基于多光譜技術(shù)分析綠原酸與肌原纖維蛋白相互作用的初步研究

李 杰，郭 欣,2,3，袁天帥，屈啟超，朱新榮,2,3, ，張 建,2,3,

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特色農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003；3.食品營養(yǎng)與安全控制兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003）

多酚是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，含多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)，主要來源于水果、蔬菜和中草藥[1]。多酚是天然的抗氧化劑，在食品貯藏保鮮上起到延緩脂質(zhì)/蛋白質(zhì)氧化，提高食品品質(zhì)的作用，通常以功能添加成分用于食品加工。目前已有研究報(bào)道，植物多酚能替代合成的抗氧化劑添加到肉類食品中，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，延長貨架期[2-3]。

多酚與蛋白質(zhì)具有良好的親和性，能通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用形成復(fù)合物，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，優(yōu)化蛋白功能性質(zhì)，進(jìn)而提升產(chǎn)品感官特性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如，茶黃素、綠原酸和飛燕草素-3-O-葡萄糖苷影響β-乳球蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)；在中性條件下，低濃度茶多酚可以提高蛋清蛋白的抗氧化活性和乳化性能；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate，EGCG）Results 原 酸（Chlorogenic Acid，CA）能降低大豆7S 蛋白敏化的程度[4-6]。此外，乳清分離蛋白與EGCG，槲皮素，芹菜素和柚皮素的共價(jià)作用可提升蛋白抗氧化力；豌豆分離蛋白與EGCG，CA 和白藜蘆醇的非共價(jià)相互作用可提升蛋白的乳化性、起泡性以及消化率等功能性質(zhì)；乳鐵蛋白-單寧配合物能增加蛋白的泡沫穩(wěn)定性[7-9]。

肌原纖維蛋白（Myofibrillar Protein，MP）是組成肌肉中肌原纖維的主要蛋白質(zhì)，約占肌肉總蛋白的50%～60%，通常作為衡量肌肉品質(zhì)的主要指標(biāo)，也對蛋白質(zhì)產(chǎn)品的乳化、起泡、凝膠性質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。已有研究報(bào)道多酚在氧化條件下對肌原纖維蛋白具有延緩蛋白質(zhì)降解、保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及提高蛋白質(zhì)凝膠性等影響[10-11]。然而，多酚與肌原纖維蛋白的相互作用通過多光譜學(xué)技術(shù)分析不同濃度多酚-蛋白的結(jié)合對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，以及采用熱力學(xué)技術(shù)分析多酚-蛋白相互作用力的探索鮮有系統(tǒng)研究。

因此，本文以高白鮭MP 為研究對象，通過與不同濃度CA 的相互作用，探究多酚-蛋白復(fù)合物的總巰基含量，表面疏水性的理化性質(zhì)；傅里葉紅外光譜，三維熒光光譜探究蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)變化；最后通過同步熒光光譜，紫外光譜等多光譜學(xué)技術(shù)并結(jié)合熱力學(xué)變化分析多酚-蛋白質(zhì)的結(jié)合能力情況，闡明水溶性多酚CA 與高白鮭MP 的結(jié)合性質(zhì)，旨在為多酚與肌原纖維蛋白相互作用提供有價(jià)值的信息，為后續(xù)不同結(jié)構(gòu)多酚-高白鮭肌球蛋白的凝膠特性變化及作用機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮高白鮭（Coregonus peled）新疆溫泉縣賽湖漁業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司提供；綠原酸（純度＞98%）上海源葉生物科技有限公司；5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、三羥甲基氨基甲烷（Trihydroxymethyl Aminomethane，Tris）、溴化鉀 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；氯化鉀、氯化鈉、乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、1-苯胺基萘-8-磺酸、尿素 天津永晟精細(xì)化工有限公司；鹽酸 北京化工廠；以上試劑均為分析純。

T-3200 紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；F-4700 熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；970CRT 熒光分光光度計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司；NicoletiS10 傅里葉遠(yuǎn)紅外光譜儀、Thermo Multifuge XIR 冷凍高速離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司；1X71 多功能酶標(biāo)儀 美國博騰儀器有限公司；HX-10-50B 真空冷凍干燥機(jī) 上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 參考Guo 等[12]方法略調(diào)整。采用10 倍體積去離子水（4 ℃預(yù)冷）與魚肉背部肌肉混合于10000 r/min 均質(zhì)30 s。勻漿4 ℃離心10 min（8000 r/min）后取沉淀，沉淀與10 倍體積0.3% NaCl 溶液混合重復(fù)上述步驟一次。再次取沉淀與4 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl 提取液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）混合，4 ℃下浸提1 h，使肌原纖維蛋白充分溶解。2 層紗布過濾，收集濾液。濾液用預(yù)冷去離子水以1:4（v:v）比例稀釋，4 ℃離心10 min（8000 r/min）取沉淀。加入20 mmol/L 的PBS 緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）重新溶解沉淀，并用1 層紗布過濾，濾液即為肌原纖維蛋白溶液。蛋白濃度采用雙縮脲法進(jìn)行測定。

1.2.2 綠原酸（CA）與肌原纖維蛋白的孵育 將1.2.1 制備的肌原纖維蛋白溶液采用20 mmol/L 的PBS 緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH7.0）稀釋至10 mg/mL；用相同PBS 緩沖液制備10 mmol/L CA 母液，分別加入等體積的不同濃度CA 溶液，使其終濃度為6、30、150 和300 μmol/g，25 ℃反應(yīng)2 h，以未加多酚的蛋白加入相同體積PBS，作為空白對照（以每克肌原纖維蛋白含量為基準(zhǔn)計(jì)算，調(diào)整CA 濃度，以下實(shí)驗(yàn)方法中，CA 濃度均如此確定）。

1.2.3 總巰基含量測定 參考 Liu 等[13]方法并做調(diào)整，測定按1.2.2 條件制備的CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g 肌原纖維蛋白樣品的總巰基含量。用20 mmol/L PBS 緩沖液分別將以上樣品液稀釋至1 mg/mL。取1 mL 蛋白樣品，加入4 mL 50 mmol/L 的緩沖液（含0.6 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，8 mmol/L 尿素，pH7.0）。取4 mL 上述混合液，加入0.4 mL 的0.2 mmol/L 的5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸），充分混勻后40 ℃反應(yīng)25 min（水浴），412 nm 處測定吸光度。以20 mmol/L 的PBS 緩沖液作為空白對照。

式中：R，總巰基含量，μmol/g；A，吸光度；B，蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；C，摩爾吸光系數(shù)13.6，mol·cm/mL；D，稀釋倍數(shù)。

1.2.4 表面疏水性測定 參考Pessato 等[14]的方法使用1-苯胺基萘-8-磺酸（ANS）測定按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）的表面疏水性。將樣品的蛋白質(zhì)濃度分別稀釋至0.05～0.2 mg/mL。將20 μL 8 mmol/L ANS（10 mmol/L 磷酸緩沖液中，pH7.0）與4 mL 蛋白質(zhì)樣品混合。混合物置于黑暗中保持2 min。在390 nm 激發(fā)波長和470 nm 發(fā)射波長下記錄熒光強(qiáng)度。通過計(jì)算熒光強(qiáng)度值對蛋白質(zhì)濃度的初始斜率，獲得樣品的表面疏水性。

1.2.5 傅里葉紅外變換光譜（FTIR）參照吳黎明等[15]的方法。將按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）在4 ℃去離子水中透析，反復(fù)更換透析液。透析12 h后，樣品冷凍過夜，后續(xù)用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。樣品與溴化鉀以1:100 比例進(jìn)行研磨，壓片。以溴化鉀為背景，掃描波段為400～4000 cm-1，用Peak fit 軟件進(jìn)行分析。

1.2.6 同步熒光光譜的測定 參考王志軍等[16]的方法，利用970CRT 熒光分光光度計(jì)對按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）進(jìn)行測定。用20 mmol/L 的PBS 緩沖液將樣品稀釋至0.4 mg/mL。分別在波長差 Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 下記錄樣品的同步熒光光譜。

1.2.7 三維熒光光譜的測定 參考Guo 等[11]的方法測定按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）。樣品采用20 mmol/L PBS 緩沖液分別稀釋至0.1 mg/mL 后，利用F-4700熒光光度計(jì)測定，記錄200～500 nm 波段的熒光光譜。

1.2.8 紫外吸收光譜的測定 將按1.2.2 制備的蛋白樣品（添加CA 終濃度分別為6、30、150 和300 μmol/g）分別用PBS 緩沖液（20 mmol/L）稀釋至1 mg/mL，記錄200～700 nm 波段樣品的紫外吸收光譜。

1.2.9 熒光猝滅及熱力學(xué)分析測定 參考李改霞等[17]的方法測定。熱力學(xué)分析采用溫度段為25～45 ℃，而高濃度多酚在較高溫度下，會加速蛋白沉淀，測試效果極差；同時(shí)為保證熒光猝滅數(shù)據(jù)曲線擬合的精度，本實(shí)驗(yàn)選擇小范圍內(nèi)的多酚終濃度（0、20、40、60、80、100、120、140、160 μmol/g CA）進(jìn)行掃描熒光光譜。樣品用20 mmol/L 的PBS 緩沖液稀釋至0.4 mg/mL，分別加入等體積不同濃度CA（終濃度為0～160 μmol/g），分別在25、35、45 ℃反應(yīng)2 min。利用970CRT 熒光分光光度計(jì)，在激發(fā)波長λex=280 nm，狹縫5 nm，記錄300～450 nm 波段數(shù)據(jù)。

利用Stern-Volmer 方程計(jì)算分析動態(tài)和靜態(tài)猝滅機(jī)制：

式中：F0，初始熒光強(qiáng)度；F，添加的猝滅劑的熒光強(qiáng)度；Kq，淬滅速率常數(shù)；τ0，沒有任何猝滅劑的生物分子的平均熒光壽命（τ0=10-8s）；Ksv，淬火常數(shù)；[Q]，淬滅劑的濃度。

利用雙對數(shù)方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量（n），分析靜態(tài)猝滅。計(jì)算方程如下：

通過Van’t Hoff 公式可計(jì)算蛋白質(zhì)和多酚在結(jié)合過程中相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)[18]。獲得相應(yīng)溫度（25、35、45 ℃）下的焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變化（ΔG）。

式中：T，絕對溫度；Ka，相對溫度下的結(jié)合常數(shù)；R，氣體常數(shù)8.314，J/（mol·K）。

通過上述公式（2）～（5）計(jì)算確定蛋白質(zhì)-多酚體系中的主要作用力的類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對不同批次制備的新鮮樣品分別重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。用SPSS 25.0 進(jìn)行方差分析，以考慮平均值之間的顯著性水平（P＜0.05），并用Origin 8.5 構(gòu)建圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)如果發(fā)生變化，通常可通過總巰基含量的改變得到印證。如圖1 所示，相比對照組，依次添加不同濃度CA，蛋白質(zhì)總巰基含量分別下降2.99%，10.93%，17.30%，25.65%，結(jié)果表明總巰基含量隨CA 濃度呈劑量依賴性下降，且均與對照組呈顯著差異（P＜0.05）。為防止巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，排除因二硫鍵的生成而導(dǎo)致巰基含量下降，在反應(yīng)試劑中添加了尿素阻斷此反應(yīng)。因此，結(jié)果表明巰基含量下降的主要原因是CA 與蛋白的相互作用。CA 具有5 個(gè)羥基，可以通過多酚羥基與蛋白質(zhì)巰基基團(tuán)形成分子間氫鍵[19]。此外，本實(shí)驗(yàn)在大氣環(huán)境中進(jìn)行，故不可避免的發(fā)生氧化作用。酚類物質(zhì)在反應(yīng)過程中易被氧化成不穩(wěn)定的醌類物質(zhì)，進(jìn)而與巰基發(fā)生加成反應(yīng)，形成硫醇-醌加成產(chǎn)物，導(dǎo)致巰基含量進(jìn)一步降低[20]。與Cheng 等[21]研究結(jié)果相似，桑葚多酚中的蘆丁，槲皮素以及咖啡酸均會降低肌原纖維蛋白的總巰基含量。

圖1 綠原酸對肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig.1 Effect of chlorogenic acid on total sulfhydral content of myofibrillar protein

2.2 表面疏水性分析

外源性熒光探針ANS 可以反映疏水位點(diǎn)的表面暴露和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。如圖2 所示，與對照相比，添加6、30 μmol/g CA 后，蛋白質(zhì)表面疏水性分別下降2.28%和8.26%，有下降趨勢但不顯著。進(jìn)一步添加150、300 μmol/g CA，蛋白表面疏水性顯著下降31.66%和40.26%（P＜0.05）。一方面，多酚可通過疏水相互作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，降低表面疏水性。另一方面，具有酚羥基結(jié)構(gòu)的多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，引入額外的羥基會增加蛋白質(zhì)的親水環(huán)境，阻礙ANS 的激發(fā)，并降低其熒光強(qiáng)度。此外，有研究發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)會與熒光探針ANS 競爭與蛋白質(zhì)芳香環(huán)上的疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)結(jié)合位點(diǎn)[22]。Jiang等[23]從疏水性層面的探究推斷CA 影響乳清分離蛋白的表面疏水性比酪蛋白表面疏水性更劇烈，其原因是由于乳清分離蛋白對CA 具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，因此導(dǎo)致乳清分離蛋白的表面疏水性下降程度更高。胡云鵬[24]研究表示少量多酚誘導(dǎo)蛋白解折疊，暴露內(nèi)部疏水基團(tuán)，引起表面疏水性的增加；但疏水基團(tuán)的持續(xù)暴露會使蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生疏水相互作用而聚集，導(dǎo)致疏水基團(tuán)的屏蔽，因此外源性熒光探針無法結(jié)合。本結(jié)果與上述學(xué)者研究類似，隨著CA 濃度的增加，蛋白質(zhì)表面疏水性顯著下降，CA 與蛋白的相互作用減少了熒光探針與蛋白的結(jié)合機(jī)率。同時(shí)由后續(xù)的FTIR 結(jié)果也可證實(shí)蛋白隨CA 的增加而展開，持續(xù)性的疏水作用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集而掩蓋疏水基團(tuán)。

圖2 綠原酸對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of chlorogenic acid on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.3 綠原酸對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖3 為不同濃度CA 作用于蛋白質(zhì)的紅外吸收光譜譜圖以及解譜后得到的二級結(jié)構(gòu)含量圖。其中圖3（a）顯示了特征峰強(qiáng)度的變化，1500～1600 cm-1為酰胺Ⅱ帶，主要與蛋白的C-N 拉伸振動以及NH 彎曲振動有關(guān)；1600～1700 cm-1為酰胺Ⅰ帶，主要與C=O 伸縮振動有關(guān)。酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶無明顯的波段位移，但在峰強(qiáng)度上有很明顯的變化，說明CA 影響分子間相互作用[25]。

圖3 綠原酸對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of chlorogenic acid on secondary structure of myofibrillar protein

酰胺Ⅰ帶對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化較為敏感，廣泛用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化研究。通過Peak Fit 對酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）的解譜。如圖3（b）所示，隨著升高CA 濃度，相較于對照組，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生變化。尤其是添加30、150、300 μmol/g CA分別使α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低28.80%，29.85%和28.85%，而β-折疊含量顯著增加28.07%，30.33%和27.92%（P＜0.05）。蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)可向β-折疊轉(zhuǎn)化，這通常是蛋白質(zhì)分子變性和展開的結(jié)果[26]。β-轉(zhuǎn)角含量顯著上升（P＜0.05），無規(guī)卷曲含量降低，但相較α-螺旋變化可忽略。本研究結(jié)果中，α-螺旋含量的降低表明蛋白的二級結(jié)構(gòu)在CA 作用下由有序轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序狀態(tài)。Huang 等[27]研究與本研究結(jié)果相似，肌原纖維蛋白α-螺旋含量與迷迭香酸、鼠尾草酸和鼠尾草酚劑量呈負(fù)相關(guān)。三種多酚均對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，此外多酚中羥基的數(shù)量與其結(jié)合能力相關(guān)。

2.4 同步熒光分析

蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化也可采用同步熒光研究分析。通常根據(jù)蛋白質(zhì)的同步熒光譜中，色氨酸（波長差Δλ為60 nm）和酪氨酸殘基（波長差Δλ為15 nm）的光譜信息來推斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[28]。

如圖4 所示，對照組中色氨酸的熒光強(qiáng)度為594.18，酪氨酸的熒光強(qiáng)度為334.63，這表明蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度主要來源于色氨酸。當(dāng)添加CA 后，熒光強(qiáng)度隨CA 濃度呈濃度依賴式降低。當(dāng)CA 濃度為300 μmol/g 時(shí)，與對照組相比，樣品蛋白質(zhì)中色氨酸與酪氨酸的熒光強(qiáng)度分別降低了80.20%和72.30%。此結(jié)果表明CA 對色氨酸的猝滅效果強(qiáng)于酪氨酸，意味著色氨酸在CA 與MP 的相互作用中起著關(guān)鍵作用。此外，色氨酸發(fā)生紅移，酪氨酸發(fā)生藍(lán)移，表明CA 對MP 熒光存在猝滅作用，且蛋白質(zhì)色氨酸殘基周圍微環(huán)境發(fā)生變化，親水性增加，而酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性增加，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化。溫鶴迪等[29]在卵白蛋白與CA 復(fù)合物研究表明色氨酸與酪氨酸微環(huán)境均向疏水環(huán)境變化，且色氨酸猝滅強(qiáng)度大于酪氨酸，由此判斷色氨酸殘基位置更接近于蛋白-多酚的結(jié)合位點(diǎn)。與本研究的氨基酸殘基微環(huán)境變化結(jié)果不符的原因，可能是蛋白質(zhì)種類或多酚的濃度不同導(dǎo)致。

圖4 綠原酸對肌原纖維蛋白同步熒光光譜的影響Fig.4 Effect of chlorogenic acid on synchronous flurescence spectra of myofibrillar protein

2.5 三維熒光分析

三維熒光光譜可反映全部熒光特征信息。Peak 1 主要與酪氨酸和色氨酸的殘基的光譜行為有關(guān)，Peak 2 主要與多肽鏈結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)[30]。圖5 結(jié)果表明，隨著CA 濃度的上升，酪氨酸和色氨酸的熒光強(qiáng)度依次減小。同時(shí)，Peak 2 峰的峰面積與熒光強(qiáng)度降低，說明CA 改變了MP 的蛋白結(jié)構(gòu)。由FTIR 結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨CA 濃度的增加而逐漸展開，這會暴露蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)。在進(jìn)一步高含量的多酚存在下，可能通過疏水作用結(jié)合，從而導(dǎo)致了熒光強(qiáng)度的降低[31]。此結(jié)果與上述的同步熒光和二級結(jié)構(gòu)結(jié)果可相互印證。Sui 等[32]研究大豆蛋白與花青素的共價(jià)與非共價(jià)相互作用時(shí)，三維熒光光譜中的Peak 1 特征峰顏色顯著變淺，Peak 2 區(qū)域變小甚至消失，這表明色氨酸和酪氨酸殘基被消耗或屏蔽。同時(shí)，與非共價(jià)相互作用形成的復(fù)合物相比，共價(jià)作用能使花青素與色氨酸和酪氨酸殘基結(jié)合表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光猝滅。此外，膳食姜黃素喂養(yǎng)的鴨肉肌原纖維蛋白，其蛋白的三維熒光光譜Peak 1 峰熒光強(qiáng)度隨姜黃素含量的增加而下降[33]。以上研究均表明多酚對蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度及肽鏈結(jié)構(gòu)具有猝滅和展開作用。

圖5 綠原酸對肌原纖維蛋白三維熒光光譜的影響Fig.5 Effect of chlorogenic acid on three-dimensional fluorescence spectrum of myofibrillar protein

2.6 綠原酸對肌原纖維蛋白紫外光譜的影響

紫外-可見吸收光譜在一定程度上可反映蛋白質(zhì)與小分子化合物的相互作用。圖6 為MP 與CA 在不同濃度下的紫外吸收光譜。MP 在280 nm 附近具有顯著的紫外吸收峰（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的特征吸收）。多酚的加入增加了蛋白質(zhì)在280 nm 處的吸收值，表明埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的芳香氨基酸被暴露出來，即氨基酸微環(huán)境或蛋白結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合時(shí)發(fā)生變化。同時(shí)，觀察到在280 nm 附近的吸收峰在CA 存在的情況下顯示出顯著的紅移（從277.5 nm 到284.8 nm），表明結(jié)合位點(diǎn)的極性在與多酚結(jié)合時(shí)發(fā)生了改變。值得注意的是，在超過150 μmol/g 的CA 濃度下產(chǎn)生了一個(gè)新的紫外吸收峰，這可能是CA 本身的吸收峰，并且新峰出現(xiàn)的位置與多酚結(jié)構(gòu)有關(guān)。Xu 等[4]在β-乳球蛋白與三種多酚相互作用的研究中發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白-茶黃素系統(tǒng)的紫外光譜譜圖中，在370 nm 和470 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰；而在β-乳球蛋白-綠原酸系統(tǒng)的紫外譜圖中，342 nm 處出現(xiàn)新峰。此結(jié)果與本研究結(jié)果類似。動態(tài)猝滅并不改變物質(zhì)的吸收光譜，只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，而靜態(tài)猝滅會改變熒光分子的吸收光譜（復(fù)合物的形成）[34]。基于以上，可以推斷MP-CA之間的猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅。

圖6 綠原酸對肌原纖維蛋白紫外光譜的影響Fig.6 Effect of chlorogenic acid on ultraviolet absorption spectral of myofibrillar protein

2.7 熒光猝滅與熱力學(xué)分析

將 CA 加入到MP 溶液后，二者之間會形成MPCA 復(fù)合物而導(dǎo)致蛋白自身的熒光強(qiáng)度的降低，即熒光猝滅[35]。熒光猝滅主要有兩種類型：靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。猝滅劑與熒光團(tuán)發(fā)生擴(kuò)散和碰撞而導(dǎo)致的稱為動態(tài)猝滅；靜態(tài)猝滅則是兩者之間形成了基態(tài)復(fù)合物[36]。通常，可依據(jù)擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)Kq來判斷熒光猝滅的類型，當(dāng)Kq＞2.0×1010L/mol/s 時(shí)，為靜態(tài)猝滅；反之則為動態(tài)猝滅。

為了闡明猝滅機(jī)制，MP-CA 的Stern-Volmer 曲線及其數(shù)據(jù)如圖7 和表1 所示。根據(jù)Stern-Volmer方程，F(xiàn)0/F 與多酚濃度的曲線顯示出良好的線性關(guān)系（R2＞0.9）。Kq值（4.008～4.582×1012L/mol/s）大于猝滅常數(shù)2.0×1010L/mol/s。乳清蛋白和綠原酸、EGCG 與扇貝性腺分離蛋白的結(jié)合也有類似的結(jié)果[37-38]。

表1 不同溫度下CA-MP 反應(yīng)的熒光猝滅參數(shù)Table 1 Fluorescence quenching parameters of CA-MP reaction at different temperature

圖7 綠原酸對肌原纖維蛋白熒光猝滅的影響Fig.7 Effect of chlorogenic acid on fluorescence quenching of myofibrillar protein

采用雙對數(shù)曲線方程分析靜態(tài)猝滅數(shù)據(jù)，可獲得結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），結(jié)果見表1。在本研究中，三個(gè)溫度條件下的n 值均接近1，這意味著MP 上可能有一個(gè)酚類化合物的單一結(jié)合位點(diǎn)。Ka的值大于104L/mol/s 表明對多酚的親和力很高。此外，Ka隨著溫度的變化而增加，這表明MPCA 復(fù)合物的形成變得更加有利，并且復(fù)合物的穩(wěn)定性增加，這是疏水相互作用的特征[39]。這與以下熱力學(xué)參數(shù)結(jié)果一致。

多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合物的相互作用力包括氫鍵、范德華力、疏水作用等，ΔH、ΔS 的正負(fù)值可用于判斷復(fù)合物之間的相互作用力的類型。當(dāng)ΔH＜0，而ΔS＞0 時(shí)，則靜電相互作為主導(dǎo)作用力；當(dāng)ΔH＜0，ΔS＜0 時(shí)，則氫鍵和范德華力作為主導(dǎo)作用力；而當(dāng)ΔH＞0，ΔS＞0 時(shí)，則疏水作用作為主導(dǎo)作用力[40]。如表1 所示，ΔG 均為負(fù)數(shù)，表明此結(jié)合是自發(fā)反應(yīng)，且ΔH＞0，ΔS＞0，可知MP-CA 結(jié)合的相互作用力主要為疏水作用力。許多研究表明，多酚和蛋白質(zhì)主要通過疏水相互作用、氫鍵和范德華力結(jié)合[41]。由于羥基的存在，蛋白質(zhì)和多酚之間的氫鍵相互作用也是可能的。已有研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白和EGCG 通過氫鍵和范德華力相互作用，但花生蛋白與CA 主要通過靜電相互作用形成復(fù)合物[8]。本文中的這種不一致性可能歸因于不同蛋白質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

綠原酸與高白鮭肌原纖維蛋白的相互作用會改變蛋白活性基團(tuán)含量與結(jié)構(gòu)構(gòu)象，造成蛋白側(cè)鏈氨基酸活性基團(tuán)的損耗以及蛋白結(jié)構(gòu)展開。在長期暴露蛋白內(nèi)部疏水性的基礎(chǔ)上，30～300 μmol/g 綠原酸的羥基與蛋白相互作用，屏蔽蛋白表面疏水性。多光譜學(xué)技術(shù)驗(yàn)證了綠原酸與肌原纖維蛋白通過疏水相互作用結(jié)合，在靜態(tài)猝滅下產(chǎn)生復(fù)合物，且色氨酸殘基距離相互作用位點(diǎn)更近。本研究通過多光譜學(xué)技術(shù)結(jié)合熱力學(xué)分析推斷綠原酸-肌原纖維蛋白的結(jié)合性質(zhì)，為分子層面的模擬提供理論依據(jù)，也為后續(xù)研究不同結(jié)構(gòu)多酚-肌球蛋白相互作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。