聚魯米諾修飾復合電極電化學發光分析法測定豆類樣品中鉬（Ⅵ）含量

徐藝鳳，徐承娥，熊海濤

（陜西理工大學化學與環境科學學院，陜西漢中 723001）

鉬是人體所必需的14 種微量元素之一。盡管其在人體內的含量較低，但卻在人體生命過程中具有重大作用，能夠維持人體正常的新陳代謝。大量研究表明[1-2]：人體缺乏鉬將會導致肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌、齲齒、腎結石等多種疾病發生，也會加重心肌損傷，甚至造成心肌壞死。另外，鉬的缺乏也會導致人體生長發育遲緩，智能異常等。然而，過量的鉬則會損傷血細胞，致使心血管疾病，影響人體發育等[3-4]。因此，發展一種靈敏度高且選擇性好的測定微量鉬的方法是有著十分重要的意義。目前，對Mo（Ⅵ）的檢測方法有分光光度法[5-6]、原子吸收光譜法[7-8]、原子發射光譜法[9-10]、原子熒光光譜法[11-12]、化學發光分析法[13-14]、熒光光譜法[15-16]及溶出伏安法等[17-18]，但是這些方法存在著靈敏度較低、操作繁瑣、儀器昂貴或污染環境等缺點。

作為電化學與化學發光相結合的產物，電化學發光分析法具有二者的共同優點，如靈敏度高、可控性強、分析速度快、發光信號易于檢測等，其經常與納米材料相結合，能進一步提高該方法的分析特性，并拓寬其應用范圍[19-20]。近些年，也有利用電化學發光分析法測定Mo（Ⅵ）的文獻報道[21-22]，其主要是基于在Mo（Ⅵ）能被電還原為Mo（III），該低價態Mo 能將電解液中的溶解氧還原生成超氧負離子自由基（O2-·），而魯米諾能與O2-·與產生顯著的化學發光反應。但是這兩種檢測Mo（Ⅵ）含量的電化學發光分析法中，前者因為采用了碳糊修飾電極，使得其制備方法繁瑣、費時且重現性較差[21]，而后者則采用了流動注射進樣技術，導致實驗過程中的試劑消耗較大[22]。另外，這兩種方法因均沒有結合信號放大技術而導致方法的靈敏度均不是很理想。

石墨烯（Graphen）是由多個碳原子通過共價鍵合連接而形成的一種具有二維蜂窩狀晶格的納米材料[23]，由于其資源豐富，比表面積大，具有優良的電子傳遞與物理化學性質等特性而受到廣泛的關注，且已經被大量應用于電化學發光生物傳感領域[24-25]。另一方面，AuNPs 因優異的導電性能、量子尺寸效應、良好的生物相容性及易于修飾等特性而與石墨烯相結合成復合納米材料來進行協同信號放大，并進行高靈敏度電化學發光分析[26-27]。已報道的文獻中，大多使用電沉積法[28-29]與水熱合成法[29-30]來制備石墨烯-AuNPs 復合納米材料。但是這兩種制備方法通常存在著操作繁瑣或浪費試劑等不足。截止至目前為止，還沒有文獻報道將帶正電荷的AuNPs（（+）AuNPs）通過靜電作用組裝于Nafion-Graphen 表面以進行電化學傳感分析。

本文首先利用靜電作用將（+）AuNPs 組裝于帶負電荷的Nafion-Graphen 修飾電極表面，然后再將魯米諾電聚合于Nafion-Graphen/（+）AuNPs 雙納米材料功能化的修飾電極表面。由于Mo（Ⅵ）的電還原產物Mo（III）對魯米諾的電還原發光信號具有增敏作用[21-22]，從而建立了一種高靈敏型測定Mo（Ⅵ）含量的電化學發光分析新方法。該方法利用雙納米材料協同增敏效應與聚魯米諾的優良電化學發光特性，使得該方法靈敏度較高且節省試劑，以期實現對常見的兩種豆類樣品中Mo（Ⅵ）含量的靈敏、準確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵氰化鉀、硼砂、氯化鉀、鹽酸 成都化學試劑廠；氫氧化鈉、硫酸 西安化學試劑廠；鉬酸銨 南京全隆生物技術有限公司，主要用來配制Mo（Ⅵ）儲備液；無水乙醇 天津市富宇精細化工有限公司；魯米諾與半胱胺 西格瑪奧德里奇貿易有限公司；115 型Nafion 美國杜邦公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石墨烯 南京先豐納米材料科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）武漢德晟生化科技有限公司；氯金酸山東天銘生物科技發展有限責任公司；除鹽酸、硫酸為98%化學純，其它均為98%的分析純；所用水均為高純水。

CHI600D 型電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；IFFM-E 型流動注射化學發光分析儀 西安瑞邁分析儀器有限公司；KQ5200DE 型超聲波清洗儀 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；JEM-2100 型透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；90P1us PALS Zeta 電位分析儀 美國布魯可海文儀器公司北京辦事處；三電極系統 自制工作電極—Nafion-Graphene/（+）AuNPs 修飾玻碳電極，參比電極—飽和甘汞電極或AgCl/Ag 電極，對極為鉑絲電極。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備 2.0 mg/mL 石墨烯（Graphen，用DMF 溶解）；Tris-HCl 緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，pH7.4）；1.0×10-3mol/L Mo（Ⅵ）儲備液。

1.0×10-2mol/L 魯米諾儲備溶液：準確稱取0.1172 g 的魯米諾，先用2.0 mL DMF 溶解，然后用0.05 mol/L H2SO4稀釋定容到100 mL 容量瓶中，將溶液轉移至棕色瓶中并置于暗處保存。

Nafion-Graphene 混合溶液的制備：將2.0 mg/mL石墨烯分散液與0.2% Nafion 的乙醇溶液以1:1（V/V）混合，將該混合溶液在超聲（功率100 W）振蕩分散1 h，即得到Nafion-Graphene 混合溶液。

1.2.2 （+）AuNPs 的制備及表征 參照文獻[31-32]，并稍作修改：將40 mL HAuCl4（0.01 mol/L）溶液置于100 mL 的燒杯中，加入0.4 mL 半胱胺溶液（0.20 mol/L），室溫下充分攪拌約30 min。然后，繼續向燒杯中加入10 μL NaBH4溶液（0.01 mol/L），將燒杯置于暗處攪拌15 min。觀察溶液變成酒紅色停止加熱。最后，將制備完成的（+）AuNPs 溶液使用0.22 μm 的濾膜進行過濾，轉移至100 mL 容量瓶中，避光保存于4 ℃冰箱。

用移液器取8.0 μL AuNPs 膠體并滴于銅網（300 目）表面，于密閉的培養皿中過夜晾干，再于透射電子顯微鏡（TEM）下進行表征。另外，實驗還利用Zeta 電位儀測定AuNPs 膠體表面的電荷。

1.2.3 Nafion-石墨烯/（+）AuNPs/聚魯米諾修飾電極的制備與表征 首先，將玻碳電極打磨拋光，依次用無水乙醇與超純水超聲清洗。取8 μL 上述1.2.1 所制得的Nafion-Graphene 混合溶液，滴加在預處理好的玻碳電極表面，晾干后繼續滴加10 μL 上述1.2.2 所制得的（+）AuNPs 于Nafion-Graphene 修飾電極表面進行靜電組裝，30 min 之后用高純水沖洗三次。接著，將Nafion-Graphene/（+）AuNPs 修飾電極置于含有1.0×10-5mol/L 魯米諾的硫酸溶液中，設置掃速為100 mV/s，施加-0.2～1.2V的電位，進行10 圈的循環掃描，掃描結束后取出，用飽和硼砂緩沖溶液淋洗電極表面至少3 次，得到聚魯米諾（Ployluminol）復合物膜修飾電極，即Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployluminol 修飾電極，其制備過程如圖1所示。

圖1 聚魯米諾復合修飾電極的制備示意圖Fig.1 Preparation illustration of polyluminol composite modified electrode

分別將裸玻碳電極（GCE）、Nafion-GCE、Graphene-GCE 及Nafion-Graphene/（+）AuNPs 修飾電極作工作電極（參比電極與對極見1.1）插入到含有5.0 mmol/L [Fe（CN）6]3-/4-與0.10 mol/L KCl 的溶液中（pH7.4），設定電位掃描速率為100 mV/s，在-0.20～0.60 V 電位范圍內利用電化學工作站進行電化學表征。

1.2.4 樣品預處理 各準確稱取1.0000 g 黃豆與綠豆種子于兩只瓷坩堝中，置于馬費爐中600 ℃灰化3 h 至灰白色，待溫度降至150 ℃取出并冷卻至室溫，加入適量4.0 mol/L HNO3溶液使處理后的樣品溶解，再加入適量1.0 mol/L NaOH 溶液調節pH 至10，過濾掉不溶物。最后，將其加水定容至100 mL容量瓶，作為分析樣品儲存備用。

1.2.5 電化學發光檢測實驗方法 在三電極系統中，先將剛修飾好的聚魯米諾復合物膜修飾電極置于3.0 mL 飽和硼砂中，開啟電化學工作站與化學發光分析儀，設定負高壓為700 V，于-1.0～-0.1 V 電位范圍內進行循環伏安掃描，然后記錄循環伏安曲線（CV）與電化學發光信號（I0），用緩沖溶液淋洗三次。隨后，滴加10 μL 不同濃度（5.0×10-9、8.0×10-9、1.0×10-8、3.0×10-8、5.0×10-8、7.0×10-8、1.0×10-7、5.0×10-7、8.0×10-7及1.0×10-6mol/L）的Mo（Ⅵ）溶液于電極表面并富集13 min，再用飽和硼砂溶液沖洗電極3 次，采用循環伏安進行表征并利用化學發光分析方法對電化學發光信號進行測試，記錄相應的CV 曲線及電化學發光信號（It），以相對電化學發光信號（ΔI=It-I0）進行樣品的定量分析。

1.3 數據處理

每一組實驗平行測定三次，將所得數據利用Excel 2016 軟件求算相應的平均值±標準偏差，再用Origin 8.0 軟件進行作圖處理。

2 結果與分析

2.1 帶正電荷AuNPs 的表征

AuNPs 的TEM 圖如圖2 所示，實驗所合成的AuNPs 呈球形顆粒，且分散性較好，其粒徑約為30～33 nm，這與文獻報道基本一致[31]。另外，其Zeta 電位測定值為+32.0 mV，說明該AuNPs 表面的正電荷密度較高。這也為實驗中（+）AuNPs 能輕易通過靜電組裝而修飾于Nafion 修飾電極表面提供了可能。

圖2 （+）AuNPs 的TEM 圖Fig.2 TEM image of（+）AuNPs

2.2 Nafion-Graphene/（+）AuNPs 修飾電極的電化學表征

由圖3 可知，在裸GCE 上，氧化還原峰呈標準可逆特征（曲線a）；經Nafion 修飾后，其相應峰電流發生顯著下降（曲線b），這可能是由于自身顯負電性的Nafion（陽離子交換樹脂）與同樣帶有負電荷的[Fe（CN）6]3-/4-難以相互作用甚至產生強大的排斥；待滴涂Nafion-Graphene 混合液后，其峰電流雖有增大，但卻變得不可逆（曲線c，對應的氧化峰-還原峰電位差ΔE=125 mV，遠超可逆電化學響應ΔE＜59.2 mV），這主要是由于石墨烯具有較大的表面積與良好的導電性能所致；之后將（+）AuNPs 修飾在 Nafion-Graphene 修飾電極上，表現出更強的峰電流（曲線d），該現象可能是由于：帶正電荷的納米金進一步增大了該電極的有效電活性面積，與此同時Nafion-Graphene修飾電極表面的負電特性變為部分正電荷特性，從而能通過靜電作用使帶負電荷的[Fe（CN）6]3-/4-探針更有效地擴散到電極表面，導致修飾電極表面的氧化還原電流再次增大。以上現象表明Nafion-Graphene/（+）AuNPs 作為修飾材料時，電極表面的電子傳導效率得到一定程度的提高。

圖3 不同修飾電極在[Fe（CN）6]3-/4-電解液中的循環伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes in [Fe（CN）6]3-/4- electrolyte

2.3 不同修飾電極表面的電化學行為及電化學發光行為研究

為了深入研究這種復合物膜的電化學發光特性，在-1.0～-0.1 V 電位范圍內，分別記錄了在飽和硼砂介質中，聚魯米諾修飾電極加入一定量Mo（Ⅵ）前后的電化學行為及電化學發光響應。由圖4A 可知，將Nafion-Graphene/（+）AuNPs 依次涂層在裸電極上后，其呈現出較弱的電化學響應（曲線a）；隨后，將魯米諾電聚合于該修飾電極，電化學響應有所升高（曲線b）；加入一定濃度的Mo（Ⅵ）于該修飾電極表面15 min 后，這時的電化學響應增強（曲線c）。這可能是因為魯米諾電聚合于修飾電極表面后，在堿性介質中能夠發生電化學反應，而當Mo（Ⅵ）作用在該聚魯米諾復合修飾電極上后，其能被電還原為Mo（Ⅲ），Mo（Ⅲ）則還原溶解氧產生大量的超氧負離子自由基，該自由基進一步與聚魯米諾反應而使發光反應進一步得到促進，這與文獻[21]檢測原理基本相一致。實驗同時也考察其電化學發光行為，觀察圖4B 可知，Nafion-Graphene/（+）AuNPs 修飾電極（曲線a）沒有氧化峰出現，這是由于此時不存在可以產生發光反應的信號物質；而聚合魯米諾之后，此時的修飾電極（曲線b）在-0.70 V 左右對應的ECL 信號為895 a.u.，這可能是在堿性的介質中，聚魯米諾自身作為發光物質能夠進行發光反應；待富集1.0×10-7mol/L 的Mo（Ⅵ）于Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極表面15 min 后，此時修飾電極（曲線c）在-0.70 V 左右時，相對與曲線b，發光信號增大到約2300 a.u.，這是可能因為在堿性環境中，聚魯米諾復合物膜的弱電化學發光信號可以被Mo（Ⅵ）的還原產物Mo（Ⅲ）強烈的、選擇性的增敏。該現象與上述電化學行為一致。因此，本工作建立的基于電聚合魯米諾分子在石墨烯與（+）AuNPs 雙復合納米材料修飾電極表面，并將其應用于Mo（Ⅵ）含量的靈敏型電還原化學發光新方法是可行的。

圖4 不同修飾電極的循環伏安曲線圖（A）與電化學發光信號－電位曲線圖（B）Fig.4 Cyclic voltammograms (A) and ECL signal-potential curves (B) of different modified electrodes

2.4 實驗條件的優化

2.4.1 電化學發光反應介質的選擇 反應介質對Mo（Ⅵ）增敏聚魯米諾弱的電還原化學發光強度及穩定性有較大的影響。為此，實驗分別考察了飽和硼砂溶液等四種反應介質對Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極表面電化學發光分析特性的影響。表1 顯示，在保持其它實驗條件相同的情況下，0.1 mol/L NaHCO3反應介質中所呈現出的電化學發光信噪比（S/N）最小（1.02），而在飽和硼砂緩沖溶液中，Mo（Ⅵ）對修飾電極表面的聚魯米諾的電化學發光反應電化學發光信號最穩、增敏最強且信噪比最大（5.58）。這可能是由于隨著pH 增加，體系的背景信號增大而導致電化學發光信號的信噪比降低。因此，選用飽和硼砂緩沖溶液為反應介質。

表1 反應介質的影響Table 1 Influence of reaction medium

2.4.2 Mo（Ⅵ）的富集時間對修飾電極表面電化學發光增敏的影響 初步研究表明，Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾的復合電極與Mo（Ⅵ）相互作用的時間不同，所產生的電化學發光強度不同。為此，本實驗考察了5～20 min 之間，Mo（Ⅵ）與復合修飾電極作用后的電化學發光強度變化情況。由圖5可知，當二者作用13 min 后，體系的增敏的電化學發光強度達到最大，再延長相互作用時間，增敏的電化學發光信號基本保持不變。這說明Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極對Mo（Ⅵ）有一定的富集作用，且一定濃度的Mo（Ⅵ）可以在13 min 內于修飾電極表面達到富集平衡。因此，實驗選擇Mo（Ⅵ）的最佳富集時間為13 min。

圖5 不同富集時間對修飾電極電化學發光強度的影響Fig.5 Effect of different concentrated time on the enhancing ECL intensity of the modified electrode

2.4.3 掃描速率對修飾電極表面電化學發光信號增敏的影響 在上述優化的實驗條件下，本實驗在不同的掃描速率（40～150 mV/s）下，測定了加入少量Mo（Ⅵ）前后Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極表面的電化學發光強度。圖6 結果表明，在40～100 mV/s 掃描速率范圍內，隨掃描速率的增大，Mo（Ⅵ）對修飾電極表面的聚合魯米諾的電化學發光增敏程度也逐漸增強；當掃描速率超過100 mV/s時，電化學發光強度卻呈現出下降的趨勢。這說明中速的電位掃描速率更有利于Mo（Ⅵ）對該修飾電極表面聚魯米諾電還原發光反應的增敏效應。這可能是由于在過慢或過快的電位掃描速率條件下，電化學反應速率與隨后的化學發光反應速率不匹配所致。故實驗選擇最佳掃描速率為100 mV/s。

圖6 掃描速率對加入Mo（Ⅵ）增敏的電化學發光強度的影響Fig.6 Effect of scanning rate on the enhancing ECL intensity of Mo(Ⅵ)

2.5 Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極測定Mo（Ⅵ）的分析特性

最佳實驗條件下，在5.0×10-9～1.0×10-6mol/L范圍內，修飾電極表面的電化學發光強度隨著Mo（Ⅵ）濃度增大而增大，且Mo（Ⅵ）在該濃度范圍內與增敏的電化學發光強度（ΔIECL）呈線性相關（如表2 所示），其回歸方程為ΔIECL=9.10C+625.86（C 為Mo（Ⅵ）的濃度，nmol/L），相關系數為0.9958。按三倍標準偏差計算檢出限為2.1×10-9mol/L（3σ，n=11）。對濃度為1.0×10-7mol/L 的Mo（Ⅵ）連續測定11 次電化學發光信號，所得RSD=2.4%。該另外，將Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極保存于飽和硼砂溶液中，在4 ℃冰箱中放置2 周后，其電化學發光信號下降低于10%。該方法與文獻報道其它電化學發光分析法檢測Mo（Ⅵ）相比，本研究基于Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 修飾電極所構建的Mo（Ⅵ）的電還原化學發光檢測法，具更高的靈敏度，精密度基本相當。

表2 建議方法與文獻其它電化學發光檢測Mo（Ⅵ）的對比Table 2 Comparison between the proposed assay and other reported ECL methods for the detection of Mo(Ⅵ)

2.6 共存離子的影響

在最優的實驗條件下，按照上述1.2.5 實驗方法，保持相對誤差在5%以內，考察了干擾組分對濃度為1.0×10-7mol/L 的Mo（Ⅵ）測定的影響（如圖7所示）。結果顯示，1000 倍的SO42-、Cl-、Ca2+、K+、Na+、F-、Mg2+，200 倍的草酸與EDTA 對Mo（Ⅵ）的測定不產生干擾；20 倍的Cu2+、Fe3+及Ni2+則有一定干擾。因此，在測定實際樣品中Mo（Ⅵ）的含量時，可以加入適量的EDTA 對樣品中的金屬離子進行掩蔽性消除或通過調節樣品溶液的pH 使其沉淀下來，再進行過濾。

圖7 不同組分在反應體系中的電化學發光響應信號Fig.7 ECL response signals of different components in the reaction system

2.7 樣品測定

按照1.2.5 實驗方法測定樣品中Mo（Ⅵ）含量，每一組樣品平行測定三次。表3 結果表明：黃豆和綠豆種子（各做3 個批次）樣品中Mo（Ⅵ）含量分別為0.86、1.45 μg/g。接著，將所得樣品用已知量的Mo（Ⅵ）標準溶液按照0.5～1.5 倍試樣含量進行加標實驗，測定Mo（Ⅵ）的回收率，加標回收率范圍為91.42%～108.0%，RSD 在2.8%～4.6%之間，則表明此方法可以運用于豆類樣品中Mo（Ⅵ）含量的準確測定。

表3 樣品分析結果（n=3）Table 3 Analysis results of the selected samples (n=3)

3 結論

本文成功制備了Nafion-Graphene/（+）AuNPs/Ployminol 復合修飾電極，研究發現在堿性環境中少量的Mo（Ⅵ）可以極大程度增強電還原發光信號，基于此本文建立了一種檢測Mo（Ⅵ）的電化學發光測定新方法。一方面，由于大多物質在還原條件不與聚魯米諾產生發光反應，因而得到較好的選擇性。另一方面，構造的電化學發光檢測界面中，由于利用了石墨烯與帶正電荷金納米粒子的協同放大作用，再結合上簡單的電聚合技術而將電化學發光信號分子（魯米諾）高效地固定于雙納米復合材料修飾電極表面，使得該方法操作簡單、成本低廉、靈敏度及準確度較高，檢出限低至2.1 nmol/L，加標回收率在91.42%～108.0%范圍內，能為實際樣品中低含量Mo（Ⅵ）的準確檢測提供一定的參考。