微波輔助深共熔溶劑提取紫斑牡丹籽總黃酮的工藝優化及其抗氧化活性

陳思羽，饒桂維 ，王露樺，盛穎霏

（1.浙江樹人學院樹蘭國際醫學院，浙江杭州 310015；2.浙江樹人學院交叉科學研究院，浙江杭州 310015；3.浙江樹人學院生物與環境工程學院，浙江杭州 310015）

紫斑牡丹（Paeonia rockii）是我國獨有的名貴觀賞木本植物，香味獨特，花色多種多樣，主要分布在我國西北地區[1]。紫斑牡丹種油可供食用[2]，籽出油率高，油中富含不飽和脂肪酸[3]。有學者還從紫斑牡丹中分離到10 種有抗氧化、消炎作用的芪類物質[4]。有報道紫斑牡丹籽還具有一定的藥理功效，如消除炎癥，鎮痛、止痛，抗氧化等作用[5]。

黃酮類化合物作為植物中最豐富的次級代謝產物，廣泛存在于植物各部位中，并已被研究證實具有多種生理活性作用[6-7]。植物總黃酮常用傳統有機溶劑作為提取劑，但傳統有機溶劑存在易揮發、安全性差、對人體有一定毒性等問題。深共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）是近年來開發的一種綠色高效的提取溶劑，DES 通過氫鍵受體（如季銨鹽）和氫鍵供體（如酰胺、羧酸、醇等）以一定摩爾比組合，通過分子間氫鍵作用，熔融成低溫共熔混合物，其凝固點低于任一組分純物質的熔點[8]，因具有無毒、儲存方便、不易揮發[9-10]、良好的可設計性和可調控性[11]等優點受到人們的廣泛關注，并且其合成成本低，易于處理且不需要純化，可大規模生產作為黃酮的提取劑，也被普遍用來提取植物中的黃酮[12-15]。

目前對紫斑牡丹籽的研究多以籽產量及籽油品質[16]和酚類中白藜蘆醇[17]的研究為主，對紫斑牡丹籽中總黃酮的提取研究未見文獻報道。本研究采用深共熔溶劑微波輔助法提取紫斑牡丹籽中的總黃酮，同時通過體外抗氧化試驗，以VC作為對照，測定紫斑牡丹籽總黃酮對DPPH·和·OH 的清除率。通過本文的創新提取模式，解決紫斑牡丹籽產量大卻利用率低，作為農田廢棄物的既存問題，同時通過實驗為后期開發一系列具有藥用價值和護理價值的高附加值產品提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫斑牡丹籽 山東菏澤志恒牡丹芍藥；無水乙醇 天津市永大化學試劑有限公司；蘆丁對照品上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉 杭州蕭山化學試劑廠；氯化膽堿 上海阿拉丁試劑有限公司；DPPH 試劑 上海麥克林生化科技有限公司；水楊酸 上海化學試劑采購供應五聯化工廠；硫酸亞鐵衢州巨化試劑有限公司；抗壞血酸 上海易恩化學技術有限公司；乳酸、蔗糖、過氧化氫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、葡萄糖、脲 國藥集團化學試劑有限公司；所有試劑均為分析純；水 超純水。

FW80 高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；SW-80A 渦旋混合器 寧波新芝生物科技股份有限公司；L6S 紫外可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；EXCEL 微波化學反應系統 上海屹堯儀器科技發展有限公司；GL-20G-Ⅱ臺式高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；ME204E 電子分析天平 梅特勒托利多儀器有限公司；Milli-Q 純水系統 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 紫斑牡丹籽洗凈后置于烘箱中40 ℃干燥至恒重，冷卻至室溫后放入高速粉碎機中，粉碎過200 目篩。放入廣口棕色玻璃瓶置于干燥器中存儲。

1.2.2 深共熔溶劑的制備 以氯化膽堿為氫鍵受體，分別加入脲、蔗糖、乙二醇、檸檬酸為氫鍵供體并按照一定的摩爾比進行混合[18-21]，加入體系體積分數50%的水，在水浴鍋中進行加熱至70 ℃攪拌直至混合均勻形成透明的無色液體。同理以乳酸為氫健供體，葡萄糖為氫鍵供體，制取乳酸-葡萄糖體系深共熔溶劑，具體見表1。

表1 深共熔溶劑的組成Table 1 Composition of the DES

1.2.3 紫斑牡丹籽總黃酮的提取 稱取一定量粉碎后混合均勻的紫斑牡丹籽粉末，將其與深共熔溶劑混合均勻，利用微波輔助提取，再放入離心機中，以7000 r/min 進行離心10 min，再用0.22 μm 孔徑的濾膜過濾提取上清液，得到紫斑牡丹籽黃酮提取液[21]。

1.2.4 蘆丁標準曲線的繪制及總黃酮得率的測定稱取10 mg 的蘆丁標準品，用50%乙醇水溶液定容至50 mL，搖勻，得到濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標準貯備液。參考文獻[13,22]方法進行線性范圍、回歸方程和相關系數的考察，具體過程如下：采用硝酸鋁顯色法，以蘆丁為對照品，在510 nm 波長下測定各濃度吸光度A，以蘆丁的濃度C 為橫坐標，吸光度A 為縱坐標繪制標準曲線，得到線性方程為：y=0.014c+0.029（R2=0.9987），線性范圍0～100 μg/mL。

將“1.2.3”提取得到的總黃酮提取液，采用硝酸鋁顯色法[21-22]進行測定，過程如下：量取紫斑牡丹提取液適量，于10.00 mL 比色管中，先用50%乙醇水溶液稀釋至5.00 mL，分別加入5% NaNO2試液0.50 mL，搖勻，靜置6 min。加5% Al（NO）3試液0.50 mL，搖勻，靜置6 min。再加4% NaOH 試液4.00 mL，最后用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置12 min。于510 nm 處測其吸光度。用蘆丁測定的標準曲線計算總黃酮得率[13]。計算公式為：

式中，C：樣品溶液對應標線上的濃度，mg/mL；V0：樣品溶液顯色并定容后的總體積，mL；V1：配制溶液的樣品液的體積，mL；V2：定容后待測樣品溶液體積，mL；m：紫斑牡丹籽質量，g；W：總黃酮得率，mg/g。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 不同種類的氫鍵供體對紫斑牡丹籽總黃酮得率的影響 氯化膽堿作為基礎的氫鍵受體，分別將蔗糖、檸檬酸、脲、乙二醇為氫鍵供體配制深共熔溶劑，額外配制乳酸-葡萄糖體系的深共熔溶劑，各深共熔溶劑摩爾比見表1。體系含水量為50%，紫斑牡丹粉末與深共熔溶劑的料液比1:20 g/mL，在功率為100 W 的條件下微波輔助提取3 min，并計算紫斑牡丹籽總黃酮的得率。

1.2.5.2 不同摩爾比對紫斑牡丹籽總黃酮得率的影響 將氯化膽堿和脲分別按摩爾比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 配制深共熔溶劑，體系含水量為50%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶劑的料液比為1:20 g/mL，在功率為100 W 的條件下微波輔助提取3 min，計算紫斑牡丹籽黃酮的得率。

1.2.5.3 深共熔溶劑體系的含水量對紫斑牡丹籽總黃酮得率的影響 將氯化膽堿和脲按摩爾比1:3 配制深共熔溶劑，設置體系含水量分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，在紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶劑的料液比為1:20 g/mL，微波功率為100 W 的條件下微波提取3 min，計算紫斑牡丹籽黃酮的得率。

1.2.5.4 料液比對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 將氯化膽堿和脲按摩爾比1:3 配制深共熔溶劑，體系含水量為40%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶劑的料液比分別為1:5、1:10、1:20、1:30、1:40 g/mL，在微波功率為100 W 的條件下微波提取3 min，計算紫斑牡丹籽總黃酮的得率。

1.2.5.5 微波功率對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響將氯化膽堿和脲按摩爾比1:3 配制深共熔溶劑，體系含水量為40%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶劑的料液比為1:20 g/mL，將微波功率分別設為25、50、100、150、200 W，提取3 min，計算紫斑牡丹籽黃酮的得率。

1.2.5.6 微波時間對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響在氯化膽堿和脲按摩爾比1:3 配制深共熔溶劑，體系含水量為40%，紫斑牡丹籽粉末和深共熔溶劑的料液比為1:20 g/mL 的條件下，微波功率為100 W的情況下，分別設定提取時間為1、2、3、5、7 min，計算紫斑牡丹籽黃酮的得率。

1.2.6 響應面試驗優化試驗設計 由單因素實驗所得的結果，選取四個因素：含水量、料液比、微波功率和微波時間設計Box-Behnken 響應面試驗[23]，并利用軟件Design-Expert 11 來設計4 因素3 水平的優化試驗，見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計因素及水平Table 2 Design factors and level of Box-Behnken test

采用4 因素3 水平的Box-Behnken 結合響應面對單因素實驗參數進行優化，考察含水量（%）、料液比（g/mL）、微波功率（W）和微波時間（min）4 個因素在不同水平組合下對紫斑牡丹籽總黃酮得率的影響。

1.2.7 紫斑牡丹黃酮抗氧化性研究

1.2.7.1 DPPH·清除率測定 將紫斑牡丹籽總黃酮提取液配制不同濃度溶液（10、20、30、40、60 和80 μg/mL）1.00 mL 和2.00 mL 的0.10 mmol/L 的DPPH[17]工作液，均勻混合在避光處反應30 min，隨后在波長517 nm 檢測樣品吸光度，平行測定三組并取平均值，以等濃度的抗壞血酸（VC）作為陽性對照組。DPPH·清除率[24]計算公式如下：

式中：A1為加入提取物的吸光值；A2為本底吸收的吸光值；A3為空白溶液的吸光值。

1.2.7.2 羥基自由基清除率測定 為探究·OH 的清除率[25]，首先分別將紫斑牡丹籽總黃酮提取液配制等濃度梯度的樣品溶液（10、20、30、40、60、80 μg/mL），再向試管中依次加入1 mL 5.0 mmol/L 的FeSO4溶液和1 mL 5.0 mmol/L 的H2O2溶液，混合均勻后靜置10 min，再加入1 mL 2.5 mmol/L 的水楊酸醇溶液，將其放置于37 ℃水浴鍋中進行避光反應30 min。以蒸餾水代替樣品溶液配制空白溶液在510 nm 處測定吸光度，同濃度樣品平行測定三次。以同濃度的VC溶液作陽性對照。·OH 清除率計算公式如下：

式中：A1為加入提取物的吸光值；A2為本底吸收的吸光值；A3為空白溶液的吸光值。

1.3 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6 軟件作圖，對結果進行相應的響應面分析，并用Origin 2019b 進行數據處理和分析，所得的所有實驗都重復三次并取平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同種類的氫鍵供體對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 由圖1 可得，以氯化膽堿作為氫鍵受體，脲作為氫鍵供體時，黃酮得率最高。氯化膽堿-乙二醇、乳酸-葡萄糖、氯化膽堿-檸檬酸三者的黃酮提取效果接近且次之。深共熔溶劑制備時氯化膽堿和脲中的乙酰胺之間形成氫鍵，溶質分子和深共熔溶劑之間的靜電鍵和氫鍵的相互作用被pH 影響，從而對黃酮的提取起到重要作用[19]。而黃酮類化合物多含酚羥基呈酸性，酸堿的中和，所以總黃酮得率最高的氫鍵供體是酰胺類。綜上所述，應選擇氯化膽堿和脲來制備深共熔溶劑。

圖1 不同種類的氫鍵供體對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響Fig.1 Effects of different hydrogen bond donors on the yield of flavonoids in Paeonia rockii seeds

2.1.2 深共熔溶劑體系的摩爾比對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 在同一體系的深共熔溶劑條件下，實驗中隨著氫供體的增加（1:1～1:3）得率逐漸升高，且在1:3 達到最高，隨著氫供體繼續增加，摩爾比達到1:4～1:5 后得率下降（圖2）。主要是氫供體過多導致深共熔溶劑與總黃酮的結合力下降所致。當脲作為氫鍵供體，氯化膽堿作為氫鍵受體時，以摩爾比1:3 構建的深共熔溶劑體系中紫斑牡丹籽黃酮得率最高。

圖2 不同摩爾比對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響Fig.2 Effects of different molar ratio on yield of flavonoids in Paeonia rockii

2.1.3 深共熔溶劑體系的含水量對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 由圖3 可知，隨著含水量增加，紫斑牡丹籽黃酮類化合物得率呈現出先上升后下降的趨勢。當深共熔溶劑體系的含水量達到40%時，紫斑牡丹籽的黃酮得率達到最大。這是因為適當的加入水能降低提取劑的粘度[20]，調節了提取劑的極性，增大了接觸面積，從而使氯化膽堿-脲的深共熔溶劑體系與樣品充分混合，提高提取效率；當深共熔溶劑的含水量過多，則會在結合集團飽和之后導致深共熔溶劑濃度下降，過量的水降低了溶劑和黃酮類化合物之間的相互作用力，使得黃酮得率降低。故選定深共熔溶劑體系的含水率為40%。

圖3 深共熔溶劑體系的含水量對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響Fig.3 Effects of water content in deep eutectic solvent system on yield of flavonoid of Paeonia rockii seeds

2.1.4 料液比對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 料液比在1:20 g/mL 之前，隨著料液比增加，紫斑牡丹籽的黃酮得率增大，并在料液比1:20 g/mL 時達到最大，之后黃酮得率隨著料液比的增加而降低且趨勢逐漸趨于平緩，見圖4。可能是因為前期由于提取溶劑適量的增加從而增大了紫斑牡丹籽粉末和溶劑的接觸面積，故黃酮得率呈現上升趨勢，而料液比1:20 g/mL 之后，料液比的增加也使得提取時的含水量增加，體系發生稀釋，所以降低了得率。因此，選擇料液比為1:20 進行后續實驗。

圖4 料液比對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響Fig.4 Effects of the ratio of material to liquid on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds

2.1.5 微波功率對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 由圖5 可以看出，紫斑牡丹籽的黃酮得率隨著微波功率上升到50 W 時有著明顯的升高，再平緩的上升至100 W 時達到最大，后黃酮得率逐漸降低。這可能是因為微波功率增大后，溫度升高，深共熔溶劑的粘度降低，使得其和紫斑牡丹種子粉末混合的更加均勻充分，提高了黃酮的提取率，之后隨著微波功率的增大，其他雜質析出，從而降低了黃酮得率。綜合考慮，選取微波功率為100 W 進行后續實驗。

圖5 微波功率對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響Fig.5 Effects of microwave power on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds

2.1.6 微波時間對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響 微波時間對紫斑牡丹籽總黃酮的提取影響見圖6，隨著微波提取時間的增長，紫斑牡丹籽粉末的黃酮得率逐漸增加。當微波時間到達3 min 時，此時黃酮提取率達到最大。隨著時間的延長又逐漸降低。其原因可能是前期因為提取時間不夠故黃酮類化合物析出不充分，提取不徹底，后因時間過長[26]導致除黃酮類化合物外還有其他雜質析出。對比各微波時間下的黃酮得率，故選取了微波時間在3 min 時，進行實驗操作。

圖6 微波時間對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響Fig.6 Effects of microwave time on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds

2.2 響應面試驗結果

在上述單因素實驗中，本文進行了摩爾比、含水量、料液比、微波功率和微波時間對紫斑牡丹籽總黃酮得率的影響摸索，黃酮得率變化范圍大小的排序是微波功率＞含水量＞料液比=摩爾比＞微波時間。考慮到合成出來的氯化膽堿-脲體系深共熔溶劑在摩爾比（1:3～1:4）的黏度都比較大，實驗過程中過0.22 μm濾膜較難，故不將摩爾比納入接下來的響應面試驗參數中。

2.2.1 響應面試驗設計方案及結果分析 利用Box-Behnken 實驗設計得到的結果見表3。采用Design-Expert 8.0.6 軟件對其中的各項條件進行響應面分析，通過數據分析，進行多元回歸擬合的方程模型為：R=1.73+0.050A-0.027B+0.018C-0.0014D-0.0053AB+0.0048AC+0.013AD-0.057BC-0.0045BD+0.002CD-0.14A2-0.24B2-0.062C2-0.11D2。

表3 響應面試驗結果Table 3 Results of response surface experiment

由表4 可得，模型的F值19.62，顯示模型的建立是有效的；同時模型的P＜0.0001，說明本實驗中該模型極顯著；一次項A 影響極顯著（P＜0.01）；交互項BC 顯著（P＜0.05），AB、AC、AD、BD、CD 影響均不顯著（P＞0.05）；A2、B2、C2、D2影響極顯著（P＜0.01）。決定系數R2=0.9515，由此可得該模型擬合的情況良好，能較好地反映含水量、料液比、微波功率、微波時間之間的關系，可以用來預測紫斑牡丹籽黃酮的提取率，且根據F值可判斷各響變量對紫斑牡丹籽黃酮得率的影響大小為：含水量＞料液比＞微波功率＞微波時間。

表4 響應面二次模型方差法Table 4 Response surface quadratic model variance method

2.2.2 各個因素相互作用的響應曲面圖 圖7 為含水量、料液比、微波功率和微波時間4 個因素的交互作用對紫斑牡丹籽黃酮得率影響的響應曲面圖和等高線圖[27]。響應面的曲面越陡，表示兩因素的交互作用越顯著。趨向于橢圓的等高線可以表示兩因素交互作用顯著性越強，趨向圓形的等高線相反。由圖可得含水量（A）、料液比（B）、微波功率（C）和微波時間（D）與總黃酮得率具有拋物線關系。BC 等高線圖趨于橢圓形，且趨勢線連接的較為緊密，因此BC 交互作用顯著；而AB、CD 則呈圓形趨勢，且趨勢線連接的并不緊密，無明顯交互作用。

圖7 各因素交互作用對牡丹籽黃酮得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots of the effcets of interaction among factors on yield of flavonoids of Paeonia rockii seeds

2.2.3 驗證實驗 根據Box-Behnken 試驗得到的結果和回歸方程，預測試驗范圍內紫斑牡丹籽總黃酮的提取最佳工藝條件為：含水量41.83%，料液比1:19.19 g/mL，微波功率109.47 W，微波時間3.02 min，在此條件下的黃酮得率為1.74 mg/g。考慮到儀器參數的限制、實驗的可操作性等問題，將最優的工藝條件修正為含水量41.80%，料液比1:19 g/mL，微波功率110 W，微波時間3.00 min，在此條件下進行驗證實驗，重復試驗3 次，得到的紫斑牡丹籽總黃酮得率為1.76 mg/g，與理論值接近，說明本研究優化得到的紫斑牡丹籽總黃酮的提取工藝參數是可靠的，可以擬合實際提取。

2.3 紫斑牡丹籽總黃酮的抗氧化性

2.3.1 清除DPPH·能力 由圖8 可知，無論是樣品溶液還是VC對照溶液的DPPH·清除能力都隨著溶液濃度的增大清除率變強，樣品溶液在0～40 μg/mL濃度范圍內呈現出良好的線性關系[28-29]。且樣品溶液濃度在40 μg/mL 時清除率達到穩定狀態，再繼續加大溶液濃度，清除率變化不大。雖然低于VC溶液，但其在80 μg/mL 清除率也達到了近82.00%。

圖8 紫斑牡丹籽總黃酮對DPPH·清除能力Fig.8 DPPH· scavenging ability of flavonoids in Paeonia rockii seeds

2.3.2 羥自由基清除率測定 紫斑牡丹籽總黃酮類化合物清除·OH 的清除率見圖9，在10～40 μg/mL之間濃度時樣品溶液的羥基自由基清除率呈現一個比較快的上升趨勢[30]。溶液濃度到40 μg/mL 時的羥基自由基清除率為38%，此后，再繼續加大溶液濃度，清除率變化不明顯，在80 μg/mL 濃度時的羥基自由基清除率為42.10%，僅上升了4%。總體看樣品溶液對羥基自由基的清除率隨著樣品溶液濃度的增加呈增大趨勢[31]。

圖9 紫斑牡丹籽總黃酮對·OH 清除能力Fig.9 ·OH scavenging ability of flavonoids in Paeonia rockii seeds

3 結論

本研究以產自山東菏澤的紫斑牡丹籽為研究對象，用微波輔助深共熔溶劑來提取紫斑牡丹籽中的黃酮類物質，在單因素實驗基礎上采用響應面優化了提取工藝，最佳提取條件為：深共熔溶劑體系為氯化膽堿-脲（摩爾比1:3），含水量41.80%，料液比1:19 g/mL，微波功率110 W，微波時間3.00 min，在此條件下的黃酮得率為1.76 mg/g。在抗氧化實驗發現紫斑牡丹籽總黃酮類物質對DPPH·、·OH 都具有一定的清除作用，清除能力均隨著溶液濃度的升高而變強。本研究通過對紫斑牡丹籽總黃酮提取工藝和體外抗氧化能力的研究，增加了紫斑牡丹籽的利用率，為紫斑牡丹籽深加工和紫斑牡丹籽黃酮開發提供理論依據和數據支持。