基于生物網絡分析研究柑橘屬果皮輔助預防2 型糖尿病作用

張 彥，閆 平, ，張 華，張 寒，鄭夢迪，柴希艷

（1.西安醫學院，陜西西安 710021；2.西安雨潤百德健康管理有限公司，陜西西安 710065）

蕓香科植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培變種的成熟果皮為陳皮[1]，最常見的變種為廣陳皮即茶枝柑（Citrus reticulata'Chachi'）[2-3]。酸橙（Citrus reticulataBlanco）及其栽培變種的未成熟果實為枳殼[2-3]。以上品種與甜橙（Citrus sinensisOsbeck）的幼果為枳實[2-3]。近年來出現橘、橙、柑的園藝栽培變種及雜交種[2-3]，例如沃柑、砂糖橘等，其外果皮被廣大消費者自行使用，用以理氣健脾，燥濕化痰[1-3]，其活性成分中黃酮類、檸檬苦素類和揮發油類與代謝性疾病治療密切相關[4-8]。有學者通過體內外實驗證實橘皮有降糖的作用[9-10]。

糖尿病（diabetes mellitus，DM）為常見慢性病。我國是世界上糖尿病患病率上升最快的國家，約有1.1 億患者[11]，其中2 型糖尿病（T2DM）占90%以上。目前治療T2DM 除注射胰島素外，可口服降糖藥包括雙胍類、α-糖苷酶抑制劑等[12]，而以上降糖藥物存在不良反應，故尋找高效、低毒性的純天然降糖活性物質來輔助降糖是重要的研究方向。抑制α-葡萄糖苷酶可影響人體對碳水化合物的消化吸收，從而抑制血糖升高[4]，故評價體外對α-葡萄糖苷酶抑制作用可快捷方便篩選降糖活性物質。

生物網絡分析采用網絡藥理學，利用計算機技術和大數據從系統層次和生物網絡的角度，對“成分-靶點-疾病”進行多層次交互，解析植物提取物中多成分之間的關聯規律，闡釋其藥效物質基礎及機制[13-14]。再用分子對接模擬成分和作用靶點間相互作用、結合模式和親和力[15-16]。生物網絡分析已廣泛應用于活性成分發現與評價領域，但尚未見該方法對柑橘屬植物果皮降糖作用的研究。

本研究先用體外α-葡萄糖苷酶抑制作用評價13 批柑橘屬植物果皮的降糖效果，然后用生物網絡分析中常用的網絡藥理學與分子對接技術預測其可能輔助預防T2DM 的成分與作用機制，以期闡明常見的蕓香科柑橘屬植物果皮可否作為保健品新資源應用于2 型糖尿病的預防中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母源α-葡萄糖苷酶（26 U/mg）上海源葉生物科s技有限公司；PNPG（P-Nitrophenyl-d-D-glucopyranoside，4-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷）上海麥克林科技有限公司；阿卡波糖（BR，純度≥95%）都萊生物技術有限公司；無水乙醇（AR，純度≥99.7%） 天津市歐博凱化工有限公司；Na2CO3分析純，天津大茂化學試劑廠；純凈水 實驗室自制；柑橘屬植物果皮樣品 自制，詳見表1，曬干的樣品均為室溫16～22 ℃通風自然干燥。

表1 樣品信息及來源Table 1 Sample information and source

Readman1900/1900plus 型光吸收型全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；KQ5200E 型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；N-1300D 型旋轉蒸發儀、CCA-1112A 型冷卻水循環裝置、NVP-1000 型隔膜真空泵 東京理化器械株式會社；SQP 型電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 柑橘屬植物果皮提取物浸膏的制備及體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 13 批柑橘屬植物果皮50 ℃干燥60 min 后粉碎過24 目篩，精密稱取樣品5.0 g 置于250 mL 具塞錐形瓶中，加50 mL 無水乙醇200 Hz 超聲提取30 min，過濾，提取2 次，合并濾液，減壓濃縮，蒸干得樣品提取物浸膏。

方法參考文獻[17-18]。分別稱取以上各樣品60 mg 浸膏，于5 mL 容量瓶加PBS 溶解并定容，得12 mg/mL 的樣品溶液，稀釋得4、6、8、10、12 mg/mL的待測樣品溶液。精密稱取1.8 mg（26 U/mg）α-葡萄糖苷酶凍干粉于5 mL 容量瓶用PBS 溶解并定容，制得9.36 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液。稱取PNPG 14.5 mg 于10 mL 容量瓶，用PBS 溶解并定容，制得4.8 mmol/L 的PNPG 溶液。稱取5.2295 g Na2CO3，于50 mL 容量瓶溶解并定容即得1.0 mol/L Na2CO3溶液。稱取60 mg 阿卡波糖，于5 mL 容量瓶溶解并定容，得12 mg/mL 的阿卡波糖溶液，稀釋為4、6、8、10 mg/mL 阿卡波糖溶液。

在96 孔板中，各試劑加樣體積見表2，依次加入PBS 緩沖液，α-葡萄糖苷酶溶液和樣品溶液，37 ℃恒溫孵育15 min，加入PNPG 溶液，37 ℃恒溫30 min，加入Na2CO3溶液中止反應，在405 nm 波長下，用酶標儀測定不同濃度的樣品在反應后吸光度。根據公式（1）計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率，其他按表2 加入，A5組為陽性對照，用樣品溶液同濃度的阿卡波糖代替樣品，平行操作三次。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制實驗加樣表Table 2 Addition table for α-glucosidase inhibition test

式中：A1、A2、A3、A4分別為樣品組、樣品空白組、陰性對照組和空白組陽性的吸光度。

1.2.2 柑橘屬植物果皮降糖活性成分的預測 從TCMSP 數據庫和查閱中英文文獻（截止2022 年4 月）獲得柑橘屬植物果皮的主成分，使用Chem-Draw 繪制2D 結構，將獲取的成分名稱導入Pubchem 網 站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），將Pubchem 網站顯示的2D 結構和繪制的2D 結構圖進行比對，確認化合物，從Pubchem 下載其2D Save文件，導入到SwissADME 網站（http://www.swissadme.ch/），計算化合物的分子特性。根據胃腸道吸收和藥物相似性規則的標準篩選標準來選擇化合物，即GI=high 且drug-likeness 項下有大于等于兩個yes[19-20]，將符合要求的活性成分編號列表。

生物活性化合物目標預測：將以上篩選的化合物導入Swiss TargetPredicition 網站（http://www.swisstargetpreduction.ch）預測藥物作用靶點，下載靶點信息，以probability＞0 為標準，將化合物與靶點信息對應，整理靶點信息[21]。

靶點交叉獲取共有靶點：MalaCards 數據庫（https://www.malacards.org/）和GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）搜索“diabetes mellitus type 2”獲得兩個數據庫中關于T2DM 的相關靶基因的信息。將柑橘屬植物果皮活性成分作用靶點與Ⅱ型糖尿病靶點導入Venny2.1.0（https:bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）網站，得到活性成分與疾病的共同靶標。整理活性成分共同靶點，使用Cytoscape 3.9.0 軟件（http://cytoscape.org/）繪制“橘皮活性成分-靶點-T2DM”網絡圖，使其可視化，并使用其內置的軟件工具Network Analyzer 計算以及靶點的網絡拓撲參數篩選出主要有效成分[22-23]。

1.2.3 柑橘屬植物果皮可能降糖機制的預測 T2DM靶點的PPI 網絡構建：將交集靶點上傳到STRING網站（https://stringdb.org），限定物種為“Homo sapiens”，選擇置信度（medium cofidence）＞0.4，隱藏網絡中游離的靶點（hide disconnected nodes in the network），將結果以TSV 形式導出，并使用Cytoscape 3.9.0 軟件將導入的TSV 文件轉成可視化PPI 網絡，并用小插件“CentiScape 2.2 Menu”，選中其中的度值（Degree），介度（Betweenness）和緊密度（Closeness）為指標，分析其結果得到陳皮干預T2DM 的核心靶點[19-20]。

GO 和KEGG 富集分析：將核心靶點導入Metascape（https://metascape.org/）網站進行GO 分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 條件進行篩選，將GO富集圖和KEGG 富集圖通過微生信（www.bioinformatics.com.cn）可視化[19-20]。

1.2.4 分子對接驗證 將1.2.3 項下預測的關鍵靶點在PDB 數據庫找到相應的蛋白，保存為PDB 格式。在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）尋找Degree 值前四的活性成分即1.2.2 項下預測到的活性成分2D 結構，并以mol2 格式保存，用PyMOL 軟件轉化為PDB 格式。利用MOE 軟件對蛋白進行去水、加氫、計算電荷、能量最小化等優化，后與活性小分子成分的PDB 格式進行對接，結合能＜-5.0 kJ/mol 結合力良好，數值越小結合能力越強[19-20]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 柑橘屬植物果皮體外α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

由表3 可知13 批柑橘屬植物包括雜交種的果皮體外對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。S1～S13 的半數抑制濃度IC50值分別為8.4、9.1、8.3、15.6、7.8、8.7、9.0、2.6、2.7、3.0、10.0、7.4、5.5 mg/mL，IC50值越小說明抑制活性越好，其中S8、S9、S10 即園藝栽培品種砂糖橘果皮各濃度抑制α-葡萄糖苷酶活性最好。故砂糖橘、沃柑、皇帝柑等常見的園藝栽培種、雜交種與該屬藥用品種陳皮、枳實、枳殼等同樣有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，并呈濃度依賴關系，其中沙糖桔皮、沃柑等近年來涌現的園藝栽培品種果皮對酶抑制效果較好。

表3 不同濃度樣品對α-葡萄糖苷酶抑制率（%）Table 3 Inhibition rate of α-glucosidase by samples with different concentrations (%)

2.2 柑橘屬植物果皮降糖活性成分的預測

2.2.1 活性成分 從TCMSP 數據庫和查閱文獻共獲得柑橘屬植物果皮中黃酮類、萜類、檸檬苦素類、揮發油類和生物堿類等65 種主要化合物成分，經SwissADME 網站篩選出40 種生物活性化合物。均符合藥物相似性和口服胃腸道吸收[21]，結果見表4。

表4 柑橘屬植物果皮活性化合物信息Table 4 Information on active compounds of Citrus peel

2.2.2 柑橘屬植物果皮干預T2DM 重要的目標化合物預測 從Swiss Target Prediction 網站中獲得柑橘屬植物果皮生物活性化合物的潛在目標。刪除重復后確定了480 個橘皮活性成分靶點。從Mala-Cards 數據庫和GeneCards 數據庫通過搜索術語“diabetes mellitus type 2”共獲得577 個關于T2DM的相關靶基因的信息。分別將收集的480 個活性成分靶點和收集的577 個T2DM 疾病靶點上傳到Venny 2.1[19-22]，獲取交集靶點共98 個見表5，可視化結果見圖1。將活性成分與交集靶蛋白導入到Cytoscape 3.9.0 軟件構建“柑橘屬植物果皮成分-靶點-T2DM 網絡圖”，見圖2。拓撲參數由高到低分別為α-松油醇、柚皮素、桔皮素、月桂酸，以上可能是橘皮輔助干預T2DM 重要的核心成分[19-22]。

圖1 柑橘屬植物果皮活性成分和T2DM 的共同靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the common target of Citrus peel active components and T2DM

圖2 柑橘屬植物果皮活性成分-靶點-T2DM 網絡圖Fig.2 Network diagram Citrus peel active components-target-T2DM

表5 柑橘屬植物果皮活性成分和T2DM 的共同靶點Table 5 Common targets of Citrus peel active components and T2DM

2.2.3 柑橘屬植物果皮降糖作用靶點的預測 柑橘屬植物果皮與T2DM 共有靶點的PPI 網絡，見圖3。將TSV 格式導出結果可視化，見圖4。以度值（Degree unDir）介度（Betweenness unDir）和精密度（Closeness unDir）這三個標準[19-22]來篩選橘皮干預T2DM 的核心靶點，篩選出17 個核心靶點，見表6。其中AKT1、ALB、PPARG、VEGFA 靠前。

圖3 柑橘屬植物果皮治療T2DM 共有靶點的PPI 網絡Fig.3 PPI network of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM

圖4 柑橘屬植物果皮治療T2DM 共有靶點的PPI 網絡可視化Fig.4 PPI network visualization of common targets of Citrus peel in the treatment of T2DM

表6 T2DM 的PPI 網絡核心靶點拓撲學分析結果Table 6 Topological analysis results of PPI network core targets of T2DM

GO 和KEGG 富集分析：將以上篩選出來的核心靶點導入metascape 網站進行GO 分析，包括三部分：生物過程（Biological process，BP）、細胞組分（Cellular components，CC）和分子功能（Molecular function，MF）[19-20]。以PValue Cutoff＜0.05 篩選[20-22]，共富集到284 個BP，6 個CC，38 個MF。根據P值篩選出來的前10 條BP、6 條CC 和前10 條MF，用微生信進行可視化處理，結果見圖5。

圖5 GO 功能富集分析組圖Fig.5 Go functional enrichment analysis group diagram

由圖5 可知，柑橘屬植物果皮輔助參與預防T2DM 靶點的生物過程可能與氧化應激（response to decreased oxygen levels）、脂質代謝調控（positive regulation of lipid metabolic process）有關。可能與細胞膜（side of membrane）與內質網（endoplasmic reticulum lumen）功能有關。可能與脂質結合受體（lipid blinding）、轉錄因子（transcription factor blinding）、類固醇受體（nuclear steroid receptor activity）、RNA、DNA、結合轉錄輔酶（ligand-activated transcription factor activity）等分子功能有關[19-22]。

KEGG 通路富集分析經過P＜0.05 的篩選結果顯示，柑橘屬植物果皮輔助參與T2DM 過程共有51 條通路，P值篩選出靠前10 條通路，見圖6。

圖6 KEGG 通路富集分析Fig.6 KEGG path analysis

圖6 可知，柑橘屬植物果皮輔助參與預防T2DM 的通路分別為癌癥中的通路（pathways in cancer）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathways）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcomaassociated herpesvirus infection）、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、PI3K-Akt 信號通路（PI3KAkt signaling pathways）、人乳頭瘤病毒感染（human papillomavirus infection）、人巨細胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、VEGF 信號通路（VEGF signaling pathways）、腎細胞癌（renal cell carcinoma）、AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）在糖尿病并發癥中的作用[19-22]。

2.3 分子對接驗證

將2.2.2 項下根據Degree 值分別篩選出來主要活性成分α-松油醇、柚皮素、桔皮素、月桂酸與2.2.3 項下得到的T2DM 相關核心靶蛋白AKT、VEGFA、PPARG 和ALB 做分子對接，打分結果見表7。結合能＜-5.0 kJ/mol 可認為結合能力良好，數值越小結合能力他越強。以此為篩選依據[19-22]，桔皮素與關鍵靶點生物親和力最強，活性最好。桔皮素與關鍵蛋白對接2D 與3D 模型，見圖7～圖8。

圖7 桔皮素與T2DM 分子對接2D 模型Fig.7 2D model of tangeretin-T2DM molecular docking

圖8 桔皮素-T2DM 分子對接3D 模型Fig.8 3D model of tangeretin-T2DM molecular docking

表7 有效成分與T2DM 靶點對接打分Table 7 Docking score of active ingredient and T2DM target

3 討論與結論

本研究發現蕓香科柑橘屬其果皮均可作為食品添加劑應用于糖尿病的輔助預防中，在保健領域有一定的研究價值，有較強的應用前景。如果將蕓香科柑橘屬植物及砂糖橘、沃柑等園藝栽培種和雜交種的果皮利用起來，可“變廢為寶”，實現農副產品的綜合利用與開發。通過生物網絡分析，本研究初步揭示柚皮素、桔皮素、月桂酸可能為柑橘屬植物果皮中輔助預防2 型糖尿病的活性成分。再結合分子對接初步揭示柑橘屬植物果皮對2 型糖尿病輔助預防的可能作用靶點，有一定的創新性。

生物網絡分析初步預測柑橘屬植物果皮預防2 型糖尿病的機制可能通過氧化應激等途徑，與炎癥中的PI3K-Akt、Ras、HIF-1 信號通路及血管相關的VEGF 信號通路等有關[24]。具體作用如下：第一，調控PI3K-Akt 信號通路，與胰島素調節有關[24-25]。胰島素受體底物磷酸化，激活PI3K，刺激磷脂酰肌醇，再進一步激活調節葡萄糖轉化和糖原合成的作用的AKT[24-25]。第二，調控RAS/MAPK 信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、免疫應答，與炎癥及血管新生的關系密切。第三，調控糖尿病視網膜病變相關的血管內皮生長因子VEGF 信號通路。桔皮素與以上通路中蛋白激酶B-1（AKT1）、白蛋白（ALB）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）、血管內皮生長因子A（VEGFA）結合作用良好，以上蛋白可能為柑橘屬果皮降糖機制的主要作用靶點[26]。桔皮素可進入該活性蛋白中心，與蛋白受體形成氫鍵。分子對接可視化圖可以看出其形成氫鍵的個數較多且作用力較強。但因時間有限以上猜想尚未通過體內及細胞水平的驗證，后續將進一步完善。

綜上所述，蕓香科柑橘屬植物果皮在預防2 型糖尿病方面有應用前景，可進一步深入研究。