紫馬鈴薯花色苷提取工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性、抗氧化活性分析

張馨月，趙思毅，吳明陽(yáng)，李 益，高 濤，王新惠,3，劉 洋,*

（1.成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610106；2.達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川達(dá)州 635000；3.成都農(nóng)業(yè)科技中心，四川成都 610213）

紫馬鈴薯起源于安第斯山脈，近年來(lái)引入中國(guó)[1]，由于富含花色苷活性物質(zhì)使其呈現(xiàn)出紫皮紫瓤[2]。紫馬鈴薯花色苷（Purple-fleshed potatoes anthocyanins，PPA）作為食品天然活性物質(zhì)，是一種水溶性天然色素[3]，以糖苷鍵與多糖結(jié)合而成[4]，廣泛應(yīng)用于功能膳食開(kāi)發(fā)中[5]。研究表明，花色苷不僅可以賦予食品誘人的色澤，在維持身體健康方面也發(fā)揮著重要作用，例如抗炎、調(diào)節(jié)血壓、降血糖血脂等，有助于多種疾病的預(yù)防[6-7]。目前人們對(duì)天然活性物質(zhì)的需求日益增長(zhǎng)，紫馬鈴薯花色苷可作為良好的天然食品色素來(lái)源[8]。但由于花色苷在加工提取過(guò)程中極其不穩(wěn)定，容易受到提取環(huán)境的影響，因此，如何高效地提取花色苷成為該產(chǎn)業(yè)所面臨的重要問(wèn)題。

目前在國(guó)內(nèi)外研究中，紫馬鈴薯花色苷的主要提取方法為常規(guī)溶劑浸提（Conventional solvent extraction，CSE），通常采用水浴加熱與乙醇溶劑進(jìn)行提取[9]。隨著食品加工技術(shù)發(fā)展，更加有效的加工輔助技術(shù)開(kāi)始運(yùn)用于花色苷的提取，例如超聲輔助提取（Ultrasonic assisted extraction，UAE）、微波輔助提取（Microwave assisted solvent extraction，MSE）、酶法和脈沖電場(chǎng)法等。這些新型加工技術(shù)可以有效地破壞細(xì)胞壁膜，縮短提取時(shí)間，提高花色苷含量[10]。如Xu 等[11]通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化PPA 微波提取條件，在微波功率700 W，料液比15:1，酸化乙醇溶液（0.3%HCl）條件下，得到紫馬鈴薯花色苷含量為74.66 mg/100 g。Zhu 等[12]通過(guò)采用58%乙醇溶劑（pH2.5），在超聲時(shí)間為40 min 條件下提取PPA，得到花色苷含量93.52 mg/100 g。但由于常規(guī)提取溶劑易揮發(fā)導(dǎo)致提取物不穩(wěn)定不利于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。同時(shí)不同提取溶劑也會(huì)影響花色苷得率、成分結(jié)構(gòu)以及生物活性[13]。因此，提取溶劑對(duì)花色苷功能活性及生產(chǎn)應(yīng)用具有很大影響。低共熔溶劑提取法（Deep eutectic solvent，DES）作為當(dāng)前的熱點(diǎn)研究，通過(guò)制備新一代綠色環(huán)保高效低共熔混合物[14]，由氫受體與供體通過(guò)氫鍵相互作用，其具有不易揮發(fā)、環(huán)保和易制備等優(yōu)點(diǎn)[15]，其不僅綠色環(huán)保，還能提高花色苷的生物利用度[16-17]。如Da Silva 等[18]構(gòu)建三元低共熔溶劑氯化膽堿/丙三醇/檸檬酸（1:4:1）進(jìn)行提取，使得藍(lán)莓酚類化合物提取量達(dá)76%。目前關(guān)于紫馬鈴薯花色苷低共熔溶劑提取研究，以及不同提取方法對(duì)PPA 生物利用度對(duì)比研究較少。

因此，本研究以紫馬鈴薯總花色苷含量為指標(biāo)，比較不同紫馬鈴薯干燥方式、不同提取溶劑、不同輔助技術(shù)對(duì)其影響。為紫馬鈴薯產(chǎn)業(yè)實(shí)際生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。并對(duì)所得最大花色苷含量工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定紫馬鈴薯花色苷提取的最佳工藝條件。同時(shí)在相同提取條件下，比較不同溶劑對(duì)于紫馬鈴薯花色苷提取物穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響，以此擴(kuò)展紫馬鈴薯花色苷在食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫馬鈴薯 西藏凌云生物科技開(kāi)發(fā)有限公司提供；DL-蘋果酸、乳酸、無(wú)水甜菜堿 上海葉源生物科技有限公司；無(wú)水檸檬酸、無(wú)水葡萄糖、丙三醇天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH）上海市麥克林生物科技有限公司；過(guò)硫酸鉀、三氯化鐵等其他常見(jiàn)試劑均為分析純。

TGL-22S 高速冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；MKX-H1C1A 實(shí)驗(yàn)室微波爐 青島麥克威微波創(chuàng)新科技有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰儀器有限公司；UV-2700 紫外可見(jiàn)光分光度計(jì) 日本島津有限公司；PHS-3E 型pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Multiskan FC 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；DV-III 型粘度計(jì) 美國(guó)博勒飛有限公司；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；L3.5AB 柜式熱泵干燥機(jī) 成都一恒科技有限公司；Lab-1A-80 真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 取無(wú)腐爛、無(wú)破損的新鮮紫馬鈴薯、洗凈去皮，切成約0.5 cm 片狀。將預(yù)處理后的紫馬鈴薯切片均勻平鋪在樣品盤上，分別用熱風(fēng)干燥（Hot air drying，HAD）、熱泵干燥（Heat pump drying，HPD）設(shè)備在40 ℃下干燥樣品，隔2 h 取出紫馬鈴薯切片樣品稱重，直至干燥恒重[19]。同時(shí)，將紫馬鈴薯切片于-80 ℃下預(yù)凍，使用真空冷凍干燥（Vacuum freeze drying，VFD）設(shè)備干燥36 h 至恒重。上述不同干燥方式制得樣品，采用液氮研磨粉碎過(guò)100 目篩。得到三種不同制備方法的紫馬鈴薯凍干粉末，并于4 ℃、干燥、封閉環(huán)境下避光儲(chǔ)存。

1.2.2 比較不同處理方式對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量的影響

1.2.2.1 干燥方式對(duì)PPA 含量的影響 將紫馬鈴薯熱風(fēng)干燥粉末、紫馬鈴薯熱泵干燥粉末、紫馬鈴薯冷凍干燥粉末作為提取原料。定量稱取不同干燥方式制備所得紫馬鈴薯粉于離心管中，采用崔倩[20]的方法，稍加修改。根據(jù)1:40（g/mL）的料液比，加入70%的乙醇溶劑，在40 ℃恒溫提取60 min，冷卻至室溫后離心10 min（8000 r/min）。測(cè)定上清液中PPA 的含量。以花色苷含量為指標(biāo)，選擇最佳的紫馬鈴薯干燥方法。

1.2.2.2 不同提取方法對(duì)PPA 含量的影響 選擇最佳的紫馬鈴薯干燥方式，采用不同方法提取紫馬鈴薯花色苷。CSE：根據(jù)1.2.2.1 中方法進(jìn)行。UAE：采用于雅靜等[21]的方法，稍加修改；按照1:45（g/mL）的料液比加入70%乙醇溶液。在30 ℃的初始超聲溫度條件下，超聲功率80 W 超聲提取20 min，冷卻至室溫后10000 r/min 下離心10 min，取上清液，測(cè)定其中 PPA 的含量。MSE：采用韓東等[22]的方法，略有改動(dòng)；根據(jù) 1:50（g/mL）的料液比，加入70%的乙醇溶劑，在微波功率700 W 下利用微波儀提取30 s，取出后冷卻至室溫后，離心10 min（10000 r/min）。測(cè)定PPA 含量。以PPA 含量為指標(biāo)，選擇最佳的紫馬鈴薯花色苷提取方式。

1.2.3 DES 的制備及理化性質(zhì) 由于甜菜堿是一種可進(jìn)行生物降解且價(jià)格低無(wú)毒害的中性分子[23]，故由甜菜堿作為氫鍵受體，與氫鍵供體由不同種類的醇基、糖基和酸基組成。按照摩爾比準(zhǔn)確稱量于錐形瓶中，在70 ℃水浴下進(jìn)行磁力攪拌至形成無(wú)色透明的均勻液體，密封后置于室溫下保存?zhèn)溆肹24]。DES的種類及摩爾比如表1 所示。

表1 五種低共熔溶劑種類及摩爾比Table 1 Five types of deep eutectic solvents and molar ratios

其中DES-1～DES-3 為基于有機(jī)酸所制備的酸性低共熔溶劑，DES-4 和DES-5 分別以丙三醇和葡萄糖作為醇基和糖基。在含水量為30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）時(shí)，取所制備不同種類DES 溶劑25 mL，采用粘度計(jì)及pH 計(jì)，在室溫下測(cè)定粘度和pH，探究其理化性質(zhì)。

1.2.4 DES 的選擇 按照1.2.2.2 中選出的最佳方法提取紫馬鈴薯花色苷。將DES 作為提取溶劑，以PPA 含量為指標(biāo)，選擇最佳的DES。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以最佳DES 為提取溶劑，紫馬鈴薯花色苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定DES 溶劑摩爾比1:2，DES 溶劑含水量30%，料液比1:50，微波功率700 W，微波時(shí)間50 s 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別考察DES 的摩爾比（2:1、1:1、1:2、1:3、1:4）；DES 的含水量（10%、20%、30%、40%、50%）；料液比（1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 g/mL）；微波功率（500、600、700、800、900 W）；微波時(shí)間（10、30、50、70、90 s）對(duì)花色苷含量的影響。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面試驗(yàn)的方法優(yōu)化微波輔助DES 提取紫馬鈴薯花色苷工藝，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。采用Box-Behnken Design 設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)方案，對(duì)紫馬鈴薯花色苷提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.7 總花色苷含量的測(cè)定 采用pH 示差法測(cè)定花色苷含量[25]。根據(jù)公式（1）計(jì)算花色苷含量，花色苷含量以紫馬鈴薯花色苷提取液中含有的矢車菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量來(lái)表示。

式中：Mw—矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/moL）；A—花色苷吸光度，A=（A535pH1.0-A700pH1.0）-（A535pH4.5-A700pH4.5）；DF—稀釋倍數(shù)；V—提取液體積（mL）；ε—矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（26900 L/mol·cm）；L—比色皿寬度（cm）；Wt—樣品質(zhì)量（g）。

1.2.8 PPA 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo) 以紫馬鈴薯花色苷的保存率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定不同條件下花色苷含量變化，進(jìn)行穩(wěn)定性分析，PPA 保存率計(jì)算公式（2）如下：

式中：C1—保存后花色苷含量；C0—保存前花色苷含量。

1.2.9 紫馬鈴薯花色苷穩(wěn)定性及生物活性的研究根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化所得最佳工藝條件下，分別采用不同提取溶劑：70%乙醇溶液（EtOH）以及最佳低共熔溶劑進(jìn)行提取，對(duì)不同提取溶劑所得PPA 穩(wěn)定性及抗氧化活性進(jìn)行比較。

1.2.9.1 不同光照對(duì)PPA 穩(wěn)定性的影響 分別取不同提取溶劑所得PPA 提取液樣品3 份各10 mL，分別置于避光、自然光和太陽(yáng)光下放置共8 d，每隔1 d 進(jìn)行測(cè)定，共平行測(cè)定8 次，測(cè)定其吸光度值并計(jì)算PPA 保存率。

1.2.9.2 不同溫度對(duì)PPA 穩(wěn)定性的影響 分別取不同提取溶劑所得PPA 提取液樣品6 份各10 mL，分別于4、20、40、60、80、100 ℃放置共8 h，每隔1 h進(jìn)行測(cè)定，共平行測(cè)定8 次，測(cè)定其吸光度值并計(jì)算PPA 保存率。

1.2.9.3 PPA 對(duì)DPPH 自由基清除能力測(cè)定 參考Wang 等[26]方法，稍加修改進(jìn)行測(cè)定。首先取不同提取溶劑所得PPA 提取液，配制成不同梯度溶液（50、100、150、200、160、250、300 μg/mL）。將DPPH 試劑（0.5 mmol/L）分別與不同梯度樣品溶液1:1 混合處理。于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，避光反應(yīng)30 min。用酶標(biāo)儀在517 nm 處測(cè)吸光度，記為樣品組A1；用無(wú)水乙醇代替DPPH 溶液，測(cè)得吸光度為對(duì)照組A2；用無(wú)水乙醇代替樣品為空白對(duì)照，測(cè)得吸光度為A3；按照公式計(jì)算DPPH 自由基清除率，D-異抗壞血酸VC配制成與PPA 溶液相同梯度溶液為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.9.4 PPA 對(duì)ABTS+自由基清除能力測(cè)定 參考Meng 等[27]實(shí)驗(yàn)方法，稍加修改測(cè)定。將7.4 mmol/L ABTS 溶液與4.5 mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液等比例混合，避光下反應(yīng)12～16 h 制得ABTS 儲(chǔ)備液。再用無(wú)水乙醇稀釋ABTS 溶液，使其在734 nm 處的吸光值為0.700±0.02。取0.1 mL 樣品溶液（50～300 μg/mL）和3 mL 的ABTS 儲(chǔ)備液，混勻30 s 后，室溫下避光反應(yīng)6 min，在734 nm 處用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值為A1；用無(wú)水乙醇代替ABTS 工作液做樣品空白對(duì)照，測(cè)得吸光度為A2；用無(wú)水乙醇代替樣品溶液，測(cè)得吸光度為A0。按照公式計(jì)算ABTS+自由基清除率，VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.9.5 PPA 對(duì)OH 自由基清除能力測(cè)定 參考Samsonowicz 等[28]的方法加以修改。按順序依次加入1 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）、1 mL 水楊酸溶液（9 mmol/L），再加入適量PPA 提取液（50～300 μg/mL）和去離子水，最后加入1 mL H2O2溶液（8.8 mmol/L）混合，使反應(yīng)體系總體積為15 mL。在37 ℃下避光反應(yīng)30 min 后，在510 nm 下測(cè)定吸光度。OH 自由基清除能力按照公式計(jì)算，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。式中A0為不加樣品的空白對(duì)照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為不加顯色劑組的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office excel 2019、Design expert 10.0.3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；運(yùn)用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式和提取方法對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量影響比較

為了評(píng)價(jià)不同干燥方式對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量影響，在相同提取條件下，比較不同干燥方式HAD、HPD、VFD 對(duì)PPA 含量的影響。結(jié)果如圖1（A）所示，采用VFD 所得的紫馬鈴薯凍干粉提取花色苷，所得PPA 含量最高，為130.15±1.27 mg/100 g（P＜0.01）。這是由于PPA 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在高溫加熱情況下很容易發(fā)生降解。Martynenko 等[29]通過(guò)對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行熱處理，探究藍(lán)莓花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)變化，結(jié)果顯示花色苷對(duì)熱極為敏感，加熱過(guò)程中其含量顯著降低。而在VFD 整個(gè)干燥過(guò)程中紫馬鈴薯一直處于低溫真空的狀態(tài)，對(duì)于易降解的花色苷破壞較小，使其有效保留。比較不同提取方法CSE、MSE、UAE 對(duì)PPA 提取含量的影響。由圖1（B）可以看出，采用微波輔助提取紫馬鈴薯花色苷效果最佳。在微波輻射的作用下，花色苷細(xì)胞通過(guò)離子遷移引起分子運(yùn)動(dòng)[30]在內(nèi)部快速產(chǎn)生熱能，導(dǎo)致細(xì)胞組織破裂，得到PPA 含量為154.65±3.10 mg/100 g（P＜0.01），且用時(shí)最短。

圖1 不同干燥方式（A）和提取方法（B）對(duì)PPA 含量影響Fig.1 Effect of different drying methods (A) and extraction methods (B) on the content of PPA

2.2 不同種類DES 對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量的影響

2.2.1 DES 的選擇及理化性質(zhì) 不同DES 體系對(duì)PPA 的含量影響也不同。從圖2（A）五種DES 理化性質(zhì)圖可以看出，采用有機(jī)酸基所制備的DES 比醇基和糖基制備的DES 具有更低的pH，其中采用檸檬酸所制備的溶劑pH 最小，同時(shí)以葡萄糖制備的低共熔溶劑粘度最大。從圖2（B）可知，采用有機(jī)酸基所制備的DES 對(duì)PPA 的含量高于糖基和醇基制備的DES（P＜0.05）。這是由于在酸性條件下花色苷更穩(wěn)定。同時(shí)羧基可以增強(qiáng)低共熔溶劑組分間氫鍵相互作用，從而提高提取含量[31]。因此，本研究選擇甜菜堿和檸檬酸所制備的DES-2 作為提取溶劑。

圖2 不同DES 溶劑的理化性質(zhì)（A）和不同DES 溶劑對(duì)PPA 含量的影響（B）Fig.2 Physicochemical properties of different DES (A) and effect of different DES on the content of PPA (B)

2.2.2 不同提取溶劑比較 將純水、60%甲醇、70%乙醇溶液在1.2.2.2 三種不同提取方法下，比較不同提取溶劑對(duì)PPA 含量影響。同時(shí)，與最佳低共熔溶劑進(jìn)行比較。結(jié)果如圖3 所示，可以看出三種不同提取方法下，DES-2 作為提取溶劑所得紫馬鈴薯花色苷含量高于其他溶劑，這與Bi 等[32]采用氯化膽堿-乳酸低共熔溶劑提取桑葚花色苷效果一致，花色苷提取含量顯著高于乙醇溶液。在微波輔助條件下，DES-2 提取PPA 含量最高為211.73±3.35 mg/100 g。同時(shí)所制得低共熔溶劑安全性高、揮發(fā)性低，綠色環(huán)保。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 DES 的摩爾比 本研究考察不同摩爾比對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量的影響。如圖4（A）所示，當(dāng)甜菜堿-檸檬酸體系摩爾比從2:1 到1:2 時(shí)，PPA 含量逐漸增高。但當(dāng)摩爾比達(dá)到1:3 時(shí)，花色苷含量開(kāi)始下降。這可能是由于氫鍵受體體系濃度不斷降低，導(dǎo)致與提取物之間的可結(jié)合的氫鍵數(shù)量不斷減少，從而導(dǎo)致含量降低[33]。因此，甜菜堿和檸檬酸所組成的最佳DES 摩爾比為1:2。

圖4 不同因素對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量的影響Fig.4 Effect of different factors on PPA content

2.3.2 DES 的含水量 由于低共熔溶劑粘度偏大，一般需在制備過(guò)程中添加適量水以此降低粘度，提高傳質(zhì)速率。本研究考察了不同含水量（10%、20%、30%、40%和 50%）的低共熔溶劑對(duì)PPA 含量的影響。如圖4（B）所示，當(dāng)含水量為30%時(shí)溶劑體系結(jié)構(gòu)變化不大，但其粘度降低、使得極性增強(qiáng)[34]，PPA含量最高為212.70±1.75 mg/100 g。但隨著含水量不斷增大，會(huì)造成氫鍵受體和氫鍵供體之間相互作用，從而導(dǎo)致DES 分子結(jié)構(gòu)受到破壞，使得PPA含量下降[35]。因此，DES 的最佳含水量為30%。

2.3.3 料液比 由圖4（C）可知，隨著液料比的增加，紫馬鈴薯花色苷含量增加，當(dāng)液料比超過(guò)1:50 后呈下降趨勢(shì)。可能是由于DES 溶劑的增加，增大PPA的傳質(zhì)，使PPA 含量顯著增加（P＜0.05）。但隨著PPA在DES 溶劑中溶解達(dá)到飽和后，同時(shí)DES 體系粘度不斷增大，導(dǎo)致紫馬鈴薯花色苷含量下降。因此，最佳料液比為1:50。

2.3.4 微波功率 由圖4（D）可知，當(dāng)微波功率從500 W 增加到800 W 時(shí)，PPA 含量不斷提高，但隨著微波功率繼續(xù)提高后，PPA 含量反而下降。這可能是由于當(dāng)微波功率不斷升高，微波同時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大的熱能，使得PPA 出現(xiàn)熱降解[36]。因此，選擇800 W為最佳微波功率。

2.3.5 微波時(shí)間 考察了不同微波時(shí)間（10、30、50、70、90 s）對(duì)PPA 含量的影響。由圖4（E）可知，微波時(shí)間為30 s 時(shí)，PPA 含量最高，但當(dāng)微波時(shí)間不斷增加時(shí)，含量下降。這可能是由于短時(shí)微波就能使細(xì)胞壁裂解，PPA 溶出含量升高。但隨著微波時(shí)間的增加，由于機(jī)械效應(yīng)，導(dǎo)致微波溫度大幅度升高，花色苷發(fā)生熱降解。因此，微波時(shí)間選擇為30 s。

2.4 微波輔助提取花色苷響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 為了確定最佳提取PPA 工藝條件，以微波時(shí)間、微波功率、DES 含水量、DES 摩爾比4 個(gè)因素作為主要影響因素，同時(shí)以紫馬鈴薯花色苷提取含量為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiment

設(shè)微波時(shí)間、微波功率、DES 含水量和DES 摩爾比分別為A、B、C、D，以PPA 含量為響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：YPPA含量=227.59-3.37A-1.77B-3.47C+1.87D-4.43AB-2.58AC+0.42AD-15.58BC+0.044BD-3.62CD-17.1A2-13.92B2-14.53C2-10.54D2。回歸方程方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 PPA 含量模型及回歸系數(shù)的回歸分析結(jié)果Table 4 Results of regression analysis of PPA content model and regression coefficients

由表4 可知，該模型差異極顯著（P＜0.0001），決定系數(shù)R2為0.9853，說(shuō)明模型擬合程度優(yōu)良，能較為直觀地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型誤差較小，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9706，說(shuō)明模型的相關(guān)性和解釋度都很好，可以用此模型進(jìn)行理論分析和預(yù)測(cè)。分析各因素對(duì)PPA 含量的影響可知，一次項(xiàng)微波時(shí)間、DES 含水量對(duì)PPA 含量影響極顯著（P＜0.01），微波功率、DES 摩爾比對(duì)PPA 含量具有顯著影響（P＜0.05）。4 個(gè)影響因素中，對(duì)PPA 含量影響次序?yàn)镃＞A＞D＞B，最大的為DES 含水量，其次為微波時(shí)間，而后為DES 摩爾比，影響最小的為微波功率。二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)PPA 含量的影響極顯著（P＜0.01），說(shuō)明四個(gè)因素對(duì)PPA 含量具有非線性的影響。交互項(xiàng)BC、AB、CD 對(duì)PPA含量影響極顯著（P＜0.01），AC 對(duì)PPA 含量影響顯著（P＜0.05）。

2.4.2 提取工藝響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過(guò)3D 響應(yīng)面圖可以較為直觀地反映出DES 含水量、DES 摩爾比、微波時(shí)間及微波功率變量交互作用對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量的影響。根據(jù)3D 響應(yīng)面形狀，曲面越陡，說(shuō)明兩因素交互作用越顯著，此模型存在最大值穩(wěn)定點(diǎn)，紫馬鈴薯花色苷含量的最大值出現(xiàn)在中間點(diǎn)[37]。

如圖5 所示，AB、AC、BC 和CD 的3D 響應(yīng)面圖下方的等高線圖形呈較為扁的橢圓形與方差分析相吻合，交互作用顯著。隨著不同因素增加過(guò)程中，PPA 含量也呈先增加后降低的趨勢(shì)，符合方差分析結(jié)果。

圖5 紫馬鈴薯花色苷含量與各因素的交互作用3D響應(yīng)面圖Fig.5 3D Response surface plots of the interaction between PPA content and various factors

2.4.3 最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以紫馬鈴薯花色苷含量最大值為優(yōu)化目標(biāo)，由Design-Expert 10.0.3軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到預(yù)測(cè)PPA 含量為228.067 mg/100 g，四個(gè)因素的預(yù)測(cè)值分別為微波時(shí)間28.201 s、微波功率為802.912 W、DES 含水量28.594%、DES 摩爾比為1:2.111，為了確定該模型的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為方便操作，條件參數(shù)設(shè)為微波時(shí)間28.0 s、微波功率為800 W、DES 含水量28.6%、DES 摩爾比為1:2.1，該條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，測(cè)得PPA 含量平均值為228.658±1.241 mg/100 g，較模型預(yù)測(cè)值差異不大，說(shuō)明該模型優(yōu)化得到的工藝參數(shù)可靠。同時(shí)與傳統(tǒng)浸提工藝（CES）相比，PPA 含量提高了56.92%（P＜0.01）。

2.5 不同提取溶劑對(duì)紫馬鈴薯花色苷生物活性的影響

2.5.1 環(huán)境條件對(duì)紫馬鈴薯花色苷穩(wěn)定性影響 根據(jù)最佳工藝條件，采用70%乙醇溶液（EtOH）和最優(yōu)低共熔溶劑體系：甜菜堿/檸檬酸（DES-2）對(duì)PPA 進(jìn)行提取，探究不同提取溶劑對(duì)PPA 穩(wěn)定性影響。光照條件對(duì)PPA 穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6A，可以看出在避光條件下儲(chǔ)存5 d 后，不同溶劑體系提取所得PPA均相對(duì)穩(wěn)定，保存率維持在90%以上。自然光下PPA 提取液降解速率較慢，但采用EtOH 提取所得PPA 樣品下降趨勢(shì)高于DES-2。太陽(yáng)光直射對(duì)PPA 保存率影響最大，長(zhǎng)時(shí)間光照使不同溶劑提取所得PPA 都出現(xiàn)明顯降解。這與張海霞等[38]結(jié)論一致，研究認(rèn)為長(zhǎng)時(shí)間光照會(huì)導(dǎo)致花色苷炭骨架結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致花色苷降解，但短時(shí)間光照對(duì)花色苷影響不大。溫度條件對(duì)其穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6B，在不同溫度環(huán)境下，PPA 保存率與溫度呈反比。儲(chǔ)存在4、20 ℃時(shí)，DES 提取所得PPA 放置8 h 后保存率均在90%以上，但采用EtOH 提取所得PPA 在20 ℃條件下保存率降至86.04%。隨著溫度的提升PPA穩(wěn)定性不斷降低，且采用EtOH 提取所得樣品保存率明顯低于DES-2 體系。其下降趨勢(shì)與Condurache等[39]的研究相似，以10 ℃的間隔80～130 ℃下加熱紫茄皮提取物，花青素總含量隨著溫度的升高而大幅度下降。以上分析可得DES 提取所得PPA 在不同光照、溫度環(huán)境條件下，穩(wěn)定性均優(yōu)于EtOH 體系，因此在食品加工貯藏過(guò)程中，紫馬鈴薯花色苷應(yīng)保持在低溫避光條件下以提高穩(wěn)定性，為PPA 實(shí)際應(yīng)用加工條件選擇提供理論參考。

圖6 不同提取溶劑對(duì)紫馬鈴薯花色苷在不同環(huán)境條件下的影響Fig.6 Effects of different extraction solvents on PPA under different environmental conditions

2.5.2 紫馬鈴薯花色苷抗氧化活性研究 探究不同提取溶劑（EtOH/DES-2）對(duì)PPA 體外抗氧化活性的影響。從圖7A 中看出，不同溶劑提取所得PPA 清除DPPH 自由基能力與其濃度都呈正比關(guān)系，隨著濃度的增大而增強(qiáng)。但VC抗氧化能力稍強(qiáng)于PPA，當(dāng)質(zhì)量濃度為300 μg/mL 時(shí)，EtOH、DES-2 和VC的自由基清除能力分別為84.20%、92.12%和94.86%。從圖7B 可以看出當(dāng)不同溶劑提取所得PPA 濃度從50 μg/mL 上升到300 μg/mL 時(shí)，DES-2 所得樣品對(duì)ABTS+自由基清除率從74.50%增加至92.08%，EtOH所得樣品對(duì)ABTS+自由基清除率從68.37%增加至88.61%，兩者均與濃度呈正比。如圖7C 所示，在不同溶劑提取所得PPA 樣品濃度為50 μg/mL 時(shí)，清除率均優(yōu)于VC。當(dāng)樣品濃度達(dá)到300 μg/mL 時(shí)，EtOH 和DES-2 溶劑提取所得樣品對(duì)羥自由基的清除率分別為60.25%和77.53%。通過(guò)計(jì)算得到不同樣品對(duì)自由基清除能力的IC50如表5 所示。因此可以得出，通過(guò)微波輔助DES-2 提取所得的PPA 抗氧化活性優(yōu)于常規(guī)溶劑提取。

圖7 不同提取溶劑對(duì)紫馬鈴薯花色苷抗氧化活性影響Fig.7 Effects of different extraction solvents on antioxidant activity of PPA

表5 抗氧化能力IC50 值分析結(jié)果Table 5 Results of IC50 analysis of antioxidant capacity

3 結(jié)論

本研究通過(guò)比較花色苷含量，確定紫馬鈴薯干燥方式、花色苷提取方法以及溶劑的選擇。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助低共熔溶劑提取紫馬鈴薯花色苷工藝。在最優(yōu)工藝條件下，與常規(guī)溶劑提取比較所得花色苷生物活性。該法通過(guò)甜菜堿/檸檬酸為氫鍵受體與供體制備酸性低共熔溶劑，在最優(yōu)條件下所得紫馬鈴薯花色苷含量達(dá)228.658±1.241 mg/100 g。通過(guò)考察穩(wěn)定性影響，同時(shí)與常規(guī)浸提相比，DES-2 提取所得紫馬鈴薯花色苷穩(wěn)定性更好。在不同光照下對(duì)紫馬鈴薯花色苷影響最大為太陽(yáng)光，避光情況下紫馬鈴薯花色苷保存率可達(dá)90%以上。隨著溫度的升高，紫馬鈴薯花色苷的降解速度明顯加快。抗氧化能力結(jié)果顯示，通過(guò)DES-2 提取所得花色苷的DPPH自由基清除能力IC50值為41.54 μg/mL，ABTS+自由基清除能力IC50值為11.30 μg/mL，OH 自由基清除能力IC50值為22.44 μg/mL，均強(qiáng)于通過(guò)常規(guī)溶劑提取。因此研究表明，溶劑選擇不僅對(duì)紫馬鈴薯花色苷含量產(chǎn)生影響，同時(shí)對(duì)紫馬鈴薯花色苷生物活性也會(huì)產(chǎn)生一定影響，本研究制備的低共熔溶劑可有效提升花色苷生物利用度，為后續(xù)花色苷產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。但目前的研究對(duì)花色苷的結(jié)構(gòu)成分變化尚有不足，花色苷降解過(guò)程中結(jié)構(gòu)的改變有待探究，在接下來(lái)的研究中，對(duì)采用不同溶劑方法提取所得花色苷進(jìn)行組分鑒定及成分分析，為合理開(kāi)發(fā)紫馬鈴薯花色苷資源提供科學(xué)依據(jù)。