酚酸及有機酸輔色對山楂酒貯藏期品質的影響

蔣文鴻，張 純，劉素穩2,, ，常學東2,

（1.中糧長城葡萄酒（蓬萊）有限公司，山東煙臺 265608；2.河北省燕山特色農業產業技術研究院，河北秦皇島 066004；3.河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島 066604）

山楂（CrataegusL.），薔薇科（Rosaceae），在我國主要分布于山東、山西、京津冀、遼寧、河南等地[1]，具有降血脂、抗心律不齊、強心、調節胃腸道、降糖、抗菌抗炎、免疫調節、抗氧化等廣泛的藥理作用[2]。山楂味道偏酸，直接食用較少，常被用來加工。傳統山楂制品包括冰糖葫蘆、山楂糕、山楂罐頭、山楂果醬等產品，含糖高，附加值低。隨著時代發展，開發高附加值和低糖的健康產品已成為迫切需求。

山楂發酵酒作為新興的、具有保健功效的酒精飲料受到消費者歡迎。山楂酒的色澤主要是由花色苷呈現，但在生產過程中山楂酒花色苷易分解，發生褐變，影響山楂酒的品質。添加輔色素使其與花色苷發生增色效應和紅移現象是提高果酒中花色苷穩定性的有效方法[3]。因酚酸具有較強的生物活性，能改善并穩定含花色苷食品的顏色[4]，從而成為改善果酒褐變的有效措施[5]。研究表明，有機酸作為葡萄酒的重要風味構成物質，其種類和濃度對葡萄酒的感官質量、理化特性和顏色穩定性有重要影響[5]。有機酸對野生櫻桃李花色苷具有輔色作用，能提高花色苷的熱穩定性[6]，在黑米花色苷中也有輔色效應并能提高其穩定性[7]，在桑椹花色苷溶液中添加適量有機酸能夠有效緩解花色苷降解，效果最佳的為蘋果酸[8]。然而，不同種類酚酸及有機酸對花色苷的輔色作用及其熱穩定性的影響不同[8]，對不同結構的花色苷輔色效果也不同。因此，有必要考察不同類型酚酸及有機酸對山楂酒的輔色效果。研究發現阿魏酸[4]、香草酸[4]、對羥基苯甲酸[9]、丙二酸[6]、琥珀酸[3]、對香豆酸[9]、蘋果酸[8]、咖啡酸[4]在酚酸及有機酸中有較好的輔色效果。

山楂酒顏色劣變是一個常見的問題，目前關于果酒的輔色作用有很多報道，但對于山楂酒的輔色研究相對較少，所以構建酒模擬體系，篩選出合適的酚酸及有機酸，對了解發酵酒陳釀過程中不同酚酸及有機酸的輔色效果和對活性物質的影響有重要作用[5]，能夠為改善山楂酒顏色劣變提供參考。本實驗通過構建模擬體系，篩選輔色效果較好的酚酸及有機酸，利用CIELab 參數法研究模擬體系中不同酚酸及有機酸處理山楂酒的顏色變化情況，并對模擬體系及陳釀期間的山楂酒進行色度色調、總酚、花色苷等酚類活性物質的測定，驗證輔色效果，以期為發酵山楂酒的輔色技術提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

興隆紫肉山楂 產地為河北興隆地區，采收期在10 月；無水乙醇、冰醋酸 天津市凱通化學試劑有限公司；鹽酸 永飛化學試劑有限公司；碳酸鈉、氯化鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁 天津市風船化學試劑科技有限公司；沒食子酸 天津市科密歐化學試劑開發中心；福林酚、香草酸、果膠酶（酶活力≥1000 U/mg）、矢車菊素-3-葡萄糖苷 上海源葉生物科技有限公司；對羥基苯甲酸、琥珀酸、對香豆酸、丙二酸、蘋果酸、阿魏酸、咖啡酸 國藥集團化學試劑有限公司；果酒酵母 法國LAFFORT；其余常用試劑均為分析純。

JYL-C012 型打漿機 九陽股份有限公司；FE20型實驗室pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHL-A 電腦恒流泵、723 型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；LGJ-15D 型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；N-1100 型旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社埃朗科技國際貿易有限公司；SN-MS-H2800 磁力攪拌器 上海尚善儀器設備有限公司；SMY-2000 系列測色色差計 北京盛名揚科技開發有限責任公司；TDZ5-WS 臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂花色苷制備 取山楂果皮200 g，用打漿機打碎備用。以1:6（m/v）的比例加入80%酸化乙醇（0.1%鹽酸），40 ℃恒溫浸提，500 r/min 攪拌1 h。抽濾，進行二次浸提，料液比為1:5（m/v），條件同一次浸提（浸提及抽濾過程避光），合并濾液。濾液用AB-8 大孔樹脂純化、45 ℃真空旋轉濃縮，-18 ℃冰箱冷凍12 h 后，-40 ℃冷凍干燥，山楂花色苷粉末用棕色離心管-18 ℃避光保藏[10]。

1.2.2 山楂酒制備 將新鮮成熟無腐爛的山楂洗凈去核打漿，山楂:水質量比為1:2 進行料液添加，加入75 mg/L 的二氧化硫并在25 ℃保持24 h，加入110 mg/L 的果膠酶，pH2.5，37 ℃酶解6 h，在果膠酶處理結束后，及時加入50%白砂糖以補充糖分，隨后加入60 ml/L 活化酵母，二次加剩余50%糖，按照17 g/L 產生1% v/v 酒精添加，將調好的山楂汁在25 ℃的培養箱中放置發酵。每天攪拌一次，測酒精度，第12 d 發酵結束，最終生成8% v/v 酒[11]。山楂酒發酵結束后，過濾得到上清液，分別添加對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸，添加濃度為0.1 mol/L，對照組不作任何添加。

1.2.3 花色苷輔色模擬體系的建立 配制0.002 mol/L（以矢車菊素-3-葡萄糖苷計）的山楂花色苷溶液，0.1 mol/L 的酚酸及有機酸溶液（阿魏酸、香草酸、對羥基苯甲酸、丙二酸、琥珀酸、對香豆酸、蘋果酸、咖啡酸），取5 mL 花色苷溶液，加入5 mL 酚酸及有機酸溶液，再加入3 mL 無水乙醇，用蒸餾水定容至50 mL，對照組不加酚酸及有機酸，用鹽酸調相同pH 為2.5[12]。模擬體系的酒精度達到8% v/v，pH為3.6。避光于室溫下貯藏，定期測量模擬體系的L*、a*、b*、C*ab、hab值，色度色調，總酚和花色苷含量的變化。

1.2.4 顏色偏差測定 取模擬體系酒液，用色差計測量其顏色偏差，記錄L*、a*、b*、C*ab、hab的值。L*表示色澤的明度，L*=0 為黑色，L*=100 為白色；a*值表示紅色（+a*）和綠色（-a*）；b*值表示黃色（+b*）和藍色（-b*）；C*ab表示彩度；hab表示色調角。其中C*ab、hab的計算公式為[13]：

1.2.5 色度色調測定 用分光光度計在420、520、620 nm 分別測得其吸光度值，用蒸餾水做空白。

1.2.6 總酚含量測定（福林-肖卡法）量取不同體積的沒食子酸標準液（1 mg/mL）于50 mL 的容量瓶中定容，取1 mL 上述標準液，加入5 mL 經稀釋十倍的福林酚試劑，搖勻。1 min 后加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL，搖勻，加蒸餾水到10 mL。在75 ℃下反應10 min，在765 nm 波長下測吸光度值。標準曲線回歸方程為：y=8.5488x+0.0173，R2=0.9991，吸取樣液1 mL 同標準曲線方法，測吸光度值。根據標準曲線計算總酚含量。

1.2.7 花色苷含量的測定（pH 示差法）取山楂酒1 mL，分別用pH1.0 和pH4.5 的緩沖溶液定容到5 mL，分別在700、520 nm 處測其吸光度值。

式中：A=△pH1.0-△pH4.5，MW=449.2 g/mol（矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質量），B=26900 L·cm-1mol-1（矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數），DF=5（稀釋倍數），L=1 cm（比色皿光徑長度）。

1.2.8 山楂酒中黃酮的測定 吸取樣液0.5 mL 于棕色具塞試管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.12 mL，放置6 min，后加入10%硝酸鋁溶液0.12 mL，放置6 min，再加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液1.6 mL，然后用50%乙醇定容，搖勻放置15 min，然后于4000 r/min 離心機離心10 min，取上清液于510 nm處測吸光度值，根據標準曲線計算黃酮的含量。

蘆丁標準曲線回歸方程為y=10.263x-0.0035，R2=0.9993。

1.3 數據處理

本文所用數據平行及重復次數均大于3，結果以平均值±標準差（SD）表示；使用Excel 進行數據處理，SPSS 27.0 進行統計學分析，采用GLM 單變量分析，使用Waller-Duncan 檢驗，P＜0.05 表示有顯著差異，P＜0.01 表示有極顯著差異；采用Origin Pro 2021軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 模擬體系中不同酚酸及有機酸種類對花色苷輔色效果的影響

花色苷在520 nm 處有最大吸收峰，常用來判斷濃度大小[14]，也可以判斷有機酸對花色苷的輔色效果[15]。加入有機酸能夠降低溶液的pH，在低pH 的條件下花色苷的紅色增強，能提高花色苷的穩定性[16]。如圖1 所示，與對照組相比，八種酚酸及有機酸均能顯著增加山楂酒花色苷在520 nm 的吸光度（P＜0.05）。其中，對羥基苯甲酸的吸光度值最高，即輔色程度最強，其次是香草酸和阿魏酸。與對照組相比，對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸的吸光度值分別增加了42.82%、36.70%、31.38%，輔色效果優于其他組。有研究表明，在520 nm 條件下加入有機酸能使黑果枸杞花色苷產生紅移現象，溶液吸光度值顯著增加，含量增多[17]。因此本實驗選擇對羥基苯甲酸、香草酸和阿魏酸作為輔色酚酸及有機酸進行后續分析。

圖1 酚酸及有機酸對山楂花色苷在520 nm 吸光度的影響Fig.1 Effect of phenolic acid and organic acid on the absorbance of hawthorn anthocyanin at 520 nm

山楂酒花色苷在520 nm 的吸光度值隨著時間的增長呈下降趨勢（圖2）。在0 d 至30 d 的處理期間，對羥基苯甲酸處理的山楂酒模擬體系花色苷吸光度降低了12.66%，香草酸和阿魏酸處理后吸光度分別降低15.32%和20.45%，對照組花色苷吸光度降低了27.13%。酚酸及有機酸處理對減弱模擬體系中花色苷吸光度的下降具有極顯著作用（P＜0.01），30 d時，對羥基苯甲酸的吸光度較對照組高出42.82%。表明對羥基苯甲酸可能對山楂酒吸光度保持作用效果最佳。

圖2 模擬體系中山楂花色苷貯藏期間吸光度的變化Fig.2 Changes in absorbance of hawthorn anthocyanin during storage in the simulated system

2.2 模擬體系中不同酚酸及有機酸處理對酒體顏色偏差的影響

L*表示模擬體系酒的明度，由表1 可知，0～30 d時間內四個組的L*值變化較大且整體呈上升趨勢，且體系顏色越來越亮。明度與色素的含量變化趨勢相反，明度越低，色素含量越高[18-19]。30 d 時，經酚酸及有機酸處理的模擬體系山楂酒的L*高于對照組，且顏色也比對照組酒液顏色亮，這與添加橡木片改善西拉葡萄酒的顏色和貯藏能力[20]中的研究發現一致，說明這三種酸對山楂酒均具有一定的輔色作用。

表1 模擬體系酒體的CIELab 參數Table 1 CIELab parameters for simulated system wines

a*值和b*值表示色調，色度a*值表示紅色色調，色度b*值表示黃色色調，飽和度C*ab值是a*值和b*值的綜合指標，表示酒顏色的色彩飽和程度[21]。在整個模擬體系中，經阿魏酸和香草酸處理的a*值整體呈下降趨勢，三組的b*值整體呈下降的趨勢，經酚酸及有機酸處理過的模擬體系酒a*值均大于0，且顯著高于對照組（P＜0.05），說明酚酸及有機酸處理的模擬體系較對照組的酒液顏色呈現更多的紅色，輔色作用顯著。對照組的a*值逐漸低于酚酸及有機酸輔色組，這與酚酸對三華李青汁的貯藏穩定性結果一致[4]，說明加入酚酸及有機酸可以使酒中紅度穩定。不同酚酸及有機酸處理對山楂酒的b*值有一定的影響。阿魏酸和香草酸處理的山楂酒相較于對照組顯著降低（P＜0.05），表示在模擬體系中阿魏酸和香草酸延緩了山楂酒黃色色調升高的速度，而對羥基苯甲酸處理的山楂酒相較于對照組差異不顯著（P＞0.05），說明對羥基苯甲酸處理的山楂酒b*值有較小的變化，而適當的b*值可以使酒體顏色更加鮮艷[22]。

C*ab是由色度決定體現顏色鮮艷程度的值，數值越大說明物體顏色越鮮艷即飽和度越高，反之則越暗[23]。經對羥基苯甲酸和香草酸處理的模擬體系酒在10～30 d 期間C*ab值高于對照組，這表明經酚酸及有機酸處理后顏色較對照組更加鮮艷，色彩飽和度更穩定，這與酚酸對三華李青汁的貯藏穩定性結果一致[4]。酚酸及有機酸處理能夠降低山楂酒顏色的損失，具有一定的輔色作用。

色相hab（即色調角）是指能夠比較確切地表示某種顏色色調的名稱，色相在0～360 之間以逆時針方向偏轉，0（±360）為紅色，60（-300）為黃色，120（-240）為綠色，180（-180）為青色，240（-120）為藍色，300（-60）為品紅色[24]，經酚酸及有機酸處理的山楂酒在5～30 d 期間色調角hab值約在-10～25 之間，變化范圍較小，與0 較為接近，顏色變化較為平穩，接近紫紅色調，與對賀蘭山東麓年輕紅葡萄酒的研究結果相似[21]，表明酚酸及有機酸對山楂酒花色苷變化具有一定的輔色作用。

2.3 模擬體系中不同酚酸及有機酸處理對酒體色度色調的影響

顏色密度能夠反映模擬體系中呈色物質的多少。如圖3 所示，酒體前期色度普遍呈下降趨勢，這可能與山楂酒中的呈色物質的組成變化有關；后期變化趨勢較前期平穩，可能由于酚酸及有機酸對花色苷的降解的抑制作用達到動態平衡[25]。在0～5 d 時添加香草酸的模擬酒色度呈上升趨勢，可能是由于香草酸與酒中物質發生反應，但隨著時間增加，吸光度緩慢上升。對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 模擬體系中不同酚酸及有機酸處理酒體色度色調的變化Fig.3 Changes in color hue of wines treated with different phenolic and organic acids in simulated systems

色調值能夠顯示模擬體系中黃色物質與紅色物質的比例[26]，小于1 表示其中的紅色物質多于黃色物質。色調值與酒中輔色類花色苷濃度成反比[27]。模擬體系中不同酚酸及有機酸處理的山楂酒色調整體呈上升趨勢，經酚酸及有機酸處理的山楂酒在發酵過程中色調均小于1，說明山楂酒中紅色物質多于黃色物質，添加酚酸及有機酸能夠對山楂酒進行輔色作用，使酒液顏色得到穩定的呈現。同樣，在“西拉”紅葡萄酒發酵前添加有機酸發現，隨時間的延長，有機酸顯著降低了酒體的色調，抑制了酒體逐漸由紫紅色向黃色轉變[5]，這可能是酚酸及有機酸能夠改善模擬體系中山楂酒色調的原因之一。

2.4 模擬體系中不同酚酸及有機酸處理對酒體酚類物質含量的影響

在0～20 d 時，酚酸及有機酸和對照組的總酚含量為緩慢下降的趨勢，在20 d 之后四組均為上升趨勢，增高程度由急劇到緩慢（圖4）。阿魏酸和香草酸處理組的總酚含量均高于對羥基苯甲酸處理組和對照組。前期可能是因為山楂酒模擬體系中酚類物質發生沉降，導致總酚含量下降[28]；后期貯藏過程中由于花色苷與黃烷醇之間的直接（聚合反應）或由醛類介導的聚合反應產生了新的穩定色素使總酚含量升高[29]。在整個處理過程中，阿魏酸和香草酸處理的酒體總酚含量顯著高于對照組（P＜0.05）。30 d 時，經阿魏酸和香草酸處理的酒體總酚含量分別高于對照組18.00%和20.88%（P＜0.05），說明酚酸及有機酸處理有助于提高山楂酒的總酚含量，三種酚酸及有機酸處理中阿魏酸和香草酸優于對羥基苯甲酸。在咖啡酸和迷迭香酸處理的干紅葡萄酒酒中，也發現處理組總酚含量高于對照組[30]，這與本實驗結果相似。

圖4 模擬體系中不同酚酸及有機酸處理酒體酚類物質含量的變化Fig.4 Changes in the phenolic content of wines treated with different phenolic and organic acids in the simulated system

在模擬體系處理過程中花色苷含量呈下降趨勢，主要原因是隨著時間的增加，單體花色苷會逐漸降解，且有機酸會與單體花色苷形成更穩定的絡合物，這些花色苷衍生物對賦予酒體持久和穩定的顏色起著積極的作用[31]。30 d 后，經對羥基苯甲酸和香草酸處理的模擬體系中花色苷含量高于對照組中花色苷的含量，分別為17.27%和15.74%。有研究發現添加有機酸的葡萄酒中總花色苷保留率高于對照組，表明添加有機酸在一定程度上促進輔色效果，延緩花色苷的降解[32]。

2.5 不同酚酸及有機酸處理對貯藏期間發酵山楂酒色度色調的影響

色度是評價果酒品質的一個重要指標，能夠判斷酒品的質量好壞與氧化程度。花色苷、單寧含量越高，酒的顏色越深，色度值也就越大[33]。

貯藏期間山楂酒的色度值整體呈上升趨勢（圖5）。120 d 時，對照組色度增高了12.13 倍，而經對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸處理的山楂酒色度分別提高了17.33、13.58 和12.59 倍，對羥基苯甲酸輔色效果最好，能顯著提高色度（P＜0.05），這與模擬體系一致；色度趨勢變化不規則可能是由于酒中的顯色物質除花色苷外還有聚合色素和類黃酮物質等，也會對山楂酒色度產生影響，且單寧在酒的釀造和陳釀過程中與果皮中的花色苷形成聚合色素，也會影響酒液的色度變化[33]。櫻桃酒的色度在一年的陳釀過程中，前期色度值趨勢不穩定，在后期色度變化趨于平穩[34]，與本實驗研究結果相似。

圖5 不同酚酸及有機酸處理下貯藏期間山楂酒色度色調的變化Fig.5 Changes in color hue of hawthorn wine during storage under different phenolic and organic acid treatments

果酒色調值較高時，黃色色調明顯，酒體偏褐色[35]。山楂酒色調整體呈下降趨勢，與色度趨勢相反，在5～120 d 時整體與花色苷含量呈負相關，發酵酒在貯藏期間由于鐵離子和有機酸的共同存在，使花色苷降解[36]，不含酚酸及有機酸的對照組花色苷含量反而較高。在120 d 時，色調值大于1，即表明山楂酒中的黃色物質多于紅色物質。120 d 時，經對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸處理的山楂酒色調分別降低了56.06%、44.76%和58.73%；對照組的山楂酒色調從0 d 的3.102 經120 d 的陳釀下降為1.410，降低了54.54%。酒中顯黃色的物質主要是類黃酮類物質，而顯紅色的主要是花色苷類物質。在貯藏期間，果酒中黃酮含量隨時間增加而增加，花色苷含量隨時間增加而降低，導致整體色調呈降低趨勢[37]。

2.6 貯藏期間不同酚酸及有機酸處理對發酵山楂酒酚類物質含量的影響

山楂酒在貯藏期間的總酚、花色苷和黃酮含量如圖6 所示，山楂酒的總酚含量整體呈先下降后上升的趨勢。對照組的山楂酒總酚含量在120 d 的陳釀期降低了37.17%，經對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸處理的山楂酒總酚含量分別降低了31.34%、29.39%和31.53%。120 d 時經阿魏酸和香草酸處理的酒體總酚含量分別高于對照組37.42%和34.44%。陳釀前期可能是山楂酒中的酚類物質發生聚合及縮合反應[38]，酚類物質發生降解，導致總酚指數下降；陳釀后期原料中酚類物質還可由微生物和乙醇作用繼續緩慢溶出[39]。阿魏酸和香草酸與對照組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。說明酚酸及有機酸處理對山楂酒的總酚含量具有積極的作用，三種酚酸及有機酸中處理效果較好的為阿魏酸和香草酸，和模擬體系研究結果一致。

圖6 貯藏期間不同酚酸及有機酸處理山楂酒酚類物質含量的變化Fig.6 Changes in phenolic content of hawthorn wine treated with different phenolic acids and organic acids during storage

山楂酒在貯藏期間花色苷含量整體呈先下降再上升后下降的趨勢，60 d 后呈下降趨勢。對照組花色苷含量降低了76.27%，經對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸處理的山楂酒花色苷含量經120 d 的陳釀分別降低了71.30%、83.14%和70.65%。120 d 時經香草酸和對羥基苯甲酸處理的酒體花色苷含量分別高于對照組22.93%和6.92%。山楂酒中主要顯色物質是一些游離花色苷和聚合色素，游離的花色苷不如聚合色素穩定，在儲存過程中受到自身結構、pH、貯藏溫度、光照、氧氣、酶等影響，逐漸降解[40]。在120 d 貯藏期，對羥基苯甲酸和香草酸與對照組之間存在顯著性差異（P＜0.05），說明酚酸及有機酸種類影響花色苷聚合和降解[23]。

山楂酒中的黃酮物質大多來自山楂果，還有一部分在發酵中形成，酵母的發酵會吸收、水解或氧化這些成分[41]。黃酮含量整體呈先下降再上升的趨勢，由于酵母產生的果膠酶能夠破壞細胞壁，促進黃酮類物質從細胞中溶出[42]，30 d 后呈上升趨勢。對照組的山楂酒中黃酮含量經120 d 的陳釀增加了51.92%，經對羥基苯甲酸、阿魏酸和香草酸處理的山楂酒中黃酮含量經120 d 的陳釀增加了53.01%、36.71%和46.01%，120 d 時經香草酸和阿魏酸處理的酒體黃酮含量分別高于對照組6.67%和2.05%。經香草酸和阿魏酸處理的山楂酒與對照組之間存在顯著性差異（P＜0.05），說明香草酸和阿魏酸對促進山楂酒黃酮類物質的溶出有較好的效果。

3 結論

本研究考察了模擬體系和貯藏期間的山楂酒酚酸及有機酸輔色處理對色度色調和酚類化合物的影響。結果表明，在山楂酒模擬體系中對羥基苯甲酸、香草酸、阿魏酸的輔色效果最好。酚酸及有機酸輔色處理能減少色澤和營養成分的損失，使酒中色澤保持更加持久，但不同酚酸及有機酸的處理效果不同；在貯藏期間，對羥基苯甲酸和阿魏酸對色度有較好的作用。因此，對不同需求可采用不同酚酸和有機酸進行輔色。后續可進一步確定酚酸及有機酸的最適添加量，也可采用復合輔色劑對山楂酒進行輔色處理，以篩選和制備具有更好效果的輔色劑，進一步提高山楂酒品質。