黑果枸杞果實中主要成分的傅里葉變換近紅外光譜預測模型構建

周志磊，衡洋洋，陳 超，宋亞玲，庫進良，姬中偉，毛 健,5,*

（1.江南大學糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心，食品學院，江蘇無錫 214122；2.江南大學（紹興）產業技術研究院，浙江紹興 312000；3.江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇無錫 214122；4.北京同仁堂健康藥業（青海）有限公司，青海德令哈 817000；5.國家黃酒工程技術研究中心，浙江省紹興黃酒產業創新服務綜合體，浙江紹興 312000）

黑果枸杞是我國傳統具有補益功能的名貴中藏藥材，是青海省重要的特色農產品，是花青素含量最高的漿果之一，有“花青素之王”的美譽[1]，相應的研究表明，黑果枸杞具有抗氧化、抗疲勞、保護心腦血管、提高免疫力等方面的作用[2-3]。因其具有多種活性和營養成分，越來越受到消費者喜愛，所以對于黑果枸杞方面的研究日益增加。目前，有關黑果枸杞的研究多為開發利用、栽培技術、生理活性成分及保健藥理作用研究[4-5]；果實化學成分研究、有效成分含量測定與分析[6-7]等。上述的研究方式均采取傳統理化方法進行枸杞中相關物質的測定，存在操作時間長、過程繁瑣、污染環境等一系列問題，因此有必要開發一種黑果枸杞中快速、簡便、無損檢測的方法，促進黑果枸杞產業的縱深發展。

傅里葉變換近紅外光譜（Fourier transform near infrared spectroscopy，FT-NIR）分析技術因其快速、準確、便捷、無損的特點而備受人們關注，并且在農產品產地識別和品質定量檢測方面應用廣泛。其是利用有機質在近紅外光譜區的振動吸收從而快速測定樣品中多種化學成分含量的一種新型技術[8]。該方法可簡便、直觀地分析具有較大差異的非同種物質，但是在判別成分相近的食品時卻無能為力，所以常需要結合化學計量學方法進行判別。近紅外光譜技術的成熟與化學計量學方法的豐富使得兩者相結合運用到物質的定性和定量分析成為一種趨勢。目前已有傅里葉近紅外光譜應用于黑果枸杞中的研究報道[9]，該學者建立了干果粉末的花青素、胡蘿卜素和總酸預測模型，性能優異，穩定性好，證明了近紅外光譜技術在黑果枸杞果實的檢測中具有良好的應用潛力。然而，僅建立干果模型無法預測鮮果中主要成分的含量。

本研究通過應用傅里葉變換近紅外設備，對來自不同產地的黑果枸杞干果復水勻漿/鮮果打漿處理，混合干果和鮮果制備樣本集，進行傅里葉近紅外光譜掃描，得到近紅外特征譜圖，結合理化指標結果，對其所含有的總糖、還原糖、總酸、氨態氮、花青素、原花青素、總酚、黃酮和多糖共計9 類指標通過偏最小二乘（partial least squares regression，PLS）、區間偏最小二乘（interval partial least squares regression，iPLS）和聯合區間偏最小二乘（synergy interval partial least squares regression，siPLS）算法建立預測模型，并驗證了模型的預測效果，以期為黑果枸杞檢測技術的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞 北京同仁堂健康藥業（青海）有限公司提供；氫氧化鈉、冰醋酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、鹽酸、無水乙醇、無水乙酸鈉、冰醋酸、丙酮均為分析純，沒食子酸、蘆丁、無水葡萄糖均為色譜純 國藥集團化學試劑有限公司；原花青素（色譜純）合肥博美生物科技有限責任公司；4-二甲氨基肉桂醛（DMAC）（色譜純）上海源葉生物科技有限公司。

UV-1800PC 型紫外-可見光分光光度儀 上海美譜達儀器有限公司；MAX-190 型酶標儀 美國分子儀器公司；Vortex-2 型渦流器 美國科學儀器公司；Antaris MXFT-NIR 型近紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；BS-224S 型分析天平 賽多利斯儀器設備制造有限公司；CF16XR-Ⅱ型離心機 日本日立公司；5B 型自動滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集和制備 由北京同仁堂健康藥業（青海）有限公司提供的從青海、甘肅、新疆、寧夏、內蒙古等不同地區收集的135 份樣本，其中包括45 份干果樣本和90 份鮮果樣本，干果浸泡打漿，鮮果直接打漿處理，以備用于指標測定或傅里葉近紅外光譜采集。

黑果枸杞干果漿液：將黑果枸杞干果，去梗，1:2.5（g/mL）浸泡復水，打漿，5000 r/min 4 ℃條件下離心10 min，收集上清液，即得到料水比為1:2.5 的黑果枸杞干果漿液。

黑果枸杞鮮果漿液：將黑果枸杞鮮果，打漿，5000 r/min 4 ℃條件下離心10 min，收集上清液，即得到鮮果漿液。

1.2.2 黑果枸杞中主要理化指標的測定 總糖與還原糖含量的測定參照中國食品安全農業標準NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的測定 3,5-二硝基水楊酸比色法》；總酸的測定參照中國食品安全國家標準GB 12456-2021《食品中總酸的測定》；氨基態氮采用自動滴定儀測定；花青素含量的測定采用pH 示差法[10]；原花青素含量的測定采用DMAC 比色法[11]：以原花青素為標準品，建立標準曲線：y=0.0462x+0.0001，R2=0.9996；總酚含量的測定采用福林酚比色法[12]：以沒食子酸為標準品，建立標準曲線：y=0.0146x+0.0026，R2=0.9979；總黃酮含量的測定采用蘆丁比色法[13]：以蘆丁為標準品，建立標準曲線：y=29.627x+0.0009，R2=0.9972；多糖測定采用苯酚-硫酸法[14]：以無水葡萄糖為標準品，建立標準曲線：y=13.595x+0.0432，R2=0.9982。

1.2.3 傅里葉變換近紅外光譜采集 采用傅里葉變換近紅外儀進行光譜采集，以鹵鎢燈為光源，InGaAs 探測器，光譜范圍為12000～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為64 次，實驗過程中保持室內溫濕度基本不變[15]。每個樣品采集10 張光譜，取平均值。

1.2.4 光譜預處理 采用11 種不同的預處理方式[16-17]，包括無光譜預處理（no spectrum pretreatment，NSDP）、消除常數偏移量（constant offsets eliminate，COE）、減去一條直線（straight line subtraction，SLS）、矢量歸一化（standard normal variate，SNV）、最小-最大歸一化（min max normalization，MMN）、多元散射校正（multiplicative scatte correction，MSC）、一階導數（first derivative，1st Der）、二階導數（second derivative，2nd Der）、一階導數+減去一條直線（1st Der+SLS）、一階導數+矢量歸一化（1st Der+SNV）、一階導數+多元散射校正（1st Der+MSC），消除光譜的背景噪聲和干擾，確定不同檢測指標的最佳處理方式。

1.2.5 預測模型建立與評估 通過偏最小二乘（partial least squares regression，PLS）、區間偏最小二乘（interval partial least squares regression，iPLS）和聯合區間偏最小二乘（synergy interval partial least squares regression，siPLS）算法建立預測模型，模型的優劣通過交叉驗證相關系數（correlation coefficient of calibration，Rc）、交叉驗證均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、預測集相關系數（correlation coefficient of prediction，RP）、預測集均方根誤差（root mean squared error of prediction，RMSEP）、相對分析誤差（ratio prediction deviation，RPD）評估[18-19]。RPD 用來驗證模型的穩定性和預測能力，當RPD＜1.5 則模型預測性能較低，1.5≤RPD≤2.5 則模型預測性能可滿足快速檢測的需要，RPD＞2.5 則模型具有較高的預測性能。

1.2.6 模型驗證 將40 份獨立樣本代入模型中，得到黑果枸杞中各成分含量的預測值，將樣品實測值與預測值代入SPSS 22 軟件中進行T檢驗，根據T值與P值關系對預測結果進行評價。在T檢驗中若|T|＜T（0.05，39）（由T分布表查表可知，T（0.05，39）=2.02），P＞0.05，說明預測值和實測值沒有顯著性差異，即模型泛化能力好，反之則差異顯著，說明模型不具有泛化能力。

1.3 數據處理

使用OPUS 7.2 進行傅里葉近紅外光譜采集，The Unscrambler X 10.4 進行模型構建與分析，Origin 2022 軟件繪圖，SPSS statistics 22.0 軟件進行T檢驗。

2 結果與分析

2.1 黑果枸杞中主要理化指標

黑果枸杞樣品的9 種主要成分的化學值如表1所示。樣品的各成分總量范圍：總糖130.48～870.05 mg/g，還原糖102.37～481.40 mg/g，總酸1.69～7.82 mg/g，氨態氮2.31～7.38 mg/g，花青素0.70～21.77 mg/g，原花青素0.69～7.83 mg/g，總酚14.85～37.93 mg/g，總黃酮4.05～41.21 mg/g，多糖14.77～43.50 mg/g。使用Kennard-Stone 算法[15]對黑果枸杞樣品集進行劃分，用于校正集的樣品95 個，驗證集40 個。驗證集化學值含量均位于校正集范圍內，說明樣本集劃分合理。

表1 黑果枸杞果實樣品主要成分化學值Table 1 Chemical values of main components of Lycium ruthenicum Murr samples

2.2 原始光譜數據分析

由圖1 可知，不同樣品的光譜譜線區分較為明顯，在10402、8762、6889、5938、5604、5480、5152、4524、4072 cm-1處有特征吸收（如圖1 箭頭所示），吸收峰較窄，根據圖譜反映信息來看，10402 cm-1為水O-H 基團的二級倍頻，同時也為其他化合物含OH 基團的二級倍頻；8696～8000 cm-1為C-H 基團二級倍頻。在放大譜圖后發現，在8197 cm-1存在微弱吸收，可以確定為水O-H 基團合頻吸收（較弱）；7502～5165 cm-1為C=O 基團三級倍頻（相對該區域其他集團而言紅外吸收較弱，且存在重合部分）；6889 cm-1為其他化合物O-H 基團一級倍頻，同時也為水O-H 基團一級倍頻；5938 cm-1為化合物CH 基團一級倍頻；5604～5480 cm-1之間為C=O 基團二級倍頻；5269～4996cm-1之間出現平峰，表明該區域出現飽和吸收，該區域為其他化合物O-H 基團的合頻（5000 cm-1），同時也為水的O-H 基團合頻吸收（水分子O-H 基團在5155 cm-1紅外吸收最強）；4524 cm-1處為N-H 基團的合頻吸收（標準吸收峰應為4600 cm-1，由于受到飽和吸收的影響，譜線出峰位置后移）；圖譜放大后，發現在4416 cm-1處出現吸收峰（吸收較弱），在4072 cm-1處出現強吸收，經過分析后認為，這兩處峰均為C-H 基團的合頻吸收峰（標準吸收位置為4545～4082 cm-1，由于受到飽和吸收的影響，出現后移）。不同黑果枸杞樣品的光譜沒有明顯差異，在12820～3959 cm-1區域范圍內光譜的吸光度之間差異較小，但是并非完全重合，說明采集的黑果枸杞樣本整體保持一致，但不同樣本之間存在一定差異，可以對黑果枸杞樣品建立主要成分含量的預測模型。

圖1 黑果枸杞果實傅里葉近紅外光譜圖Fig.1 FT-NIR spectroscopy of Lycium ruthenicum Murr

2.3 近紅外光譜預處理方式優化

圖1 所示的黑果枸杞原始近紅外光譜混合了無關光譜信息、背景噪聲和干擾，如果直接應用，可能會損害多變量校準模型的性能[20]。因此，采用數據預處理的方法去除噪聲和異常值[21]。為了提高黑果枸杞各指標預測結果的準確性（Rc 與Rp），降低模型RMSEC 值和RMSEP 值，在黑果枸杞全光譜（12000～4000 cm-1）范圍內，進行各個指標光譜預處理方式的篩選，結果如表2 所示。

最佳預處理方式選擇的依據是最低的內部交叉驗證均方根誤差（RMSEC）和預測集均方根誤差（RMSEP）及較高的內部交叉驗證相關系數（Rc）和預測集相關系數（RP），優化的結果如表2 加粗字體所示：總糖采用無光譜預處理（NSDP）的預處理方式，總酸和氨態氮采用一階導數（1st Der）的預處理方式，還原糖、花青素、原花青素、總酚和總黃酮采用減去一條直線（SLS）的預處理方式，多糖采用最小-最大歸一化（MMN）的預處理方式。

2.4 模型建立與評估

2.4.1 偏最小二乘模型 在得到不同樣本最佳光譜預處理方式的基礎上，建立針對黑果枸杞的全光譜（12000～4000 cm-1）PLS 預測模型。結果如表3 所示。表3 顯示了黑果枸杞不同指標全波長PLS 預測模型。由表3 可知，樣本全光譜PLS 預測模型中氨態氮對應的RMSEP 值最低，為0.48，表明建立的PLS 模型對于樣本中氨態氮含量的預測較為準確。總酸、花青素、原花青素、總酚、總黃酮和多糖的RMSEP 值均在0.81～5.72 之間，表明建模效果較好，然而，總糖與還原糖建模效果并不理想，RMSEP 值分別為46.00 和35.00，說明在模型準確度低，總糖全波長PLS 預測模型，Rc 和Rp 分別為0.8862、0.8752小于0.90，表明該模型無論是從準確度方面，還是從預測與真值相關性方面，建模效果差于其他指標。基于PLS 建立的全光譜預測模型，RPD ≤1.5，無法建立一個合適的、穩健的各指標含量與光譜數據之間的定量關系，可能是由于光譜中的一些區域可能包含非模型信息（噪聲），因此應該從模型中排除這部分區域[22]。即，需要開發一個光譜區域選擇的校準模型。

表3 黑果枸杞果實中主要成分的全光譜偏最小二乘預測模型Table 3 Full spectra PLS prediction model of main components in Lycium ruthenicum Murr

2.4.2 區間偏最小二乘模型 根據表4 可知，除了總糖和還原糖iPLS 預測模型外的大部分指標，在5～25 個區間內有較低的RMESP 值，iPLS 模型中RMSEP 值隨著光譜區間細分而減小，可能是樣本中水的存在導致了近紅外光譜中出現過飽和吸收峰，產生基線漂移的同時也掩蔽了部分基團的紅外吸收，從而使得有效信息在波段較寬時較少被提取到[23]；而當波段較窄時，水的過飽和吸收對于實驗結果的干擾降低，部分基團有效信息得以被更多提取，從而使模型預測準確度提高。

表4 黑果枸杞果實中主要成分的區間偏最小二乘預測模型Table 4 iPLS prediction model of main components in Lycium ruthenicum Murr

在進行光譜區間劃分時，光譜區間較寬，能較為完全地提取到所需要的特征基團光譜，有利于建模，但是較寬的波段容易使得光譜噪聲與提取到的無效信息增多，對模型實驗結果造成干擾[24]，如黑果枸杞中總黃酮的iPLS 模型印證了這一觀點。光譜選擇區間較窄，雖然屏蔽掉部分光譜噪聲和無效信息對實驗結果的影響，但是光譜提取到的有效信息，如特征基團等的信息量較少，使得模型結果不準確。因此，選擇合適的區間進行建模，有利于提高模型的準確性和穩定性，提高模型可信度，黑果枸杞樣本中的花青素、原花青素以及總酚iPLS 預測模型等均印證了這一觀點。

2.4.3 聯合區間偏最小二乘模型 由表5 可知，除了總糖多糖指標以外，黑果枸杞鮮果樣本大部分指標的siPLS 預測模型RMSEP 值表現出與先減小后增大的趨勢。黑果枸杞總糖指標的siPLS 預測模型在區間間隔數為5 時，RMSEP 值為14.10，而當區間間隔數為50 時，為4.33，黑果枸杞多糖指標的siPLS預測模型在區間間隔為5 時，RMSEP 值為2.64，在區間間隔為50 時，RMSEP 值為1.47。由此可見，區間間隔數的增加大幅度提高了樣本總糖和多糖的預測效果，這是因為隨著區間間隔的增加，從光譜中提取的有效信息數量增加，同時噪聲與其他無效信息減少，提高了模型預測精確度[25]。隨著光譜區間的繼續劃分，雖然部分有效信息被過濾，導致可提取的信息量減少，但是由于屏蔽了大多數噪聲的影響，因而與較小區間間隔相比，間隔數目較高指標的siPLS 預測模型RMSEP 值更低，準確度更高。對于黑果枸杞其他指標，光譜區間數的增加均使得模型預測準確度得到顯著提高，并且最佳光譜區間間隔數目為10～25。造成這一結果的原因主要是由于增加的光譜區間間隔有效減少了水分的紅外吸收對于實驗結果的影響，同時使有效信息增多，無關信息減少，大幅度提高了黑果枸杞樣本siPLS 模型的預測效果。

表5 黑果枸杞果實中主要成分的聯合區間偏最小二乘預測模型Table 5 siPLS prediction model of main components in Lycium ruthenicum Murr

2.4.4 模型比較 比較PLS、iPLS 和siPLS 模型的結果（表3～表5），siPLS 模型顯示出更好的預測能力。實驗結果表明：PLS 模型采用全光譜區域的所有變量來校正模型時，其中有許多變量是噪聲光譜信息和非信息變量，這些變量不可避免地削弱了模型的性能；iPLS 模型可以通過選擇確定的光譜區間來降低噪聲，但在校正模型時只選擇了一個區間，可能會放棄一些有用的變量。由于在進行選擇時沒有考慮其它的相關信息，模型的整體性能不可避免的受到削弱。與iPLS 相比，siPLS 具有無可比擬的優勢，siPLS不僅具有與iPLS 相同的優點，而且克服了iPLS 的缺點，將兩個或三個區間結合起來，通過減少總變量（去除噪聲譜信息）和更好的預測能力（不丟失信息）獲得更好的模型。因此選擇siPLS 算法建立黑果枸杞中主要成分的定量檢測模型。

2.5 模型驗證

為了驗證模型的可靠性和泛化能力，選取了40 份未用于模型建立的樣品，樣品含量的真實值采用1.2.2 的方法測定，預測值根據FT-NIR 掃描的譜圖，采用預測模型輸出結果。采用配對樣本T檢驗對黑果枸杞的真實值和預測值進行驗證。由表6 可知，|T|＜T（0.05，39）（由T分布表查表可知，T（0.05，39）=2.02），P＞0.05，差異無統計學意義，說明預測值與實測值基本一致，也表明通過近紅外光譜法建立的預測模型能很好地預測黑果枸杞未知樣本中總糖、還原糖、總酸、氨態氮、花青素、原花青素、總酚、總黃酮和多糖的含量。

表6 黑果枸杞果實樣本主要成分的實測值與預測值T 檢驗結果Table 6 T-test results of measured and predicted values of main components in Lycium ruthenicum Murr samples

3 結論

本研究采用不同的預處理和回歸方法組合，建立黑果枸杞中主要成分的定量檢測模型。對于不同指標對應的siPLS 模型，在優化后的波段范圍內均具有較為準確的預測結果，驗證集樣本實測值與預測值無顯著性差異，相對分析誤差均大于2.5，模型定標效果良好，重現性較好，建立的定標模型可以用于實際檢測，黑果枸杞干果和鮮果均適用，模型應用范圍廣。與傳統的實驗室分析方法相比，該方法具有操作簡單、成本低、速度快、污染小、無損、在線分析方便等優點。上述結果表明，傅里葉變換近紅外光譜與化學計量學相結合是一種簡單、快速、可靠的進行黑果枸杞中總糖、還原糖、總酸、氨態氮、花青素、原花青素、總酚、總黃酮和多糖含量預測的方法。