葉綠素對葉黃素生物可給率的影響

黃千千，陳麗君，李韻唱，陳雪寒，陳乾睿，王元楷，蔡 甜，陳科偉,4,5,6,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400715；3.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715；4.西南大學(xué)中匈食品科學(xué)合作中心，重慶 400715；5.川渝共建特色食品重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

葉黃素廣泛存在于植物中，是一種優(yōu)良的抗氧化劑。人類視網(wǎng)膜中含有大量的葉黃素，可在一定程度上過濾進(jìn)入人眼視網(wǎng)膜的藍(lán)光，有效降低視覺損害[1]，還可以降低老年性黃斑變性的風(fēng)險(xiǎn)[2]。葉黃素結(jié)構(gòu)中的C40 類異戊二烯碳骨架和10 個(gè)共軛雙鍵使得葉黃素的溶解度較差，并且對光和氧非常敏感[3]。另外在胃腸道消化過程中也會(huì)發(fā)生降解，最終導(dǎo)致葉黃素在腸道中的吸收很少，生物可給率低?？紤]到從食物中攝取是獲得葉黃素的唯一來源，因此如何高效補(bǔ)充葉黃素成為研究熱點(diǎn)。目前常采用遞送系統(tǒng)（用脂質(zhì)體、納米顆粒、乳液、微膠囊等包埋）[4]來提高葉黃素的生物可給率，焦巖等[5]通過納米脂質(zhì)體的載體作用將葉黃素包囊形成納米結(jié)構(gòu)，改變其疏水性狀態(tài)，能有效提高葉黃素的穩(wěn)定性；王曉[6]采用微膠囊技術(shù)，制備高穩(wěn)定性和高生物利用度的負(fù)載葉黃素微膠囊。此外，石曉晴等[7]還通過物理包埋和化學(xué)改性（如酯化反應(yīng)）等方法改變劑型，并利用超微粉碎和微囊化等技術(shù)將葉黃素制備成油懸浮液、水分散性干粉、微膠囊和脂質(zhì)體。

在消化過程中有許多因素會(huì)影響葉黃素的生物可給率，包括葉黃素本身的物理/化學(xué)性質(zhì)、食物材料的微觀結(jié)構(gòu)、與其他食物成分的相互作用等[8]。研究表明葉黃素與部分食物成分的相互作用可有效防止其氧化降解[9]，如多酚、脂質(zhì)、膳食纖維等[10]。葉綠素與葉黃素共存于植物的葉綠體中，葉綠素也是一種脂溶性物質(zhì)且結(jié)構(gòu)多變，其分子由一個(gè)卟啉環(huán)和一個(gè)脂肪烴側(cè)鏈（植醇）組成，卟啉環(huán)的中央含有一個(gè)鎂原子[11]。葉綠素本身在光、熱、酸等理化因素下極不穩(wěn)定，易分解或氧化生成不同結(jié)構(gòu)的衍生物，在酸性條件下葉綠素卟啉環(huán)中央的鎂原子容易被氫離子取代生成脫鎂葉綠素，而在堿性或酸性作用下葉綠素容易水解脫去植基變成脫植基葉綠素[12]。高等植物中絕大多數(shù)葉綠素為葉綠素a 和葉綠素b，在酸、熱等過程中會(huì)形成脫鎂葉綠素a 和脫鎂葉綠素b，同時(shí)在可食用海藻如紫菜、海帶等中還存在大量的不含植醇鏈的葉綠素衍生物，如脫植基葉綠素和脫鎂葉綠酸[13]。目前國內(nèi)外關(guān)于葉綠素與其他脂溶性成分相互作用的研究較少，而大多集中在葉綠素的代謝[14]、脂質(zhì)的添加對葉綠素降解的作用[15]以及保護(hù)葉綠素不被氧化降解的措施[16]等。與葉黃素一樣，葉綠素需要被摻入膠束后才能有效地進(jìn)行腸吸收[17]，然而關(guān)于膳食葉綠素是否影響葉黃素生物利用還知之甚少，因此研究葉綠素及其結(jié)構(gòu)變化對葉黃素生物可給率的影響以及兩者共消化及膠束化過程中產(chǎn)生的相互作用具有重要意義。

本研究制備了8 種膳食中常見的葉綠素及其衍生物（葉綠素a 和b、脫鎂葉綠素a 和b、脫植基葉綠素a 和b、脫鎂葉綠酸a 和b，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1 和表1），利用體外靜態(tài)消化模型及膠束化實(shí)驗(yàn)研究它們對葉黃素生物可給率的影響，為研究如何提高葉黃素的生物利用度提供一定的參考。

表1 8 種常見葉綠素及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 Chemical structures of eight common chlorophylls and their derivatives

圖1 葉綠素的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Fundamental chemical structures of chlorophylls

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮菠菜、成熟酸橙（Citrus×aurantium（Lour.）Engl.）重慶當(dāng)?shù)厥袌?；長壽花金胚玉米油（1 L）山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司；純品葉黃素（CAS：127-40-2，純度≥90%）上海麥克林生化有限公司；乙醇（分析純）、丙酮（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）、鹽酸 重慶川東化工有限公司；N,N-二甲基甲酰胺 萬盛川東化工有限公司；2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）阿拉丁生物化學(xué)技術(shù)有限公司；乙酸銨、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、豬胰腺α-淀粉酶（≥5 U/mg）、豬胰腺胰蛋白酶（4 U/mg）、豬胃粘膜胃蛋白酶（≥250 U/mg）、豬胰腺脂肪酶（≥125 U/mg）、豬膽汁提取物（≥200 U/mg）Sigma-Aldrich（中國上海）；氯化鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉 成都科隆化工有限公司。

SPH-200B 恒溫?fù)u床 上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PB-10 標(biāo)準(zhǔn)型PH 計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BSA124S 分析天平 德國Sartorious 公司；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-II 型循環(huán)水真空泵、RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1290 infinity II 超高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；XP-DCY-12SL 圓形電動(dòng)水浴氮吹儀 上海析譜儀器有限公司；DW-HL398超低溫冷凍儲(chǔ)存箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90 納米粒度電位儀英國馬爾文儀器有限公司；Vortex-2 渦旋混勻儀 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；BX53 正置熒光顯微鏡 日本Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 8 種不同結(jié)構(gòu)葉綠素的制備 參考實(shí)驗(yàn)室已有的方法[18]提取葉綠素并進(jìn)行一些修改，本實(shí)驗(yàn)中的所有操作均在安裝有綠光燈且避光的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，以避免色素的光降解。將新鮮菠菜葉片洗凈、剪碎并打漿，與等比例的石油醚（30～60 ℃）進(jìn)行充分混合，用八層紗布過濾，棄去含有葉黃素和少部分葉綠素的第一次濾液，加入等體積的丙酮:乙醇=1:1 混合液提取濾渣中的葉綠素，重復(fù)操作直至綠色的菠菜濾渣轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。再用等體積的乙醚進(jìn)行復(fù)提，經(jīng)無水硫酸鈉過濾后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在常溫下減壓旋轉(zhuǎn)揮干乙醚及殘留的水分，最后用少量丙酮溶解并經(jīng)超聲3 min 后過濾（0.22 μm），即可得到葉綠素原液。將葉綠素原液均勻地點(diǎn)樣于1 mm 厚的濾紙板上，用配比為石油醚（60～90 ℃）:乙醇:甲醇=60:20:1 的層析液洗脫，進(jìn)行薄層層析。層析產(chǎn)生的藍(lán)綠色條帶為葉綠素a，黃綠色條帶為葉綠素b。將來自層析的葉綠素條切割并浸入等體積丙酮中以獲得相應(yīng)的葉綠素-丙酮溶液。

用植物組織制備的丙酮粉可以實(shí)現(xiàn)葉綠素的脫植基化，其中成熟的橙皮具有較高的葉綠素酶活性[18]。取成熟酸橙（C.aurantium（Lour.）Engl.）的外皮并用蒸餾水清洗，瀝干水分后放入-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存，使用時(shí)將酸橙皮剪碎后進(jìn)行破碎，加入等比例的冷丙酮（-20 ℃）進(jìn)行混勻，抽濾去除丙酮并置于通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，之后將其研磨并用30 目網(wǎng)篩進(jìn)行過篩，即可得到橙皮丙酮粉。稱取4 g 橙皮丙酮粉用30 mL，5 mmol/L 的PBS（pH7.0，50 mmol/L KCl，0.24% Trition-X-100）提取葉綠素酶，經(jīng)磁力攪拌器700 r/min 攪拌1 h 后用八層紗布過濾，濾液經(jīng)離心機(jī)5000 r/min 離心8 min 后，取上清液備用。將50 μL，1 μmol/mL 的葉綠素與0.2 mL 酶液以及0.2 mL，0.1 mol/L PBS（pH7.0，50 mmol/L MgCl2）混合并攪拌均勻。將葉綠素b 反應(yīng)液在搖床上于30 ℃下酶解1 h，將葉綠素a 反應(yīng)液在搖床上于40 ℃下酶解3 h。反應(yīng)結(jié)束后加入4 倍體積的丙酮終止其反應(yīng)，反應(yīng)液用等體積乙醚復(fù)提，經(jīng)無水硫酸鈉除水后，進(jìn)行常溫旋轉(zhuǎn)揮干，用少量丙酮溶解，得到的葉綠素丙酮溶液采用紙層析法可制備得到脫植基葉綠素a、b 溶液。

將5 mL，1 μmol/mL 的葉綠素a/b 或脫植基葉綠素a/b 丙酮溶液置于50 mL 離心管中，滴入2～3滴0.1 mol/L 的鹽酸溶液。不斷搖晃觀察到液體顏色由綠變褐后迅速加入純水20 mL，用乙醚復(fù)提。向有機(jī)相中加入等體積的10%氯化鈉水溶液，洗去有機(jī)相中的氫離子，重復(fù)3～4 次。將有機(jī)相減壓旋轉(zhuǎn)揮干，并用少量丙酮溶液進(jìn)行溶解，即可得到脫鎂葉綠素a/b 或脫鎂葉綠酸a/b 溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參考實(shí)驗(yàn)室已有的研究[19]和方法[20]并加以修改，對1.2.1 中所制備的8 種葉綠素溶液的具體濃度進(jìn)行測定，同時(shí)用葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品配制摩爾濃度分別為0.01、0.1、1.0 μmol/mL 的葉黃素-乙醇溶液，均采用與光電二極管陣列檢測器相偶聯(lián)的超高效液相色譜法（ultra-high performance liquid phase chromatography-diode array detector，UPLC-DAD），配備有自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)。分析柱為C18柱（Poroshell 120，1.9 μm，2.1×100 mm），并配有同等材料的保護(hù)柱。流動(dòng)相A 為甲醇:水=8:2 混合液，流動(dòng)相B 為甲醇:丙酮=1:1 混合液，向兩流動(dòng)相中分別加入10 mmol/L 乙酸銨，流速為0.2 mL/min。使用梯度洗脫程序：0～15 min，0%～100% B；15～20 min，100% B；20～25 min，0% B。最終根據(jù)保留時(shí)間及光譜特征對葉黃素和葉綠素進(jìn)行定性分析，得到的不同色素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)果見表2。

表2 不同色素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 2 Standard curve equations for different pigments concentrations

1.2.3 體外靜態(tài)消化 參考標(biāo)準(zhǔn)植物化學(xué)物質(zhì)的體外消化實(shí)驗(yàn)方法[19,21-23]，模擬口腔、胃和腸道三個(gè)階段的消化過程，設(shè)置三個(gè)消化實(shí)驗(yàn)組：葉黃素和葉綠素共消化、葉綠素單獨(dú)消化及葉黃素單獨(dú)消化。根據(jù)相關(guān)研究及人類日常膳食攝入量標(biāo)準(zhǔn)，類胡蘿卜的日均攝入量為14 mg[24]，總?cè)~綠素的日均攝入量為50～65 mg[25]，以此確定葉黃素體外消化的起始濃度為2.5～50 μmol/L，葉綠素的起始濃度應(yīng)為相應(yīng)葉黃素的3.5～4.5 倍，最終確定本研究中葉黃素的初始濃度為7.5 μmol/L，而葉綠素的初始濃度為葉黃素的4.2 倍，即31.5 μmol/L，并按照最終消化液體積為10 mL 來計(jì)算所需的葉黃素和葉綠素貯備液體積。每組均設(shè)置6 次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。

前處理：分別將葉黃素和不同結(jié)構(gòu)的葉綠素按照比例單獨(dú)或共同加到15 mL 樣品管中，進(jìn)行氮吹晾干后加入50 μL 玉米油，將其在功率為200 W 的超聲波清洗器中超聲10 min。其中玉米油為精煉油，以減少油中含有的少量葉黃素對反應(yīng)體系的影響。

口腔階段：將0.568 gα-淀粉酶溶于生理鹽水（140 mmol/L NaCl 和5 mmol/L KCl）中，最終體積為25 mL 作為模擬唾液。向每個(gè)樣品管中加入750 μL 模擬唾液和6.5 μL，0.3 mmol/L CaCl2溶液，用0.9 mol/L NaHCO3溶液將pH 調(diào)至7.0，補(bǔ)加生理鹽水使總體積為2.5 mL，37 ℃恒溫?fù)u床中85 r/min反應(yīng)2 min。

胃消化階段：將0.496 g 胃蛋白酶溶于生理鹽水（140 mmol/L NaCl 和5 mmol/L KCl）中，最終體積為25 mL 作為模擬胃液。向每個(gè)口腔階段消化結(jié)束后的樣品管中加入750 μL 模擬胃液和2.5 μL，0.3 mmol/L CaCl2溶液，用5 mmol/L HCl 溶液將pH 調(diào)至3.0，補(bǔ)加生理鹽水使總體積為5 mL，37 ℃恒溫?fù)u床中85 r/min 反應(yīng)2 h。

腸消化階段：將8.333 g 胰蛋白酶、5 g 膽鹽和2.222 g 胰脂肪酶溶于0.1 mol/L NaHCO3溶液中，最終體積為125 mL 作為模擬腸液。首先用0.9 mol/L NaHCO3溶液將pH 調(diào)至6.5 以終止胃消化，再向每個(gè)胃消化階段結(jié)束后的樣品管中加入3.75 mL 模擬腸液和10 μL，0.3 mmol/L CaCl2溶液，之后用0.9 mol/L NaHCO3溶液將pH 調(diào)至7.0，補(bǔ)加生理鹽水使總體積為10 mL，其它后續(xù)操作同上。

1.2.4 體外離心共膠束化 體外消化完成后，分別取1 mL 消化液于15、2.5 mL 樣品管，并分別置于-20 ℃（用于色素提?。┖? ℃（用于電位和粒徑檢測）下待用以抑制所有消化酶的作用。另取5 mL 消化液于15 mL 加厚離心管，置于離心機(jī)中，在4 ℃、12000 r/min 條件下離心1.5 h。離心完成后用0.2 μm尼龍膜過濾，得到混合膠束，分別取1 mL 膠束液于15、2.5 mL 樣品管，并分別置于-20 ℃（用于色素提?。┖? ℃（用于電位和粒徑檢測）下待用。

1.2.5 從消化液和膠束中提取色素 以消化液為例，向消化液中加入2 mL 飽和食鹽水和2 mL 丙酮（含0.1% BHT），搖勻后加入2 mL 乙醚提取有機(jī)相，吸取上層有機(jī)相于另一干凈樣品管，重復(fù)操作（至少3 次）直至上層有機(jī)相變?yōu)闊o色，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在常溫下減壓旋轉(zhuǎn)揮干有機(jī)溶劑及殘留水分，最后用1 mL 丙酮溶解粘附在蒸發(fā)瓶上的色素，渦旋2 min后用0.22 μm 尼龍膜過濾，用于超高效液相色譜分析，并根據(jù)1.2.2 中建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對消化液及膠束液中的葉黃素和葉綠素進(jìn)行定量測定。

1.2.6 Zeta 電位和粒徑的測定 對經(jīng)過體外消化后消化液和膠束液的粒徑和Zeta 電位進(jìn)行測定。分別將經(jīng)體外消化后置于4 ℃下的消化液和膠束液進(jìn)行樣品制備，采用納米粒度電位儀分別測定Zeta 電位和平均粒徑，使用純水作為分散體系，折射率為1.33。每個(gè)樣品進(jìn)行6 次獨(dú)立重復(fù)測定。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察消化液和膠束液形貌 葉綠素會(huì)吸收短波長的激發(fā)光，發(fā)射出更大波長的光作為熒光[26]，據(jù)此可以利用葉綠素?zé)晒獾奶匦?，將與葉黃素共消化或單獨(dú)消化后葉綠素在消化液和膠束液中的分布可視化。參考實(shí)驗(yàn)室已有的方法[19,21]并加以改進(jìn)，將葉綠素與葉黃素共消化或單獨(dú)消化后的少量消化液和膠束液分別均勻地涂布在載玻片上，用蓋玻片覆蓋。使用的激發(fā)射線波長為633 nm，收集的發(fā)射熒光波長范圍為650～700 nm[27]，用正置熒光顯微鏡以10×的放大率在熒光模式下觀察樣品。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)測定。

1.2.8 消化特性指標(biāo)的計(jì)算 體外消化特性指標(biāo)的相關(guān)計(jì)算如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究利用超高效液相色譜配備的Bruker Compass Data Analysis 5.1 數(shù)據(jù)處理軟件對體外消化前后不同結(jié)構(gòu)的葉綠素及其衍生物和葉黃素進(jìn)行定性定量分析，采用Origin 2022 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，運(yùn)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示具有顯著性差異。每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行6 次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)，最終結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外消化過程中葉黃素和葉綠素各項(xiàng)指標(biāo)的變化

2.1.1 回收率分析 回收率能夠反映體外消化后葉黃素和葉綠素被消化降解為無色物質(zhì)而損失的程度[21]，圖2（A）為葉黃素的回收率，其中葉黃素單獨(dú)消化時(shí)的回收率最低（51.91%），與不同結(jié)構(gòu)葉綠素共消化時(shí)葉黃素的回收率均升高，且與單獨(dú)消化時(shí)相比具有顯著差異（P＜0.05），說明不同結(jié)構(gòu)葉綠素均能對葉黃素的消化損失起到一定的抑制作用。其中脫鎂葉綠素b 對葉黃素的保護(hù)作用最強(qiáng)，兩者共消化時(shí)葉黃素的回收率高達(dá)90.48%，而脫植基葉綠素a 對葉黃素的保護(hù)作用最弱（71.60%）。圖2（B）為葉綠素及其衍生物的回收率，其中脫鎂葉綠素a 組在單獨(dú)消化及與葉黃素共消化時(shí)的回收率均最大，分別為91.67%和85.45%。初始投入葉綠素a、b 進(jìn)行消化，最終葉綠素b 組的回收率總體上高于葉綠素a 組，與之前的研究結(jié)果相一致[23]，這是因?yàn)樵诮Y(jié)構(gòu)上葉綠素 b 中 C7 位上的-CHO 比葉綠素 a 中的 -CH3更有助于穩(wěn)定葉綠素的卟啉結(jié)構(gòu)[21]。

圖2 體外消化后葉黃素和葉綠素及其衍生物的回收率Fig.2 Recovery rate of lutein,chlorophylls and their derivatives after in vitro digestion

2.1.2 膠束化率分析 混合膠束由膽鹽和脂肪消化產(chǎn)物等形成[28]，膠束化率是評價(jià)脂溶性化合物能被腸上皮細(xì)胞吸收的有效指標(biāo)[21]。圖3（A）為葉黃素的膠束化率，葉黃素單獨(dú)消化時(shí)的膠束化率可達(dá)83.27%，這是因?yàn)槿~黃素本身的極性較大，很容易通過脂滴表面進(jìn)入小腸內(nèi)與膽鹽等其他物質(zhì)形成混合膠束[29]。在共消化時(shí)，脫鎂葉綠素a、脫植基葉綠素b 以及脫鎂葉綠酸a 均使葉黃素的膠束化率降低，可能原因是這三種葉綠素與葉黃素在膠束化過程中發(fā)生復(fù)合形成了致密的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致葉黃素膠束化率降低[21]。而其他結(jié)構(gòu)的葉綠素則使葉黃素的膠束化率升高，其中脫鎂葉綠酸b 所對應(yīng)的葉黃素膠束化率最大，為89.80%。圖3（B）為葉綠素及其衍生物的膠束化率，脫鎂葉綠酸b 組在單獨(dú)消化及與葉黃素共消化時(shí)均呈現(xiàn)出最大的膠束化率，分別為96.16%和86.64%，且兩者間具有顯著性差異（P＜0.05）。脫鎂葉綠酸a 組的膠束化率總體上低于脫鎂葉綠酸b 組，與先前的研究[17,21]不一致，可能是受到食物基質(zhì)及消化環(huán)境條件等的影響。大部分結(jié)構(gòu)的葉綠素在總體上均呈現(xiàn)b 系列比a 系列更利于膠束化，這與之前的研究結(jié)果[19]相一致，可能原因是b 系列葉綠素具有能增強(qiáng)親水性的甲?；鵞19]。脫植基葉綠素a、b 組和脫鎂葉綠酸a、b 組的膠束化率總體上比葉綠素a、b 組和脫鎂葉綠素a、b 組高，即無植醇鏈葉綠素的膠束化率較含植醇鏈葉綠素的高，這是因?yàn)橹泊嫉拇嬖谀軌蛴绊懩z束化過程，并且極性葉綠素比非極性葉綠素優(yōu)先膠束化和被吸收[17]。另外，葉綠素a、b 組的膠束化率與脫鎂葉綠素a、b 組的差異不大，可能是因?yàn)橹行逆V的存在與否對摻入膠束的影響并不顯著[17]。

圖3 體外消化后葉黃素和葉綠素及其衍生物的膠束化率Fig.3 Micellization rate of lutein,chlorophylls and their derivatives after in vitro digestion

2.1.3 生物可給率分析 生物可給率是對營養(yǎng)物質(zhì)在攝入后能夠被吸收利用程度的綜合評價(jià)，可用來評估消化期間從食物基質(zhì)轉(zhuǎn)移到膠束的攝入化合物的量[23]。圖4（A）為葉黃素的生物可給率，可知葉黃素單獨(dú)消化時(shí)其生物可給率最?。?2.83%），與不同結(jié)構(gòu)葉綠素共消化時(shí)的葉黃素生物可給率均增大，且兩者之間均具有顯著差異（P＜0.05），說明不同結(jié)構(gòu)的葉綠素均能提高葉黃素的生物利用程度。其中脫鎂葉綠素b 與葉黃素共消化時(shí)所對應(yīng)的葉黃素生物可給率最大，為80.44%。結(jié)合葉黃素的回收率（圖2A）和膠束化率（圖3A）可知，在確定葉黃素生物可給率方面的主導(dǎo)因素是回收率，這是因?yàn)橄啾扔谀z束化過程，葉綠素能更多地在消化過程中保護(hù)葉黃素不被破壞。圖4（B）為葉綠素及其衍生物的生物可給率，可知與葉黃素共消化時(shí)葉綠素組的生物可給率均更低，可能原因是葉黃素從食物基質(zhì)中釋放進(jìn)入胃腸環(huán)境后，被油脂包埋其中，必須將表層脂質(zhì)水解才能使葉黃素暴露[10]，而在與葉綠素共消化時(shí)，葉綠素的脂溶性特性能抑制其表層脂質(zhì)水解以減少葉黃素的暴露及消解，同時(shí)葉綠素還具有一定的抗氧化性[30]，在消化過程中可抑制葉黃素被氧化，從而提高葉黃素在體內(nèi)的生物可給率。其中單獨(dú)消化時(shí)脫植基葉綠素b 組的生物可給率最大，為64.40%；與葉黃素共消化時(shí)脫鎂葉綠酸b 組的生物可給率最大，為52.65%。b 系列葉綠素的生物可給率均比a 系列的大，是因?yàn)閎 系列葉綠素在總體上具有更大的膠束化率，而生物可給率會(huì)受到膠束化過程的影響。另外，在總體上呈現(xiàn)出無植醇鏈葉綠素（脫植基葉綠素a 和b 組、脫鎂葉綠酸a 和b 組）的生物可給率較含植醇鏈葉綠素（葉綠素a 和b 組、脫鎂葉綠素a 和b 組）的高，這與葉綠素膠束化率（圖3B）的趨勢一致，可能原因是葉綠素的脫植醇反應(yīng)可顯著提高其膠束化能力，從而進(jìn)一步提高體外消化過程中的生物可給率[18]。

圖4 體外消化后葉黃素和葉綠素及其衍生物的生物可給率Fig.4 Bioaccessibility index of lutein,chlorophylls and their derivatives after in vitro digestion

2.2 葉綠素及其衍生物在體外消化過程中的組成變化

表3 為單獨(dú)消化或與葉黃素共消化前后葉綠素及其衍生物的組成變化。葉黃素在體外消化前后的結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，而葉綠素在食品加工和其他條件下容易發(fā)生氧化，形成各種葉綠素氧化產(chǎn)物，如132-羥基衍生物和151-羥基內(nèi)酯衍生物等[31]，在本研究中這兩類葉綠素氧化產(chǎn)物均能被檢測到，這與體外消化過程中的氧化環(huán)境有關(guān)[23]。胃中的酸性條件會(huì)將葉綠素a 和葉綠素b 分別轉(zhuǎn)化為脫鎂葉綠素a 和脫鎂葉綠素b，而玉米油對此具有一定的保護(hù)作用，會(huì)抑制部分葉綠素發(fā)生轉(zhuǎn)化[23]。同時(shí)與單獨(dú)消化相比，葉黃素共消化時(shí)葉綠素能更多地轉(zhuǎn)化為脫鎂葉綠素，這是因?yàn)樵谙^程中葉黃素較葉綠素更加穩(wěn)定，兩者共存時(shí)葉綠素的結(jié)構(gòu)會(huì)優(yōu)先發(fā)生變化，說明共消化時(shí)葉綠素在一定程度上能為葉黃素提供保護(hù)作用。另外相比于葉綠素b 組，葉綠素a 組在消化過程中能更多地轉(zhuǎn)變?yōu)槊撴V葉綠素，并且先前的研究也表明在相同的消化時(shí)間內(nèi)葉綠素a 轉(zhuǎn)化為脫鎂葉綠素的速度比葉綠素b 快[23]。脫鎂葉綠素a、b 組在消化前后均未轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌Y(jié)構(gòu)的葉綠素，只在自身內(nèi)部發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。先前研究發(fā)現(xiàn)脫鎂葉綠素的植基鏈可以水解形成脫鎂葉綠酸[21,23]，而在本研究中并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，可能原因是食物基質(zhì)玉米油會(huì)對脫鎂葉綠素的水解起到一定的抑制作用。在胃酸的作用下，脫植基葉綠素可以轉(zhuǎn)化為脫鎂葉綠酸[17]，本研究中發(fā)現(xiàn)脫植基葉綠素a、b 組中均有這樣的變化。有研究表明氧化的葉綠素衍生物具有更高的膠束化率，并且羥基的增加有助于提高其在膠束中的溶解度[32]，本研究中脫鎂葉綠素a 和b 組、脫植基葉綠素a 和b 組以及脫鎂葉綠酸b 組中均具有這樣的趨勢，與葉黃素共消化相比，它們單獨(dú)消化后能產(chǎn)生更多的132-羥基衍生物或151-羥基內(nèi)酯衍生物（表3），所對應(yīng)的膠束化率（圖3B）也在單獨(dú)消化時(shí)比與葉黃素共消化時(shí)更高。

表3 消化前后葉綠素及其衍生物的組成含量變化（%）Table 3 Changes in the composition contents of chlorophylls and their derivatives before and after digestion (%)

2.3 消化液和膠束液的體外消化特性

消化液和膠束液中顆粒的平均粒徑、熒光圖像及Zeta 電位見圖5。如圖5（A）所示，消化液中顆粒的平均粒徑為587.17～995.82 nm，膠束液顆粒的平均粒徑為220.17～577.68 nm，可見消化液顆粒的平均粒徑更大，說明消化液經(jīng)過膠束化處理變成膠束液的過程會(huì)使溶液中的顆粒變小，可能是因?yàn)槟z束化過程需經(jīng)過高速離心處理，造成顆粒分散，而顆粒大小是決定微納米顆粒乳液穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素[33]，因此顆粒小的膠束液具有更好的穩(wěn)定性和乳化能力[34]。同時(shí)，如圖5（C）所示，消化液和膠束液的Zeta 電位均為負(fù)值，且膠束液的Zeta 電位絕對值普遍是大于消化液的，而Zeta 電位的絕對值能代表懸浮液的穩(wěn)定性，絕對值越大，穩(wěn)定性就越好[35]，因此說明膠束液的穩(wěn)定性比消化液的更好。此外，圖5（A）中脫鎂葉綠酸a 的平均粒徑比脫鎂葉綠素a 小，這是因?yàn)槊撴V葉綠酸a 缺乏植醇導(dǎo)致分子尺寸減小[17]。對于消化液，共消化后的平均粒徑總體上大于單獨(dú)消化時(shí)的平均粒徑，說明大部分結(jié)構(gòu)的葉綠素在消化過程中能與葉黃素形成復(fù)合物，而部分葉綠素在與葉黃素共消化時(shí)的平均粒徑減小，可能是因?yàn)槭艿绞澄锘|(zhì)或其他消化成分的影響；對于膠束液，總體上呈現(xiàn)葉綠素單獨(dú)消化時(shí)的平均粒徑更大，可能是因?yàn)橄啾扔趩为?dú)消化，葉綠素在與葉黃素共消化時(shí)自身更多地被分解，膠束化過程通過高速離心將兩者分離，從而得到體積更小的色素顆粒。葉綠素具有熒光特性，會(huì)在一定程度上受到同處在一起的高極性葉黃素的調(diào)節(jié)[11]。以脫鎂葉綠酸b 為代表，圖5（B）為其單獨(dú)消化及與葉黃素共消化后在消化液和膠束液中分布的熒光圖像，能直觀反映葉綠素顆粒在消化液及膠束液中的分布和數(shù)量。在熒光模式下，可以看到消化液顆粒（a、b 圖）的形狀和數(shù)量均比膠束液顆粒（c、d 圖）的更大更多，并且葉綠素與葉黃素共消化后的消化液和膠束液顆粒（b、d 圖）均明顯大于葉綠素單獨(dú)消化時(shí)的（a、c 圖），這與A 圖中脫鎂葉綠酸b 平均粒徑的變化相一致。

圖5 消化液和膠束液中顆粒的平均粒徑（A）、熒光圖像（B）及Zeta 電位（C）Fig.5 Average particle size (A),fluorescence images (B) and Zeta potential (C) of the particles in the digestive and micellar solutions

3 結(jié)論

本研究通過制備8 種不同結(jié)構(gòu)的葉綠素，并與葉黃素共同或單獨(dú)進(jìn)行體外消化及膠束化實(shí)驗(yàn)，探究不同結(jié)構(gòu)葉綠素對葉黃素生物可給率的影響規(guī)律。結(jié)果表明，在消化過程中不同結(jié)構(gòu)的葉綠素均會(huì)對葉黃素產(chǎn)生一定程度的保護(hù)作用。通過體外消化過程中葉黃素和葉綠素各項(xiàng)指標(biāo)的變化發(fā)現(xiàn)，相比于葉黃素單獨(dú)消化，在與所有結(jié)構(gòu)葉綠素共消化時(shí)葉黃素的回收率和生物可給率均能顯著升高（P＜0.05），其中脫鎂葉綠素b 在與葉黃素共消化時(shí)所對應(yīng)的葉黃素回收率和生物可給率均為最大（90.48%和80.44%），說明脫鎂葉綠素b 在消化過程中對葉黃素的保護(hù)效果最佳。在本實(shí)驗(yàn)中，未發(fā)現(xiàn)葉黃素結(jié)構(gòu)的變化，而葉綠素結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這與自身分子的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，還會(huì)受到食物基質(zhì)、環(huán)境條件等其他因素的影響。由消化液和膠束液中顆粒的平均粒徑、熒光圖像以及Zeta 電位值可以確定膠束液體系比消化液體系更加穩(wěn)定，同時(shí)葉綠素能通過與葉黃素形成復(fù)合物來提高葉黃素的生物可給率。本研究為葉黃素的生物利用增效提供了一定的參考，同時(shí)不同結(jié)構(gòu)的葉綠素在與葉黃素相互作用的同時(shí)，也會(huì)受到其他因素的影響，如膳食成分、消化條件及其它脂溶性植物化學(xué)物質(zhì)（如固醇）等，這些影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。