鼠巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型和人結腸癌細胞HCT116 癌癥模型，結合網絡藥理學和分子對接技術，分析發現EGCG 等8 種兒茶素均具有較強的體外抗炎、抗癌活性，但其功能活性因分子結構不同而異。其中，兒茶素分子結構中B 環的鄰苯三酚結構、D 環沒食子酰基與C 環C2、C3的反式構象更有利于兒茶素體外抗炎、抗癌活性的發揮，但B 環的鄰苯三酚結構與D 環沒食子酰基之間可能具有拮抗效應。8 種兒茶素較強的體外抗炎、抗癌活性得益于其與多靶點的相互作用，D 環沒食子酰基和B 環兒茶酚型結構能夠增強兒茶素與IL6、TNF 及AKT1 等多個炎癥、癌癥靶點的調控與相互作用，從而促進兒茶素體外抗炎、抗癌活性的發揮。本研究探究的兒茶素抗炎、抗癌構效關系及其作用機制的預測結果，為未來利用細胞、動物模型等深入研究兒茶素功能活性的構效機制提供了前期的理論研究基礎。