MALDI-TOF MS 法快速鑒定散裝即食食品中3 種食源性致病菌

崔 潔，林吉恒，孫 瑛，嚴卓彥，夏瑛瑛，黃朱梁

（舟山市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江舟山 316000）

散裝即食食品是提供給消費者可以直接食用的非預包裝食品（含預先包裝但需要計量稱重的散裝即食食品），主要包括熱處理散裝即食食品、部分或未經熱處理的散裝即食食品和其他散裝即食食品三大類[1]。近年來，隨著外賣、社區團購的興起，食品生產加工模式與銷售方式發生改變的同時，人們的膳食行為與飲食習慣也在悄然改變。超市和菜場里隨處可見的盒裝預制菜等散裝即食食品都已經過烹煮、燙熱，無需再對其進行額外加工處理即可食用，既省去了繁瑣的包裝，售賣方便，食用也更加便捷，備受生產者與消費者的推崇[2]。但是與預包裝食品不同的是，這類散裝即食食品并沒有經過嚴格的出廠檢驗，衛生安全條件難以保證，在制作和銷售過程中，加工人員與食品的接觸、器具的混用等因素很容易導致微生物的二次污染，更增加了食源性疾病的潛在風險[3-6]。通常，在一些散裝熟肉制品和涼拌菜中較易檢出沙門氏菌，感染后輕則嘔吐腹瀉，重則引起急性腸胃炎、敗血癥等疾病[7-9]；另外散裝豆制品、生鮮沙拉等也常被金黃色葡萄球菌污染，其產生的腸毒素不易被高溫破壞，通過食物入侵人體后易引起急性腸胃炎[10-12]；尤其像壽司、飯團、炒飯等散裝米飯制品則是蠟樣芽孢桿菌感染的重災區，多在夏秋季高發，其所分泌的腹瀉毒素或嘔吐毒素污染食物而被人誤食后，輕則嘔吐腹瀉，重則可導致死亡[13-15]。因此，建立散裝即食食品中多種食源性致病菌的快速有效的檢測方法極為重要。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技術是近幾年發展起來的一種新型軟電離質譜鑒定手段[16-18]。它的工作原理是將菌體蛋白打碎成一些特異性的碎片，通過質荷比的采集可獲取致病菌特異性肽蛋白指紋圖譜，將其與數據庫中的標準圖譜進行比對后，便可鑒定到屬、種甚至亞種水平[19-22]。MALDI-TOF MS作為一種基于蛋白質檢測的微生物快速鑒定手段發展迅速，它的主要優勢在于：a.操作便捷，對操作人員要求不高，只需簡單的幾步操作便可實現對微生物的復雜鑒定；b.鑒定快速，點樣靶板上機后通常只需數十分鐘便可得到鑒定結果；c.準確高效，相較于傳統生化鑒定法準確率更高[23-26]。近年來，隨著MALDITOF MS 技術的快速發展，國內外很多學者都針對各種食品基質中的食源性致病菌展開了適用性研究，如史方等[27]針對即食食品中大腸埃希氏菌O157:H7建立了致病菌快速檢測管技術聯合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法，靈敏度可達51 CFU/mL；李濱洲等[28]將MALDI-TOF MS 運用于生鮮豬肉檢驗過程中大腸桿菌與沙門氏菌的分離鑒定，共檢出6 種在HE 和EMB 培養基上與沙門氏菌/大腸桿菌菌落特征類似的腸桿菌科其他細菌；趙宏等[29]建立了免疫富集聯合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法檢測牛奶、雞蛋中沙門氏菌的方法，將濃度為3 CFU/mL 的沙門氏菌特異性富集后選擇性增菌9 h即可被MALDI-TOF MS 準確鑒定；周千渝等[30]利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜快速檢測并鑒定從生鮮蔬菜中分離到的5 種致病菌且靈敏度為106CFU/mL。在我國，將MALDI-TOF MS 技術運用于食品安全領域的研究雖尚處于初步探索階段，但針對多種食源性致病菌的檢測研究也已有不少，然而大多數均是針對預包裝食品或是初級農產品，預包裝食品感染致病菌的風險較低，生鮮豬肉等初級農產品并非即食食品，必須經過高溫烹煮后食用，因此也不易感染致病菌，而對于潛伏在我們身邊的那些并沒有經過食品出廠檢驗、衛生安全條件難以保證且食源性潛在風險極大的散裝即食食品卻鮮有研究。

針對常見食源性致病菌的檢測，傳統的國標法涉及到前增菌、選擇性增菌、生化試驗和血清分型鑒定等多個步驟，通常需要4～6 d，檢測周期冗長且操作復雜繁瑣，已無法滿足日常檢測和暴發檢測的需求[31-33]。近年來，散裝即食食品的大量涌現、食源性疾病的日益多發和人們食品安全意識的不斷增強，都對致病菌檢測方法的快速、靈敏、特異等方面提出了更高的要求。2022 年3 月7 日，GB 31607-2021《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》正式實施，本文及時地將基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術應用于散裝即食食品的快速檢測研究中，以沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌為模式菌，通過對點樣方式、前處理方式、不同培養基及培養時間等各項實驗條件的優化篩選確定最佳方法，并考察其檢測限和穩定性，最后進行批量食品樣本檢測來探尋MALDI-TOF MS 技術在散裝即食食品中的適用性，以期為食源性致病菌的快速篩查與食品質量安全的有效保障提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

緩沖蛋白胨水（BPW）、亞希酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）基礎、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、Baird-Parker 培養基基礎、BHI 肉湯、營養瓊脂（NA）、平板計數瓊脂（PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯基礎、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎（MYP）北京陸橋技術股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂 法國科瑪嘉公司；三氟乙酸（TFA）、無水乙醇、甲酸、乙腈、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）美國Sigma 公司；Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒、瓊脂糖、4S GelRed 核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；Multiplex PCR Assay Kit 試劑盒、DL1000 DNA Marker（100～1000 bp）、6×Loading Buffer 寶生物工程（大連）有限公司；標準菌株 保藏于舟山市食品藥品檢驗檢測研究院內，詳見表1。

VITEK MS 全自動快速微生物質譜系統、VITEK 2 ComPact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統 法國生物梅里埃公司；NanoDrop one 核酸蛋白分析儀、Legend Micro17 型高速臺式離心機 美國Thermo Fisher Scientific 公司；My Cycler 型PCR 擴增儀、Mini-PROTEAN Tetra 型垂直電泳儀、Gel Doc XR 型凝膠成像系統 美國BIO-RAD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養與純化 將表1 中所列菌株均接種于BHI 肉湯中增殖培養，其中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌于36 ℃培養18 h，蠟樣芽孢桿菌則于30 ℃培養48 h，再劃線接種于NA 瓊脂平板，36 ℃培養24 h[34-36]，平板上純化菌落用于后續MALDI-TOF MS和生化鑒定。

1.2.2 MALDI-TOF MS 檢測

1.2.2.1 點樣方式的優化 是否能獲得重復性好且穩定的微生物特征性質譜圖，取決于微生物樣品與基質液是否形成共結晶，共結晶越均勻則重復性越好[29]，因此點樣方式的優化也十分關鍵。以金黃色葡萄球菌為模式菌考察以下不同點樣方式及點樣比例對質譜結果的影響。每種點樣方法及比例重復點樣4 次，分析鑒定結果的一致性。

a.覆蓋法：移取經最優方法前處理后的上清液至靶板，待自然干燥后覆蓋CHCA 基質液，室溫干燥后上機檢測，上清液及基質液的點樣量分別為1 μL+1 μL、0.5 μL+1 μL、1 μL+0.5 μL。

b.夾心法：先取0.5 μL 基質液點樣，室溫干燥后覆以1 μL 樣液，自然晾干后再覆蓋0.5 μL 基質液。

c.混合干滴法：在點樣前先將樣液與基質液等比例混合，再取1 μL 混合液進行點樣，待自然干燥后上機檢測。

1.2.2.2 不同前處理方式的選擇 樣品前處理效果的優劣直接影響質譜圖譜的采集質量，進而會對后續菌種鑒定的結果帶來直接影響，不同的前處理方法對不同致病菌蛋白質的提取及純化效果存在差異[37-38]。通過參考諸多文獻[39-43]，針對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌三種致病菌，本實驗分別采用最具代表性的三種前處理方式，分別是直涂法、改良法和甲酸乙腈法來對菌體進行破壁前處理，每種處理方式重復點樣4 次，考察不同前處理方式對鑒定結果的影響。

a.直涂法：用接種環從營養瓊脂平板上挑取單菌落均勻涂抹在靶板孔位中，并覆蓋1 μL 基質液，待自然干燥后上機檢測。

b.改良法：同直涂法取單菌落均勻涂板后，滴加1 μL 的70%甲酸，待室溫晾干后覆以1 μL 基質液，再次晾干后上機檢測。

c.甲酸乙腈法：從營養瓊脂平板上挑取5～10 mg單菌落樣本，在300 μL 滅菌超純水中渦旋混勻1 min；再加入900 μL 無水乙醇，混勻后12000 r/min 離心2 min 棄上清，重復一次直至完全除去乙醇溶液；加入50 μL 70%的甲酸溶液破壁10 min；再加入50 μL乙腈吹打混勻，12000 r/min 離心2 min 后吸出上清；取1 μL 上清液至靶板晾干，并加1 μL 基質液涂覆，室溫干燥后上機檢測。

1.2.2.3 不同培養基及培養時間的優化 以革蘭氏陰性菌沙門氏菌CMCC50041 和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC26112 標準菌株為模式菌，考察不同培養基及培養時間對質譜鑒定結果的影響。將沙門氏菌分別接種于TSA、NA、BS、XLD、HE 五種培養基，36 ℃培養24 h，金黃色葡萄球菌則接種于PCA、NA、TSA 三種非選擇性培養基上，分別在36 ℃培養24、48、72 h 后，以最優前處理方式提取蛋白后采用最佳點樣方式進行點樣，并上機檢測。每個處理平行點樣8 次，考察鑒定結果的一致性。

1.2.2.4 檢測限試驗 將過夜培養的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的純菌液分別用超純水10 倍遞增稀釋至10-8濃度，同時傾注營養瓊脂進行菌落計數，每個稀釋度的菌液各取1 mL，12000 r/min離心2 min 后棄上清，采用最優前處理方式沉淀菌體并點樣分析，每個稀釋度重復處理三次，通過分析各個致病菌不同稀釋度的鑒定結果以測試其檢測限。

1.2.2.5 穩定性試驗 將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌分別在36 ℃培養24 h 條件下進行傳代三次，每次傳代后各自挑取三個菌落平行樣上機檢測，通過對比三種目標菌同一批次及不同批次的鑒定結果，以評價MALDI-TOF MS 檢測的穩定性。

1.2.2.6 不同來源的金黃色葡萄球菌的鑒定分析不同來源的致病菌可能存在一定地域及宿主差異，在其蛋白組成和表現形式上也可能截然不同，本實驗以金黃色葡萄球菌為模式菌，通過從餐飲中毒樣本、食品檢測樣本、能力驗證樣本中分離出的五株金黃色葡萄球菌以及一株標準菌株進行MALDI-TOF MS 鑒定，分析對比圖譜峰型，比較不同來源的金黃色葡萄球菌在蛋白表現上的差異以及MALDI-TOF MS 鑒定的準確度及可靠性。

1.2.3 多重PCR 檢測比對

1.2.3.1 模板DNA 提取 取1 mL 過夜培養的菌液加入1.5 mL 離心管中，12000 r/min 離心5 min，棄上清；加入1 mL PBS 緩沖液，12000 r/min 離心5 min后，棄上清；再加入150 μL 雙蒸水，振蕩混勻；100 ℃煮沸10 min 后12000 r/min 離心10 min，并將上清液轉移至新的離心管中，-20 ℃保存備用。

1.2.3.2 多重PCR 擴增 將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的DNA 模板等體積混合后進行多重PCR 反應，反應體系與反應程序分別見表2 和表3。

表3 單重PCR 反應程序Table 3 Single PCR reaction procedure

1.2.3.3 多重PCR 產物電泳檢測 將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌三種致病菌隨機進行兩兩組合，采用優化過的多重PCR 反應體系進行PCR 擴增，并對擴增產物進行電泳，用凝膠成像儀分析電泳結果。

1.2.4 生化鑒定比對

由于個體的差異性，不同人群可能對藥物的敏感性不同，本例的重點是應用本研究提出的亞組識別的方法，判斷患者所適用的藥物。

1.2.4.1 國標法生化鑒定 挑取1.2.1 中純培養的金黃色葡萄球菌單菌落接種至5 mL BHI，36 ℃培養24 h 后進行血漿凝固酶試驗，每瓶凍干血漿中加入0.5 mL 無菌生理鹽水至完全溶解后，加入0.3 mL BHI 培養物，振蕩搖勻，置于36 ℃培養，每半小時觀察一次，觀察6 h；挑取1.2.1 中純培養的蠟樣芽孢桿菌單菌落進行過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P 試驗等生化試驗，并觀察結果。

1.2.4.2 VITEK 2 生化鑒定 挑取1.2.1 中純培養的沙門氏菌單菌落制成0.5 麥氏濁度的菌懸液，用GN 鑒定卡片進行上機檢測。

1.2.5 食品樣品的致病菌檢測 在本地不同超市、門市店和農貿市場隨機購買散裝即食食品樣本100 份，每份樣品均無菌采樣500 g，2 h 內帶回實驗室檢測，其中醬鹵肉30 份，豆制品15 份，米飯制品20 份，涼拌菜20 份，生鮮沙拉15 份，分別無菌取樣25 g 并添加225 mL 增菌液，充分均質混勻后，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌放入36 ℃培養箱增菌18 h，蠟樣芽孢桿菌則于30 ℃培養48 h。

按照GB 4789.4-2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》、GB 4789.10-2016《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》、GB 4789.14-2014《食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》對樣品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌進行分離培養，當各自的選擇性培養基上出現可疑菌落時，對目標菌進行純化分離后利用MALDI-TOF MS 法上機檢測。

1.3 數據處理

為確保檢測結果的可靠性，每次試驗前需選取標準菌株大腸埃希氏菌ATCC8739 作為質控菌株進行校準，并設置儀器參數為：線性正離子模式，收集質荷比范圍（m/z）：2000～20000 u，激光頻率48 Hz，每孔采樣率100 次，加速電壓20.00 kV。在檢測器中放入已點樣靶板，打開LaunchPad 軟件，選擇RuO Mode 進行待測樣本的質譜分析，將采集的樣本質譜圖導入到SARAMIS 數據庫中，根據每個特征峰的離子質量及相對強度與標準數據庫中的超級圖譜和參考圖譜進行比對分析，軟件根據不同特征峰所分配權重的不同進行計算并給出相應的鑒定分值，可信度結果以百分數表示，并根據可信度不同標識為不同顏色，具體鑒定結果判定見表4。

表4 鑒定結果判讀Table 4 Interpretation of identification results

2 結果與分析

2.1 MALDI-TOF MS 檢測

2.1.1 最佳點樣方式的選擇 以不同點樣方式及比例進行點樣的金黃色葡萄球菌所得圖譜見圖1。其中三種覆蓋法點樣平均鑒定得分均為99.9%，夾心法與混合干滴法平均鑒定得分均小于95%，平均峰數目分別為303、321，雖峰數較多，但多為雜峰，且基線噪音較大、峰強度較低，而三種覆蓋法點樣所獲得的平均峰數目分別為312、301、264，基線平滑，信噪比較高，當樣液與基質液以1 μL+1 μL 點樣時，峰數目更多，特征峰更復雜且強度更高，因此后續試驗最終選擇覆蓋法1 μL+1 μL 進行點樣。

圖1 不同點樣方式及比例得到的金黃色葡萄球菌質譜圖Fig.1 Spectra of Staphylococcus aureus by different sample deposition method and sample/matrix proportion

2.1.2 不同前處理方式對鑒定結果的影響 經甲酸乙腈法處理過的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的平均鑒定得分均在98%以上，經改良法處理過的三種致病菌的平均鑒定得分分別為92.1%、98.3%、89.3%，而使用直涂法直接上機鑒定的三種致病菌的平均得分分別為84%、98%、87.3%。

雖都得到較準確鑒定，但是由圖2 可知，同一種致病菌的三種處理方式下的各峰強度仍稍有差異，金黃色葡萄球菌經甲酸乙腈處理后整體出峰點更多，離子峰更密集，峰強度更高，在質荷比約為4813、6888、9633、3446 m/z 處顯現多個高強度特征峰。

圖2 不同前處理方式得到的金黃色葡萄球菌質譜圖Fig.2 Spectra of Staphylococcus aureus after different pre-treatment

由圖3 可知，沙門氏菌經改良法和直涂法處理后特征峰數量相較于甲酸乙腈法有所減少，特別是在質荷比約3050、3021 m/z 處峰強度極低，出峰不理想，特別是直涂法，不僅背景噪音大，而且出現多峰合并和雜峰干擾的情況，而甲酸乙腈法的圖譜中圖形更加復雜，離子峰也更加密集陡峭。

圖3 不同前處理方式得到的沙門氏菌質譜圖Fig.3 Spectra of Salmonella after different pre-treatment

而在圖4 中，三種不同前處理方式的區別在蠟樣芽孢桿菌的圖譜中可以觀察得更直觀，改良法與直涂法由于菌體處理不干凈導致背景噪音大、曲線漂浮嚴重、基線穩定性差，雖然看似出峰較多，但是多為雜峰，且出現多峰合并現象，峰型很不理想，而甲酸乙腈法則背景干凈、基線十分平滑，平均峰數目為304，在質荷比5395 m/z 處出現最強離子峰，不僅質譜峰數量多、圖形光滑，且出峰點清晰、峰型平穩、沒有雜峰干擾和多峰合并現象。

圖4 不同前處理方式得到的蠟樣芽孢桿菌質譜圖Fig.4 Spectra of Bacillus cereus after different pre-treatment

由試驗結果可知，甲酸提取法相較于其他兩種方法可獲得更多的峰數量和更高的峰強度，不僅信噪比高，且與數據庫中的圖譜匹配度更高，因此后續試驗決定使用準確性和置信度更高的甲酸乙腈法對菌體進行前處理。

2.1.3 不同培養基及培養時間對鑒定結果的影響由表5 和圖5 可知，沙門氏菌在NA 和TSA 這兩種非選擇性培養基上可得到大于99%的平均鑒定得分，且變異系數均小于1%，出峰量多且峰型陡峭，最強離子峰相似，均在質荷比約5369、2086、6257 m/z等處出現多個高強度特征峰；而在BS、XLD、HE 這三種選擇性培養基上雖也得到準確鑒定，但是平均得分相較于前者較低且變異系數更高。尤其是BS 和HE 培養基，多數離子峰出峰保守，峰型較緩，且出現雜峰干擾現象。總體而言，非選擇性培養基可為目標菌的復壯提供更全面的營養，因而相較于選擇性培養基可獲得置信度更高的鑒定得分。

圖5 NA 與TSA 培養基上的沙門氏菌質譜圖Fig.5 Spectra of Salmonella on NA and TSA media

表5 沙門氏菌經不同培養基培養后的鑒定得分（%）Table 5 Identification scores of Salmonella on different media (%)

由表6 和圖6 可知，將金黃色葡萄球菌接種于NA 和TSA 培養基并于36 ℃培養24 h 后，均可得到完美鑒定，平均得分均為99.9%，兩者特征峰出峰量相似，峰型陡峭且最強離子峰位置并無明顯差異，約在質荷比2305、4814、6890、9634 m/z 顯現多個高強度特征峰，而用PCA 并以相同時間培養的目標菌質譜圖上平均峰數目有所減少，峰型平緩且峰強度普遍較低，可見相比于PCA，使用NA 和TSA 培養基可獲得置信度更高的鑒定結果。

表6 金黃色葡萄球菌經不同培養條件培養后的鑒定得分（%）Table 6 Identification scores of Staphylococcus aureus in different cultivation conditions (%)

隨著培養時間的延長，質譜圖的匹配性逐漸降低，目標菌在培養48 h 和72 h 后，不論是哪一種培養基，平均得分均有所下滑，特別是PCA 在72 h 后平均得分降至84.15%，變異系數達到了8.78%，不僅基線噪音大、出現多峰合并，且在若干個離子峰處出現峰型偏移，整體峰型不理想。

過長的培養時間可使細菌進入穩定期和衰亡期，穩定期時的菌體會產生大量的代謝產物，而衰亡期時菌體則易發生自溶現象，細菌合成的蛋白很可能與對數期合成的蛋白不同，導致部分特征峰的缺失[44]，因而當菌株培養時間過長時，圖譜的匹配率降低，鑒定結果的準確性也隨之下降，經分析，選擇NA 培養基培養24 h 作為后續試驗菌株的培養條件。

2.1.4 檢測限試驗結果 根據平板計數的結果，再乘以稀釋倍數可算出沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌初始菌液濃度分別為4×108、2×108、3×107CFU/mL，由表7 試驗結果可知，當沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌菌液濃度分別處于4×108～4×105、2×108～2×105、3×107～3×105CFU/mL時，鑒定結果較準確，而當菌液濃度降至105CFU/mL 以下時，無法得到鑒定結果，雖然通過觀察圖7和圖8 可知，當目標菌在104～102CFU/mL 菌濃度時，依然有多個出峰點，如沙門氏菌在質荷比約2093、2426 m/z 等處出現離子峰，而蠟樣芽孢桿菌在菌液濃度稀釋至106CFU/mL 時最強離子峰5395 m/z 消失，而降至低濃度102CFU/mL 時仍在質荷比約2092、2425 m/z 等處峰型顯現，分析原因可能有兩種，一是確實仍有少量菌體蛋白檢出，二是在前處理步驟挑取菌落時，可能刮取到些許培養基，而培養基中多含有蛋白質或多糖等其他物質，因此可能會顯現少量離子峰，但是總體蛋白量太少無法準確匹配數據庫，置信度極低，因此確定三種目標菌的檢測限分別為4×105、2×105、3×105CFU/mL。

圖8 蠟樣芽孢桿菌靈敏度Fig.8 Sensitivity of Bacillus cereus

表7 檢測限試驗結果Table 7 Results of the detection limit

2.1.5 穩定性試驗結果 由表8 試驗結果可知，同一批次的三個菌落平行樣之間鑒定結果異常接近，且不同傳代次數的鑒定結果也高度一致，得分均大于95%，變異系數均小于2%，尤其是金黃色葡萄球菌，不論是同一批次或是不同批次鑒定得分完全一致，均為99.9%，且圖譜之間相似度極高。因篇幅所限，以沙門氏菌為例，圖9 只列出了同一批次沙門氏菌的不同傳代次數的六張質譜圖，由圖譜可見，六者出峰量相似，均在質荷比2420、5369、7266、9251 m/z 處離子峰強度增強，其余質荷比處線型平滑，無雜峰干擾，與數據庫圖譜匹配性較高，可見該方法具有良好的重復性和穩定性。

圖9 同一批次沙門氏菌的不同傳代次數的質譜圖Fig.9 Spectra of different passages of Salmonella from the same batch

表8 穩定性試驗結果Table 8 Results of the detection stability

2.1.6 對不同來源的金黃色葡萄球菌的鑒定與分析結果 按照最佳前處理方式對六株不同來源的金黃色葡萄球菌進行MALDI-TOF MS 檢測，獲得六株菌株的質譜鑒定結果和不同蛋白指紋圖譜，詳見圖10。

圖10 不同來源的金黃色葡萄球菌鑒定結果Fig.10 Results of identification of Staphylococcus aureus from different sources

除了W170130 鑒定得分為86%外，其余鑒定得分均為99.9%，通過分析對比不同離子峰型及原始數據，得出六株目標菌主要的離子峰集中在質荷比2312、3446、4813、6888、9633 m/z 附近，可能是金黃色葡萄球菌的特異性生物標志峰。其中B089 和W152001 整體峰型與ATCC26112 較相似，出峰點清晰，峰型陡峭且密集，均在4814、6889 m/z 處出現兩波最強離子峰，而R160747 和W170130 則峰型保守，峰數目較少且峰強度偏低，尤其是W170130 整體峰型偏緩，各個離子峰之間強度差異不顯著，或許是某些蛋白未完全溶出導致特征峰缺失而影響最終鑒定得分較低，而在R140715 中雖然多個高強度特征峰與ATCC26112 相似，出峰點清晰且豐度較高，但是在質荷比4814、6890、9636 m/z 等處出現多個特征峰的明顯左移。

2.2 多重PCR 比對結果

將三種致病菌隨機兩兩組合，采用優化過的多重PCR 反應體系進行PCR 擴增，由圖11 可知，多重PCR 反應均能特異性地擴增出目的片段，擴增片段大小分別為沙門氏菌273 bp、金黃色葡萄球菌164 bp、蠟樣芽孢桿菌139 bp，擴增產物與預期片段大小一致，表明多重PCR 法可用于同時檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌三種致病菌中的一種或幾種。

圖11 多重PCR 反應特異性Fig.11 Specificity of multiplex PCR reaction

2.3 生化鑒定比對

2.3.1 國標法生化鑒定結果 金黃色葡萄球菌試驗株血漿凝固酶0.5 h 后呈現凝固，即判定為陽性；蠟樣芽孢桿菌試驗株過氧化氫酶、硝酸鹽還原、酪蛋白分解、溶菌酶耐性、卵黃反應、V-P 試驗均為陽性，有動力，在TSSB 平板上為不透明、似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環的淺灰色菌落，而在NA 平板上呈粗糙山谷狀生長形態。

2.3.2 VITEK 2 生化鑒定結果 GN 鑒定卡可對革蘭氏陰性菌的64 項生化指標進行鑒定，沙門氏菌試驗株鑒定結果為98%概率為Salmonella group，主要生化試驗結果見表9。

表9 沙門氏菌生化試驗Table 9 Biochemical test for Salmonella

2.4 食品樣本的檢測結果

從100 份散裝即食食品樣本中共分離得到24 株目標菌，其中沙門氏菌4 株，金黃色葡萄球菌14 株，蠟樣芽孢桿菌6 株，在五大類食品樣本中，醬鹵肉等食品均存在至少被一種致病菌污染的情況，沙門氏菌檢出率最低，主要存在于涼拌菜和醬鹵肉制品中，熟肉制品由于營養豐富，更適合沙門氏菌的生長繁殖；金黃色葡萄球菌檢出率最高，涼拌菜、壽司、生鮮沙拉等食品樣本均受到金黃色葡萄球菌不同程度的污染，其中在壽司食品樣本中污染量最高，為1600 CFU/g，超出GB 31607《散裝即食食品中致病菌限量》規定的限量值（≤1000 CFU/g）。據文獻報道[45]，當食品中該菌的含量低于103CFU/g 時一般不產生腸毒素，而當其含量高于103CFU/g 時，因其菌體大量生長繁殖，會產生腸毒素，100 ℃加熱30 min 不被破壞。成人僅食用100 ng 腸毒素即可引起食物中毒，建議盡量少食涼拌菜、壽司、生鮮沙拉等生食、半生食食品。

蠟樣芽孢桿菌主要于壽司等米面制品中檢出，因散裝米面制品在售賣時常常暴露于空氣中，人員密集加上環境濕潤，成了蠟樣芽孢桿菌污染的重災區，本次檢測結果顯示共有6 份壽司樣本檢出蠟樣芽孢桿菌，其中最高污染量為280 CFU/g，雖未達到國標中規定的最大限量10000 CFU/g[1]，但是也有可能帶來食物中毒的風險，出現嘔吐、腹瀉等癥狀[6,46]。綜上所述，在五大類散裝即食食品中均有致病菌檢出，具體目標菌檢出情況見表10。

表10 目標菌檢出情況Table 10 Detection of target bacteria

從不同散裝即食食品樣本中分離到的三種致病菌的質譜圖見圖12～圖14。沙門氏菌樣品分離株與標準菌株不同，其在質荷比6094 m/z 附近出現兩波最強離子峰，其余出峰點強度較低，峰型偏緩，基線輕微漂浮，信噪比偏低，與標準菌株均在質荷比2098、4761、7266、9528 m/z 附近顯現主要離子峰；蠟樣芽孢桿菌樣品分離株整體出峰量較少且強度偏低，質荷比主要在4810、5395 m/z 兩處相應的峰強度增強，與標準菌株相比峰數目相似，整體出峰保守，峰型極緩，且均在質荷比5395 m/z 處出現最強離子峰；金黃色葡萄球菌分離株與標準菌株特征峰出峰量相似度極高，峰型陡峭且離子峰高度密集，兩者均在質荷比2312、3447、4813、6890、9636 m/z 等多處顯現高強度特征峰，從對比圖可見，或由于金黃色葡萄球菌肽段種類多且復雜程度高，特征峰數目多且強度較高，因此相較于沙門氏菌與蠟樣芽孢桿菌，質譜鑒定得分普遍較高。通過三株樣品中的分離目標菌的質譜圖與相關標準菌株的質譜圖進行對比可見，雖然不同的特征峰強度稍顯差異，但是整體峰型走勢相似度極高，且各特征峰的離子質量均在誤差范圍之內。

圖12 沙門氏菌質譜圖Fig.12 Spectra of different Salmonella

圖13 金黃色葡萄球菌質譜圖Fig.13 Spectra of different Staphylococcus aureus

圖14 蠟樣芽孢桿菌質譜圖Fig.14 Spectra of different Bacillus cereus

3 討論與結論

傳統檢測方法不僅操作繁瑣、費時費力，對食物中毒的信息診斷滯后，而且在平板菌落的挑取過程中，若相關檢測人員缺乏經驗或并未熟悉各種致病菌的菌落形態和生化特性的話，很容易出現肉眼判斷誤差，造成錯判漏檢，已難以滿足食源性疾病時效性與準確性的要求，特別是在大批量的食品樣本檢測過程中，這種缺點體現地更加明顯。比如在用國標法對某些致病菌進行檢測時或需要6～7 d 才能觀察結果，因為它依賴于致病菌繁殖到可見菌落的能力；此外當細菌進入活的不可培養狀態（Viable but nonculturable state，VBNC）時，其無法正常在培養基上生長而形成肉眼可見的菌落而導致無法從污染樣品中分離到致病菌或大大低估該致病菌的數量[33]。而MALDI-TOF MS 是一種基于蛋白質檢測的新型微生物鑒定手段，由于每種微生物都是由獨特的蛋白質組成，蛋白質約占細胞干重的50%，表達均由遺傳性狀決定，受到外界環境的影響較小[17]，因此蛋白質的不同種類可以作為微生物鑒定的生物標志物[19]。MALDI-TOF MS 不僅所需輔助試劑較少，操作便捷，檢測時間較短且準確高效，數據也有利于鑒定分析，作為國標法的有力補充，為食源性致病菌的鑒定、分型、溯源等提供了新的選擇[47]，但其鑒定結果受樣品處理方法、數據庫完善程度等因素的影響[48-49]。而是否能獲得重復性好且穩定的微生物特征性質譜圖，則取決于微生物樣品與基質液是否形成共結晶，共結晶越均勻則重復性越好[49]，因此點樣方式和前處理方式的優化都十分關鍵。

相較于夾心法和混合干滴法，覆蓋法點樣可獲得的平均峰數目更多，信噪比較高，特征峰更復雜且強度更高。而在前處理方式上，由于革蘭氏陽性菌的細胞壁含有肽聚糖和磷壁酸，一般厚度較厚，使用直涂法無法充分破壞肽聚糖，而不完全的菌體裂解可能導致蛋白質的流失，從而影響鑒定結果，因此直涂法往往由于菌體處理不干凈導致背景噪音大、基線穩定性差，有多峰合并和雜峰干擾現象，而甲酸提取法不論是處理革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌，相較于其他兩種方法可獲得更多的出峰量和更高的峰強度，且與數據庫中圖譜匹配度更高。

質譜圖中的每個譜峰均來源于致病菌細胞膜或細胞壁上的蛋白質經過激光解吸后發射的信號，由于不同種、屬間的致病菌都有自己特有的表面特征蛋白，因此可得到不同的特征性譜峰[49]，但利用直涂法和改良法進行前處理時給予的信息較少，不能完全反映菌體的結構特征，而甲酸提取法則是將菌體的細胞壁破碎進行全菌體制備，因而更容易獲得致病菌的特征譜峰。

MALDI-TOF MS 法在致病菌鑒定方面不僅靈敏、穩定、特異，且操作簡便、結果直觀，但如果圖譜采集效果不佳，則會嚴重影響數據的分析，進而對后續菌種鑒定的結果帶來直接影響，而對質譜圖譜的采集質量產生干擾的因素有很多，比如樣品在前處理時若培養基成分洗滌不凈，則培養基中蛋白質成分經固定析出后，會出現大量低能量端背景信號，從而干擾圖譜的采集；在點樣時待樣液自然干燥后必須盡快覆以基質液，否則易造成蛋白質氧化，不利于圖譜采集；在用甲酸乙腈法進行樣品處理時，必須讓乙醇充分揮發，否則會影響蛋白的溶出，導致圖譜采集信號較弱。MALDI-TOF MS 在血清分型、細菌多位點序列分型等細菌分型、蛋白組學等方面的研究已受到越來越多的關注，本文也通過對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的蛋白指紋圖譜特征峰的比對分析，為后續挖掘這三種目標菌的具體蛋白生物標志物的研究工作奠定了基礎。MALDI-TOF MS 技術不僅為食源性致病菌的分析鑒定與分型溯源提供了思路，也為食品檢驗檢測工作的高效有序展開奠定了良好基礎，可極大地確保食品質量、預警食品安全，也將更全面地為人民群眾“舌尖上的安全”保駕護航，為食品安全放心工程添磚加瓦，為食品安全共治格局提供強有力的技術支撐。