新疆伊寧人源植物乳植桿菌的體外益生特性研究

陳麗瀾，王明芳，單宇晴，倪永清

（石河子大學食品學院，新疆石河子 832003）

植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）是革蘭氏陽性細菌，是典型的“游牧”生活物種，被普遍認為是安全的物種[1]，能夠適應廣泛的環境[2]，存在于發酵食品、植物體表、動物胃腸道、土壤等環境中[3]。植物乳植桿菌的基因組較大，這就決定了其有很強的生態適應性和代謝上的靈活性，在某種程度上，植物乳植桿菌在自然界中能夠廣泛分布與它能夠發酵多種糖有關[4]。此外，植物乳植桿菌普遍具有較強的抑菌能力，主要通過產生有機酸或細菌素來實現，其抑菌活性效果受到菌株來源和被抑制微生物類別的影響。在耐酸耐膽鹽上也表現出了較強的耐受性。這些特征使其成為益生菌產品開發的一個重要選擇。

在實際應用中，植物乳植桿菌是一種高度多樣化和多用途的菌種。可用于各種食品和保健品，它們有特定的代謝和工藝特性，在發酵活動中發揮重要作用[5]，在食品工業上既可作為自發發展的發酵微生物群落的一部分，也可作為純發酵劑，用來改善產品風味[6]，還可應用于食品保鮮，延長保質期，減少甚至取代化學添加劑[7]。植物乳植桿菌作為乳酸產率最高的乳酸菌之一，產酸使環境pH 降低，一些導致食物腐敗和食物中毒的微生物在低pH 條件下生長會受到抑制（pH＜4）[8]，因此可作為天然防腐劑添加到許多發酵食品中。此外，其產生的細菌素被認為是一種天然、安全、有效的抗食源性病原體和腐敗細菌的物質[9]。植物乳植桿菌還可通過保護腸道形態和通透性以及緊密連接蛋白的表達來改善腸道屏障的功能，從而預防腹瀉[10]，與其它益生菌聯合使用可顯著減輕腸易激綜合癥癥狀[11]，可以顯著改善急性膀胱炎[12]、預防結腸癌[13]、改善認知障礙[14]、促進皮膚傷口和燒傷感染的愈合[15]。

迄今為止，植物乳植桿菌作為人類胃腸道中潛在的促進健康微生物，是應用最多的菌種之一[16]，從理論上講，在適應人類宿主的腸道方面，從人類消化道分離出來的原生菌株比其它來源的菌株具有先天優勢。此外，根據WHO 的規定，只有從人類消化道中分離出來的微生物才被推薦作為益生菌使用。現在用于開發的植物乳植桿菌大多是從發酵食品或植物基材料中分離出來的。鑒于植物乳植桿菌在食品領域和作為生物治療制劑的醫藥領域擁有巨大應用潛力，開發新的有潛力、適合于區域性人群的益生菌很有必要。因此，本研究收集了我國新疆伊寧維吾爾族和哈薩克族兒童的糞便樣品，從中分離出了植物乳植桿菌，分析了菌株的遺傳多樣性與體外益生特性。為進一步研究植物乳植桿菌菌株與區域宿主人群的健康關系、開發本土化的益生菌奠定了前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

18 份維吾爾族和哈薩克族健康兒童糞便樣品采集自新疆維吾爾自治區伊寧縣，提前聯系志愿者，簽訂知情同意書。糞便采集前三個月內，兒童均未使用過抗生素，無益生菌攝入，無胃腸道疾病。采樣時，取樣人員配戴無菌手套，用取樣勺采集糞便約5～10 g，糞便采集后立即放入已滅菌的取樣管，貼標簽后置于車載冰箱-10 ℃冷藏，快速運回實驗室進行菌種分離；致病菌分別為Escherichia coliEPCC O127:K3 CICC（10411）、Escherichia coliEHEC O157:H7 CICC（21530）、Escherichia coliETEC O8:K0 CICC（10421）、Salmonella entericasubsp.enterica serovar TyphimwiumCICC（10420）中國工業微生物菌種保藏管理中心；Listeria monocytogenesCGMCC 1.9136、Salmonella entericasubsp.entericaCGMCC 1.10754 中國普通微生物菌種保藏管理中心；改良MRS（de Man，Rogosa，Sharpe）培養基、營養肉汁培養基、蛋白胨酵母浸膏葡萄糖（Peptone yeast extract glucose，PYG）培養基、胰胨大豆瓊脂（Trypcasein soy agar，TSA）培養基、蘋果果膠（Pectin，70%）北京博奧拓達科技有限公司；碳源：水蘇糖（Stachyose tetrahydrate，85%）、低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS，95%）、低聚半乳糖（GOS）、低聚異麥芽糖（IMO，90%）、大豆低聚糖（Soybean oligosaccharide）、D-棉子糖五水物（Raffinose）、麥芽糊精（Maltodextrin）、D-海藻糖無水（D-（+）-Trehalose dihydrate）、抗性淀粉（Resistant starch，70%）

上海源葉生物科技有限公司；菊粉（Inulin，70%）上海易恩化學技術有限公司。

DG520 厭氧培養箱 英國DS 公司；TC-512 PCR儀 英國Techne 公司；PoerPac Universal 水平電泳儀、Gel DOC XR 凝膠成像系統 美國Bio-Rad 公司；GR60DA 高壓蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；5810R 高速冷凍離心機 德國Eppendorf 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳植桿菌的分離鑒定 將l g 新鮮糞便用9 mL 無菌生理鹽水梯度稀釋，選擇合適梯度涂布于改良MRS 固體培養基，37 ℃厭氧培養24 h，每個樣品選取30 個菌落，連續劃線純化直至鏡檢結果為純桿。菌株DNA 的提取依據苯酚-氯仿-玻璃珠擊打的方法進行[17]。

提取好的DNA 進行groEL基因擴增[18]：gro-EL-F 5’-GCYGGTGCWAACCCNGTTGG-3’；groEL5’-RAANGTNCCVCGVATCTTGTT-3’，擴增體系：Premix Taq：12.5 μL，DNA 模板：3 μL，引物（20 μmol/L）：各0.5 μL，ddH2O：8.5 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 30 s，退火52 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 40 s，終延伸72 ℃ 5 min，30 個循環。經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后得到大約500 bp 左右的清晰單一條帶。擴增產物送至江蘇金唯智生物有限公司進行測序，測序結果提交至GenBank 數據庫中進行序列同源性比對（BLAST），比對相似值大于99%初步確定菌種種屬。

采用通用引物Eric：Eric1 5’-GGGGTACCTTG CGACTAACAAATATGCT-3’；Eric2 5’-TGCTCTAG ACTTATTCCCTACCATCATG-3’對植物乳植桿菌DNA 進行rep-PCR 擴增分析，擴增體系：Premix Taq（2x）：12.5 μL，DNA 模板：3 μL，引物（20 μmol/L）：各0.5 μL，ddH2O：8.5 μL。反應條件：預變性95 ℃5 min，變性95 ℃ 20 s，退火51.2 ℃ 30s，延伸72 ℃5 min 30 s，終延伸72 ℃ 10 min，35 個循環。PCR產物進行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照并記錄結果。根據指紋圖譜結果，去除重復條帶，挑選出代表菌株進行后續實驗。

1.2.2 體外益生特性實驗

1.2.2.1 耐酸能力測定 用鹽酸將改良MRS 培養基pH 調至2.5[19]，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用。活化后的菌液按2%接種，37 ℃厭氧培養，分別于0、2、4 h 取樣，用無菌生理鹽水稀釋至合適梯度，涂布于固體改良MRS 培養基，37 ℃厭氧培養24 h 后計數。

式中：At為2、4 h 測得的活菌數；A0為0 h 測得的活菌數。

1.2.2.2 耐膽鹽能力測定 在MRS 培養基中加入牛膽鹽，配制膽鹽濃度3 g/L 的MRS 培養基[20]。將活化后的菌株按2%的接種量接種，37 ℃厭氧培養，于0、2、4 h 取樣，用滅菌的生理鹽水稀釋至合適梯度，涂布于固體MRS 培養基，37 ℃厭氧培養24 h后計數。

式中：At為2、4 h 測得的活菌數；A0為 0 h 測得的活菌數。

1.2.2.3 自聚集能力測定 活化后的菌株培養液8000 r/min，4 ℃離心10 min，用pH7.2 的磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，重新懸浮于PBS 中，調整菌懸液OD600為0.5，記為A0，取2 mL 菌懸液渦旋振蕩20 s，室溫下靜置2 h 后在600 nm 處測定吸光度值（取200 μL 上清液測定），記為At[21]。重復進行3 次獨立實驗，取平均值。

1.2.2.4 表面疏水性測定 活化后的菌株培養液8000 r/min，4 ℃離心10 min，用pH7.2 的PBS 緩沖液清洗2 次，重新懸浮于PBS 中，調整菌懸液OD600為0.5，記為A0，取2 mL 菌懸液加入2 mL 二甲苯，渦旋振蕩2 min，室溫靜置1 h。在600 nm 處測定水相吸光度值（取200 μL 測定），記為At[21]。重復進行3 次獨立實驗，取平均值。

1.2.2.5 抑菌能力測定 實驗采用牛津杯法[22]，以6 種致病菌為指示菌，測定植物乳植桿菌代謝產物的抑菌性。活化后的菌株培養液8000 r/min 離心10 min，收集上清液，用0.22 μm 濾膜過濾除菌，制備無細胞上清液。將指示菌按照106CFU/mL 濃度涂布于相應的固體培養基，制備指示菌平板。用鑷子將無菌牛津杯豎于涂布有致病菌液的平皿中，牛津杯中加入200 μL 無細胞上清液，設置三個平行。將平皿置于4 ℃擴散4 h 后，置于37 ℃培養箱中培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。對應培養基：營養肉汁（菌株10420、10421、21530、10411）；PYG 培養基（菌株1.9136）；TSA 培養基（菌株1.10754）。

1.2.2.6 抗生素耐藥實驗 采用紙片擴散法（K-B法）[23]，藥敏片信息見表1，將活化后的菌液經合適梯度稀釋后（菌液濃度約為107CFU/mL），均勻地涂布于改良MRS 平板上，用無菌鑷子將藥敏紙片放置其上，37 ℃培養24 h 后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。重復進行3 次獨立實驗，取平均值。按表2 標準劃分菌株對藥物的敏感性。

表1 藥敏片信息Table 1 Information of drugs sensitive tablets

表2 菌株對抗生素敏感性標準Table 2 Standard of antibiotic sensitivity of strains

1.2.2.7 碳源利用能力測定 配制不含葡萄糖的改良MRS 基礎培養基（mMRS），以20 g/L 的不同碳源替換葡萄糖。將活化后的菌株8000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液，用無菌生理鹽水將菌體洗滌2 次后，重懸于1 mL 生理鹽水中。以1%的接種量將菌懸液接種到含有不同碳源的改良MRS 液體培養基中，以葡萄糖為陽性對照，不添加碳源為陰性對照，測定0 h 的OD600吸光度值為OD1，37 ℃厭氧培養24 h，測定OD600吸光度值為OD2，最終OD600=OD1-OD2。實驗重復三次取平均值。

1.3 數據處理

菌株指紋圖譜使用GelCompar II v6.0 軟件進行聚類分析；采用MEGA v7.0 軟件基于groEL基因測序序列對菌株進行系統發育樹的構建；耐酸、耐膽鹽、自聚集、疏水性結果取平均值后用Origin 2023作條形圖；碳源利用能力實驗結果取平均值后用TBtools 作熱圖。

2 結果與分析

2.1 植物乳植桿菌的遺傳差異分析

經groEL基因測序鑒定為植物乳植桿菌的菌株，經rep-PCR 去重后得到20 株代表菌株，代表菌株信息見表3。圖1 指紋圖譜聚類結果顯示將20 株植物乳植桿菌劃分為3 個大類，A 中分離自哈薩克族學齡兒童的菌株全部聚集在一起，分離自維吾爾族的菌株聚集在另一分支，B 中全是分離自維吾爾族學齡兒童的菌株，C 中則混雜著不同來源的菌株，但是同一個小的分支上都是來源相同的菌株。系統發育樹如圖2 可看出，YLW2L-89-22、YLW2L-66-30、YLW2L-57-4、YLW2L-61-7 和YLW2L-26-10 聚集在同一進化分支，這一分支的菌株全都來自維吾爾族學齡兒童；YLW2L-108-29、YLW1L-49-6、YLW1L-49-3 和標準菌株L.plantarumATCC 14917 聚集在同一進化分支上，這3 株菌株都來自維吾爾族。剩下的8 株來自哈薩克族和4 株維吾爾族的菌株聚集在同一進化分支上。與植物乳植桿菌親緣關系較近的Lactiplantibacillus pentosus和Lactiplantibacillus paraplantarum的模式菌株單獨在另一分支。在同一分支上的菌株親緣關系更近，從發育樹上可看出相同民族來源的菌株更傾向于聚集在一起。

圖1 指紋圖譜聚類分析Fig.1 Fingerprint map clustering analysis

圖2 系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree

表3 實驗菌株信息Table 3 Information of experimental strains

2.2 耐酸耐膽鹽分析

圖3 中菌株在pH2.5 的改良MRS 培養基中培養2 h 后，存活率在4.42%～212.33%，4 h 后存活率在4.85%～181.69%，說明某些菌株在pH2.5 時仍可繼續生長。YLW2L-96-6、YLW2L-108-29、YLW2L-61-7、YLW1L-44-7 這4 株菌株2 h 后的存活率超過100%，4 h 后YLW2L-108-29、YLW2L-61-7、YLW1L-44-7 這3 株菌株存活率超過100%。圖4菌株在含有0.3%膽鹽的改良MRS 培養基中培養2 h 后，存活率在0.10%～19.81%，4 h 后存活率在0.05%～19.52%，存活率較低，平板計數結果顯示菌落數在104～105CFU/mL。2 和4 h 時存活率最高的菌株都是YLW1L-49-3，分別為19.81%、19.52%。

圖3 20 株植物乳植桿菌在pH2.5 的MRS 培養基中培養2 和4 h 時的存活率Fig.3 Survival rate of 20 L.plantarum strains cultured in MRS medium with pH2.5 for 2 and 4 h

圖4 20 株植物乳植桿菌在含有0.3%膽鹽濃度的MRS 培養基中培養2 和4 h 時的存活率Fig.4 Survival rate of 20 L.plantarum strains cultured in MRS medium containing 0.3% bile salt concentration for 2 and 4 h

2.3 自聚集能力和疏水性分析

通過測定細菌自聚集和表面疏水性來間接反映其黏附能力，細菌表面疏水性越大，則黏附能力越強[24]，但是黏附能力與自聚集能力的關系在菌株間存在差異性[25-26]。高黏附性有助于菌株定殖腸道，可以通過自聚集能力和表面疏水性作為高黏附能力植物乳植桿菌的參考指標。圖5 中植物乳植桿菌的疏水性在10.21%～86.01%，較高的是YLW2L-61-7、YLW2L-57-4、YLW2L-66-30 這3 株菌，疏水性都超過了80%。自聚集能力在5.61%～28.16%，最高的是YLW2L-57-4。

圖5 20 株植物乳植桿菌的疏水性和自聚集能力Fig.5 Hydrophobicity and self-aggregation of 20 strains of L.plantarum

2.4 抑菌能力分析

15 株菌株對6 種致病菌都有抑菌效果，表4 中所有菌株對Listeria monocytogenesCGMCC 1.9136都有抑菌效果，但是抑菌圈直徑總體較小；總體來看，對Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhimwium、Listeria monocytogenes和Escherichia coliEPCC O127:K63 的抑菌效果較差，對Escherichia coliEHEC O157:H7 和Escherichia coliETEC O78:K80的抑菌效果較好。除了YLW2L-108-29、YLW2L-26-10、YLW1L-49-3、YLW1L-44-7、YLH2L-93-17這5 株菌株，其余植物乳植桿菌對6 種致病菌都有抑菌圈。

表4 20 株植物乳植桿菌對6 種致病菌的抑菌圈效果Table 4 Inhibition zone effect of 20 strains of L.plantarum on 6 pathogenic bacteria

2.5 抗生素耐藥分析

表5 中20 株植物乳植桿菌對慶大霉素耐藥，對米洛環素、氯霉素和氨芐西林敏感，YLW2L-96-6、YLH2L-92-30、YLH1L-8-18 這3 株菌對3 種抗生素耐藥，YLW2L-26-10、YLW2L-66-30、YLW2L-57-4、YLW1L-49-6 這4 株菌株對5 種抗生素耐藥，除上述7 株菌外，其余菌株對4 種抗生素耐藥。

表5 20 株植物乳植桿菌對12 種抗生素的敏感性Table 5 Sensitivity of 20 strains of L.plantarum to 12 kinds of antibiotics

2.6 碳源利用能力分析

根據圖6 結果可知，植物乳植桿菌YLW1L-44-7、YLW2L-26-10、YLH1L-10-30、YLH1L-8-18、YLH1L-1-4、YLW2L-61-7、YLH1L-10-28 這7 株菌株在低聚木糖中生長24 h 后的OD600高于0.100，其余菌株OD600在0.100 以下；在抗性淀粉中生長較差，菌株YLW1L-44-7 的OD600最高，為0.570；在菊糖中培養24 h 后的OD600值在0.369～1.474，菌株YLW2L-106-12 和YLH2L-94-27（OD600分別為1.474和1.245）生長最好，其余菌株OD600低于0.610；在水蘇糖中培養24 h 后的OD600值在0.559～1.199，YLH1L-10-30 和YLH1L-10-28 生長得最好，OD600值分別為1.025 和1.199；在低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、麥芽糊精、棉子糖、D-海藻糖、果膠和大豆低聚糖中生長良好，其中在果膠中OD600值在0.900 以上，其余碳源中OD600值均在1.000 以上。

圖6 20 株植物乳植桿菌在不同碳源中的生長情況熱圖Fig.6 Heat map of the growth of 20 L.plantarum strains in different carbon sources

3 討論與結論

對于人類來說，益生菌已與人體健康緊密相連，許多商業食品都聲稱添加了對人體健康有益的益生菌，并且以此作為宣傳賣點。益生菌（Probiotics）、益生元（Prebiotics）、合生元（Synbiotics）[27]和后生元（Postbioticis）[28]的概念已被廣泛定義，為益生功能食品的開發帶來標準。現在植物乳植桿菌與其它益生菌一起廣泛用于工業發酵食品生產。

本文中相同民族來源的植物乳植桿菌在系統發育樹上更傾向于聚集在同一分支，電泳圖聚類結果中同一小分支上是相同來源的菌株，這說明同一生境中的植物乳植桿菌其遺傳特征更為相似。即使是同種細菌，它們的表型特征也存在很大差異，研究不同來源的同種細菌有利于篩選出擁有符合不同條件的菌株，在開發益生菌產品上有更多的選擇。

pH 和高濃度膽鹽是影響菌株生長的重要因素。因此，菌株必須有較強的耐酸耐膽鹽能力才能在腸道中發揮其益生功能。本文中菌株的耐酸能力較強，耐膽鹽能力則較差，菌株在4 h 時存活率基本在10%以下，但在2 和4 h 時存活率相差不大，推測菌株可能會在該膽鹽濃度下維持現有的存活率較長一段時間，后續實驗可做進一步驗證。Arena 等[7]的研究中植物乳植桿菌對Listeria monocytogenes和Escherichia coliO157:H7 表現出抑制作用，抑菌作用主要是產生的有機酸類物質造成；植物乳植桿菌YM-5-2 產生的有機酸類物質對食源性致病菌埃希氏菌，腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型、單核增生李斯特菌有抑制作用[29]，與本文研究結果相似。植物乳植桿菌對氨基糖苷類、糖肽類和氟喹諾酮類抗生素耐藥，對四環素類、利福霉類抗生素敏感[30]，與本文結果相似。此外，植物乳植桿菌對絕大多數β-內酰胺類抗生素敏感[31]，在本研究中對氨芐西林敏感，對苯唑西林則表現為耐藥和中度敏感。乳桿菌對大多數核酸抑制劑，左氧氟沙星，氨基糖苷類抗生素，鏈霉素[32]、卡那霉素、慶大霉素等具有耐藥性[33]。不同的是本文中植物乳植桿菌對鏈霉素表現出了不同程度的敏感性。這可能與地區，微生物所處環境有關。本文中的植物乳植桿菌對大多數碳源利用能力較強，在低聚糖上生長良好，也能在多糖菊粉和抗性淀粉上生長，但是幾乎不能利用低聚木糖，有研究認為編碼能降解低聚木糖的基因僅存在于乳酸菌特定的成員中[34]，并不包括植物乳植桿菌。

綜上，本研究是從新疆伊寧18 份兒童糞便樣品中分離出的分離株中，挑選出經groEL基因擴增測序鑒定為植物乳植桿菌的菌株，采用rep-PCR 指紋圖譜擴增選出代表菌株進行體外益生特性實驗，通過對比耐酸、耐膽鹽、自聚集、疏水性、抑菌、抗生素敏感性以及碳源利用的性能，菌株YLW2L-61-7 可作為潛在益生菌菌株開展下一步的體內益生特性研究，為開發適合當地人群的益生菌產品奠定基礎。在后續實驗中，耐膽鹽實驗可將菌株培養時間延長，檢測其是否能在0.3%膽鹽濃度的MRS 中維持現有存活率，本文中的自聚集與疏水性的測定是為了篩選出具有良好黏附能力的菌株，該方法簡單快速，可用于初篩符合要求的菌株，同時也存在缺陷，后續黏附實驗可做細胞黏附，還可增加抑菌物質的確定實驗。