甲酸對絲素蛋白結晶結構轉變的影響

梁蘇平, 何秀萍, 牛翔宇, 寧晚娥, 王 倩, 黃繼偉,2

(1.廣西科技大學 a.生物與化學工程學院;b.天虹現代紡織產業學院,廣西 柳州 545006; 2.蘇州大學 紡織與服裝工程學院,江蘇 蘇州 215123)

桑蠶絲素作為一種天然高分子蛋白質,具有優良的生物相容性、可控的生物降解性、無毒和低免疫原性[1],因此它在生物醫學工程材料、柔性可穿戴傳感器件、食藥品及精細化學品等領域具有廣泛的應用前景[2]。在這些應用領域中,對絲素蛋白結晶結構的表征與調控是重要的研究內容[3],決定著絲素蛋白再生材料的物理機械性能和生物醫學工程應用性能。如將絲素蛋白用作器官移植工程中的基質材料時,要求其具有合適的機械承載能力和生物降解速率,而這些性能與絲素蛋白的結晶結構及結晶度密切相關[4-5]。絲素蛋白材料作為一種半結晶物質,由結晶區和無定形區構成,晶粒的形狀、尺寸、排列、取向和拓撲關系是決定絲素蛋白材料物理機械性能的關鍵因素[6-10]。進一步地,通過調控絲素蛋白材料中的結晶形態或結晶結構參數可實現對其物理機械性能的調控。如通過采用不同的工藝方案調控絲素材料的結晶形態,獲得了具有Silk I結晶形態的絲素蛋白材料,進而獲得了特定性能或功能的生物組織工程用支架、膜等[11-13]。

絲素蛋白材料的結晶結構與其制備加工方法有關,而不同的溶劑體系所制備的絲素蛋白材料的結晶結構可能存在顯著差異[14]。已有研究表明,基于三元溶劑(摩爾比為1∶2∶8的氯化鈣、乙醇和水組成的溶劑體系)制備的絲素蛋白初生材料具有水溶性,結晶度較低,但當其經一定濃度乙醇處理后表現為水不溶且結晶度提高,正因如此,乙醇常被用作絲素蛋白結晶促進劑[15]。而基于甲酸溶劑制備的絲素蛋白初生材料則具有高度的Silk Ⅱ結晶結構[16],這表明甲酸亦具有促絲素蛋白結晶的作用。然而,有關甲酸促絲素蛋白結晶的研究卻鮮有報道。為了進一步闡明甲酸對絲素蛋白結晶結構的影響及甲酸促絲素蛋白結晶的作用,本文采用α-糜蛋白酶對所得絲素蛋白水溶液進行處理,分離出絲素蛋白的高結晶部分和低結晶部分[17-19]。隨后,采用甲酸和乙醇分別對分離得到的高結晶部分和低結晶部分進行處理,以期利用這兩種性狀截然不同的絲素物質在甲酸或乙醇處理后的結晶結構轉變說明甲酸對絲素蛋白的促結晶作用,為進一步利用甲酸調控絲素蛋白結晶結構提供參考。

1 實 驗

1.1 材 料

22.22/24.44 dtex桑蠶生絲(廣西融安縣金鼎制絲有限責任公司),98%甲酸(國藥集團化學試劑有限公司),99.5%無水乙醇(成都市科隆化學品有限公司),96%無水氯化鈣、99%無水碳酸鈉(西隴科學股份有限公司),≥98%氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠),≥40 units/mg α-糜蛋白酶(上海麥克林生化科技有限公司),上述所用化學試劑與藥品均為分析純;3500 Da透析袋(美國Amresco公司)。

1.2 儀 器

BPG-9240A型精密鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司),101-2B型電熱恒溫干燥箱(佛山市勁申機電設備有限公司),FJS-6型磁力攪拌水浴鍋(金壇市城西富威實驗儀器廠),AR224CN型電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司),RS-201型磁力攪拌器(廣東窯聲電器股份有限公司),H1850R型離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),DDS-307A型電導率儀(上海雷磁儀器有限公司),TF-FD-1型冷凍干燥機(上海田楓實業有限公司),X’Pert Pro型全自動X-射線衍射儀(荷蘭PANalytical公司),NicoLET 5700型傅里葉變換紅外光譜儀(美國熱電公司)。

1.3 方 法

1.3.1 桑蠶生絲的脫膠

采用堿法對桑蠶生絲進行脫膠,具體流程為:取指定質量的桑蠶生絲,置于含有質量分數為0.5%的碳酸鈉水溶液中,沸煮30 min,浴比質1∶200,沸煮結束后,用清水清洗3次。以上步驟重復3次,之后將經過脫膠后的蠶絲晾干,備用。

1.3.2 基于氯化鈣-甲酸溶劑體系的再生絲素蛋白膜制備

1)將指定質量的無水氯化鈣和98%甲酸置于燒杯中,待無水氯化鈣完全溶解后即配置得到質量分數為3%的氯化鈣-甲酸溶劑。

2)按照絲素蛋白質量分數為8%,計算并稱取一定質量的脫膠蠶絲,置于步驟1所制備的質量分數為3%的氯化鈣-甲酸溶劑中,再利用磁力攪拌器持續攪拌約4 h,至脫膠蠶絲完全溶解。

3)將完全溶解的絲素-氯化鈣-甲酸溶解液均勻平鋪于表面平整的培養皿中,并將其放置在通風櫥或干燥陰涼通風口處晾干成膜。之后,將干燥膜浸入去離子水以去除膜中的氯化鈣和殘留的甲酸,每4 h換一次水,總時長72 h,將泡水去鹽后的膜晾干,裝入密封袋保存,備測。

1.3.3 基于三元溶劑體系的再生絲素蛋白膜制備

1)取一定質量的脫膠蠶絲,將其置于氯化鈣-乙醇-水(摩爾比為1∶2∶8)的三元溶劑中溶解,其中浴比1∶10,溫度80 ℃,時間2 h。

2)將制備得到的絲素蛋白溶解液置于分子截取量為3500 Da的透析袋中,再置于流動的去離子水中透析,以去除乙醇和氯化鈣,透析時間72 h。透析結束后,將溶液置于離心機以去除凝結物,離心機轉速8 000 r/min,時間10 min,離心結束后可得到純凈的絲素蛋白水溶液。經測定,所得絲素蛋白水溶液的質量分數約為2%。

3)取30 mL絲素蛋白水溶液均勻平鋪于表面平整的培養皿中,置于陰涼通風處晾干成膜,裝入密封袋保存,備用。

1.3.4 利用α-糜蛋白酶降解分離絲素蛋白高結晶部分和低結晶部分

1)基于1.3.3獲取質量分數為2%絲素蛋白水溶液,采用氫氧化鈉溶液調節其pH值至7.8,之后以50 mL為基本量分別置于不同的燒杯中。

2)取一燒杯,加入15 mg的α-糜蛋白酶,并用0.5 mg的去離子水使其溶解,并攪拌均勻。將溶解的α-糜蛋白酶加入之前所準備的盛有絲素蛋白水溶液的燒杯中,攪拌均勻,再置于38 ℃的恒溫箱進行酶解,36 h后取出,將燒杯置于100 ℃沸水中水浴20 min使酶失活。

3)將經酶解的絲素蛋白溶液置于離心機以分離上清液和沉淀物,離心機轉速8 000 r/min,時間10 min。

4)將所得上清液再次用濾紙過濾后冷凍干燥,將所得物質(本文將其稱為“絲素蛋白低結晶部分”),稱重,備用。

5)將所得沉淀物用去離子水清洗,再離心,重復3次,每次所用洗滌的水棄去。最后,將最終的沉淀物烘干(本文將其稱為“絲素蛋白高結晶部分”),稱重,備用。

1.3.5 基于三元溶劑所制備再生絲素蛋白膜的后處理

1)乙醇后處理:取一定質量再生絲素蛋白膜,置于盛有75%乙醇溶液的燒杯中浸泡,燒杯用保鮮膜封口,浸泡時間 24 h,之后取出晾干,備測。

2)甲酸二次溶解:取一定質量再生絲素蛋白膜,將其再溶于98%的甲酸溶液中,之后用磁力攪拌器攪拌約3 h,直至膜完全溶解后,倒入培養皿中鋪膜晾干,備測。

3)乙醇處理后甲酸二次溶解:取一定質量步驟1所述得到的經乙醇后處理的再生絲素蛋白膜,再按照步驟2對其進行二次溶解和鋪膜晾干,備測。

1.3.6 絲素高結晶部分和低結晶部分的后處理

1)乙醇處理:燒杯中取適量的高結晶部分或低結晶部分,加入75%乙醇后封口置于陰涼處浸泡24 h,之后烘干,備測。

2)甲酸處理:在燒杯中加入高結晶部分或低結晶部分,取適量98%甲酸進行攪拌以使其完全溶解,之后倒入敞口培養皿中,待甲酸揮發,晾干,備測。

1.3.7 X射線衍射測試(XRD)

用剪刀將待測樣品剪成粉末狀,采用X’Pert-Pro型X射線衍射儀進行測試,X射線光源為Cu-Kα射線,電壓40 kV,電流25 mA,掃描速度10°/min,掃描范圍5°～50°。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜測試(FTIR)

用剪刀將待測樣品剪成粉末狀,取適量加入至KBr粉末中,充分攪拌研磨后制成壓片,采用NicoLET 5700型傅里葉變換紅外光譜儀對其進行測試,范圍為400～4 000 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數為64次。

1.3.9 FTIR和XRD光譜數據的分峰擬合

1)FTIR光譜數據的分峰擬合:將FTIR透過率譜轉換為FTIR吸光度譜,截取1 596～1706 cm-1波數內的數據,采用兩端點連直線法去除譜圖的基線,再采用fityk軟件對所得數據進行分峰擬合,峰形采用面積型高斯函數(GaussianA),所有擬合峰函數均采用相同的半高寬。

2)XRD光譜數據的分峰擬合:采用fityk軟件執行分峰擬合,峰形采用面積型高斯函數(GaussianA),擬合后按下式計算結晶度。

式中:Xc為結晶度,Sa為無定形擬合峰的積分面積,S為所有擬合峰的面積之和。

2 結果與分析

2.1 不同方式制備再生絲素蛋白膜的結構對比

2.1.1 FTIR分析

圖1為不同方式制備再生絲素蛋白膜的FTIR圖譜。圖1中,a為脫膠蠶絲樣品;b為基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜樣品;c為基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜樣品;d為基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜經75%乙醇后處理的樣品;e為基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜經98%甲酸二次溶解制膜的樣品;f為基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜先經75%乙醇后處理再經98%甲酸二次溶解制膜的樣品。

圖1 不同方式制備再生絲素蛋白膜的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of regenerated silk fibroin films prepared via different methods

由圖1可看出,相對于脫膠蠶絲(樣品a),基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品b)在酰胺I區和酰胺II區均出現明顯的紅移,其峰位出現在1 622 cm-1和1 516 cm-1附近,且峰形較尖銳,這說明基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜具有高度的β折疊結構;基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品c)的酰胺I區相對較為扁平;基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜經75%乙醇處理后(樣品d)、經98%甲酸二次溶解制膜(樣品e)和先經75%乙醇后處理再經98%甲酸二次溶解制膜(樣品f)的酰胺I區的峰位略有偏移,從1 634 cm-1偏至1 629 cm-1,這說明絲素蛋白膜中β折疊結構含量提高。

上述直觀分析可知,不同方式制備再生絲素蛋白膜具有不同的二級結構含量。為了量化各樣品中二級結構的含量,本文對各樣品酰胺I區進行分峰擬合[21-23],擬合圖譜如圖2所示,分析結果如表1所示。

圖2 不同方式制備再生絲素蛋白膜酰胺I區的分峰擬合Fig.2 Peak fitting of Amide I of regenerated silk fibroin films prepared via different methods

表1 不同方式制備再生絲素蛋白膜的二級結構含量分析Tab.1 Analysis of the secondary structure content of regenerated silk fibroin films prepared via different methods

由表1分析結果可知,基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品b)的β折疊含量最高,達到42.26%;其次是基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜經98%甲酸二次溶解制膜(樣品e)和先經75%乙醇后處理再經98%甲酸二次溶解制膜,其β折疊含量分別為38.5%和39.5%;最后是基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品c)及其經75%的乙醇后處理膜。這一結果說明甲酸具有更明顯的促結晶作用。

2.1.2 XRD分析

圖3為不同方式制備再生絲素蛋白膜的XRD圖譜。其中,樣品標示(a, b, c, d, e, f)的含義與圖1相同。

圖3 不同方式制備再生絲素蛋白膜的XRD圖譜Fig.3 XRD spectra of regenerated silk fibroin films prepared via different methods

由圖3可以看出,脫膠蠶絲(樣品a)、氯化鈣-甲酸溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品b)、三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜經98%甲酸二次溶解制膜(樣品e)和三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜先經75%乙醇后處理再經98%甲酸二次溶解制膜(樣品f),均在9.6°(弱)、20.7°(強)、24.6°(強)、39.9°(弱)和44.1°(弱)處存在明顯的衍射峰,說明脫膠蠶絲具有高度的Silk II結晶結構[24]。然而基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品c)則僅在12.3°和19.8°處存在峰,這說明其以無定形結構為主,可能存在部分Silk I結晶。基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜75%乙醇后處理后(樣品d),除了12.3°處的峰外,其峰位與脫膠蠶絲相似。

針對各樣品的XRD圖譜進行分峰擬合,結果如圖4所示。根據擬合圖譜分別計算各樣品的結晶度[25-28],結果如表2所示。

圖4 不同方式制備再生絲素蛋白膜XRD譜的分峰擬合Fig.4 Peak fitting of XRD spectrum of regenerated silk fibroin films prepared via different methods

表2 不同方式制備再生絲素蛋白膜XRD譜的分峰擬合面積匯總與結晶度Tab.2 Fitting peak area and crystallinity of XRD spectrum of regenerated silk fibroin films prepared via different methods

由表2可知,脫膠蠶絲(樣品a)的分峰擬合計算結晶度為38.74%,基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品b)、三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜經98%甲酸二次溶解制膜(樣品e)和三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜先經75%乙醇后處理再經98%甲酸二次溶解制膜(樣品f)的分峰擬合計算結晶度45%左右,而基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜(樣品c)和基于三元溶劑體系制備的再生絲素蛋白膜75%乙醇后處理后(樣品d)的結晶度較低,分別為33.79%和39.85%。這與FTIR的結果基本一致,進一步說明甲酸具有更明顯的促結晶作用。

2.2 α-糜蛋白酶對絲素蛋白高結晶部分和低結晶部 分的分離

基于1.3.4所述的方法,將絲素蛋白分離為絲素蛋白高結晶部分和低結晶部分。依據所得干燥固體產物的質量可估算兩者的比例[17],如表3所示。

由表3可見,通過α-糜蛋白酶將絲素蛋白分離為絲素蛋白高結晶部分和低結晶部分的比例為57.75%±0.12%,這與梅士英等[17]的研究基本一致。

表3 絲素蛋白經α-糜蛋白酶降解后的分級物產率及其比例Tab.3 Yields of graded products and their proportions after degradation of fibroin proteins by α-chymotrypsin

2.2.1 絲素蛋白高結晶部分的乙醇或甲酸處理對其結晶結 構的影響

圖5為絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的FTIR圖譜。圖5中,g為絲素蛋白高結晶部分的樣品,h為絲素蛋白高結晶部分經乙醇處理的樣品,i為絲素蛋白高結晶部分經甲酸處理的樣品。

由圖5可見,絲素蛋白高結晶部分(樣品g)在酰胺I區的1 626 cm-1處、酰胺Ⅱ區的1 530 cm-1處和酰胺Ⅲ區的 1 235 cm-1處均存在尖峰,這說明其具有高度的β-sheet構象;對絲素蛋白高結晶部分分別進行乙醇或甲酸處理后,其酰胺I區、酰胺Ⅱ區和酰胺Ⅲ區的峰位并未見顯著的變化,但曲線的尖銳程度略有下降,這說明絲素蛋白高結晶部分經乙醇或甲酸處理后,其β折疊構象含量出現了下降。

針對圖5各樣品FTIR譜的酰胺I區分別執行分峰擬合,如圖6所示。各樣品的二級結構含量分析如表4所示。

圖5 絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸 處理后的FTIR圖譜Fig.5 FTIR spectrum of the high-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

圖6 絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后所得FTIR譜酰胺I區的分峰擬合Fig.6 Peak fitting to amide I of FTIR spectrum of the high-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

由表4可知,絲素蛋白高結晶部分(樣品g)具有高度的β折疊結構,其β折疊含量達到46.35%,遠高于脫膠蠶絲(樣品a)的36.04%。相對于絲素蛋白高結晶部分(樣品g),絲素蛋白高結晶部分經乙醇處理后(樣品h),其β折疊含量僅下降了1.64%,而絲素蛋白高結晶部分經甲酸處理后(樣品i)的β折疊含量卻下降了7%。這說明甲酸處理絲素蛋白高結晶部分時,對其β折疊結構存在破壞作用,且在干燥過程中被破壞的β折疊結構并未完全恢復。

表4 絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的 二級結構含量分析Tab.4 Analysis of the secondary structure content of the high-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

圖7為絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的XRD圖譜。圖7中,樣品標示(g, h, i)的含義與圖5相同。

由圖7可見,絲素蛋白高結晶部分(樣品g)在9.8°、12.8°、19.45°、20.8°、24.6°、29.5°、32.5°、40.11°和43.9°附近存在衍射峰,其中12.8°、19.45°、29.5°和32.5°歸屬于Silk I結構,而9.8°、20.8°、24.6°、40.11°和43.9°歸屬于Silk Ⅱ結構。相對于絲素蛋白高結晶部分(樣品g),對絲素蛋白高結晶部分分別進行乙醇處理(樣品h)和甲酸處理(樣品i)后,其主衍射峰19.15°和20.75°處的強度出現了下降,29.5°和32.5°處的峰強顯著減弱,12.8°處的峰位偏移至11.9°,尤其是絲素蛋白高結晶部分經甲酸處理(樣品i)后,這種趨勢更加明顯。這或許可說明:與乙醇后處理不同,甲酸破壞了絲素蛋白高結晶部分中的Silk I結構,而僅利于絲素蛋白Silk Ⅱ結構的再生。

針對圖7各樣品的XRD譜分別執行分峰擬合,如圖8所示。各擬合峰面積匯總與結晶度如表5所示。

圖7 絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸 處理后的XRD圖譜Fig.7 XRD spectrum of the high-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

圖8 絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后所得XRD譜的分峰擬合Fig.8 Peak fitting to XRD spectrum of the high-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

表5 絲素蛋白高結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后所得XRD譜的擬合峰面積匯總與結晶度Tab.5 Fitting peak area and crystallinity of XRD spectrum of the high-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

由表5可知,絲素蛋白高結晶部分(樣品g)的分峰擬合計算結晶度為57.95%,對絲素蛋白的高結晶部分分別進行乙醇處理(樣品h)和甲酸處理(樣品i)后,其結晶度出現了不同程度的下降,尤其是甲酸處理后(樣品i),其分峰擬合計算結晶度相對于絲素蛋白高結晶部分(樣品g)下降了14.19%。這進一步印證了FTIR分析的結果,即甲酸處理破壞了絲素蛋白高結晶部分的β折疊結果,使其結晶度下降。

2.2.2 絲素蛋白低結晶部分的乙醇或甲酸處理對其結晶結 構的影響

圖9為絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的FTIR圖譜。圖9中,j為絲素蛋白低結晶部分的樣品,k為絲素蛋白低結晶部分經乙醇處理的樣品,l為絲素蛋白低結晶部分經甲酸處理的樣品。

由圖9可見,絲素蛋白低結晶部分在酰胺I區的峰位于1 652 cm-1處,歸屬于無規卷曲構象,酰胺II區的峰位于1 553 cm-1處,同樣歸屬于無規卷曲構象;絲素蛋白低結晶部分分別經乙醇或甲酸處理后,兩者的酰胺I區峰位于1 626 cm-1處,酰胺Ⅱ區的峰位于1 542 cm-1處,此兩處的峰均歸屬于β折疊構象[20]。這說明乙醇或甲酸處理均可使絲素蛋白低結晶部分從無規卷曲構象轉變為β折疊構象。

針對圖9各樣品FTIR譜的酰胺I區分別執行分峰擬合,如圖10所示。各樣品的二級結構含量分析如表6所示。

圖9 絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的FTIR圖譜Fig.9 FTIR spectrum of the low-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

圖10 絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后所得FTIR譜酰胺I區的分峰擬合Fig.10 Peak fitting to amide I of FTIR spectrum of the low-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

表6 絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的 二級結構含量分析Tab.6 Analysis of the secondary structure content of the low-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

由表6可知,絲素蛋白低結晶部分(樣品j)的β折疊含量僅有19.17%,其β轉角含量高達33.71%;相對而言,絲素蛋白低結晶部分經乙醇處理后(樣品k)的β折疊含量增加至29.23%,相應地,其無規卷曲含量和β轉角含量分別下降了2.67%和6.62%;絲素蛋白低結晶部分經甲酸處理后(樣品l)的β折疊含量為32.81%,相對絲素蛋白低結晶部分(樣品j)增加了13.64%,同樣地,其無規卷曲含量和β轉角含量分別下降了6.3%和5.12%。這些量化結果說明:對于絲素蛋白低結晶部分,乙醇或甲酸處理可使其無規卷曲和β轉角構象轉變為β折疊構象,且甲酸的促轉變能力顯著高于乙醇。

圖11為絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后的XRD圖譜。圖11中,樣品標示(j,k,l)的含義與圖9相同。

圖11 絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸 處理后的XRD圖譜Fig.11 XRD spectrum of the low-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

由圖11可見,絲素蛋白低結晶部分(樣品j)僅在21.2°處出現衍射峰;絲素蛋白低結晶部分經乙醇處理后(樣品k),在12.5°和20.7°處出現了衍射峰;絲素蛋白低結晶部分經甲酸處理后(樣品l),則在9.1°、12.5°、20.7°、24.5°、40.3°和43.5°附近均出現了衍射峰。這些結果表明:對于絲素蛋白低結晶部分,甲酸具有比乙醇更顯著的促結晶能力。

針對圖11各樣品的XRD譜分別執行分峰擬合,如圖12所示。各擬合峰面積匯總與結晶度如表7所示。

圖12 絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后所得XRD譜的分峰擬合Fig.12 Peak fitting to XRD spectrum of the low-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

表7 絲素蛋白低結晶部分及其分別經乙醇或甲酸處理后所得XRD譜的擬合峰面積匯總與結晶度Tab.7 Fitting peak area and crystallinity of XRD spectrum of the low-crystalline parts of fibroin protein and its treatment with ethanol or formic acid respectively

由表7可知,絲素蛋白低結晶部分(樣品j)的分峰擬合計算結晶度僅有25.6%,相對而言,絲素蛋白低結晶部分經乙醇處理后(樣品k)的分峰擬合計算結晶度提高了5.7%,而絲素蛋白低結晶部分經甲酸處理后(樣品l)的分峰擬合計算結晶度達到45.82%,提高了20.22%。這些結果進一步地驗證了:對于絲素蛋白低結晶部分,甲酸具有比乙醇更顯著的促結晶能力。

3 結 論

甲酸作為一種蠶絲的優良溶劑,所制備的絲素蛋白再生材料具有優異的性能,這可能與其具有促絲素蛋白結晶的作用有關。為此,本文首先對比分析了基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備絲素蛋白再生膜與基于三元溶劑體系制備絲素蛋白再生膜的結構差異。然后,利用α-糜蛋白酶對基于三元溶劑體系制備的絲素蛋白水溶液進行處理,獲得絲素蛋白的高結晶部分和低結晶部分。進一步地,對分離所得的絲素蛋白高結晶部分和低結晶部分分別進行乙醇和甲酸處理,進而借助FTIR和XRD分析了它們的結晶結構轉變。結果表明:

1)相對于基于三元溶劑體系制備絲素蛋白再生膜,基于氯化鈣-甲酸溶劑體系制備絲素蛋白再生膜中具有更高的β折疊含量,結晶度更高。

2)對于絲素蛋白高結晶部分,乙醇處理并不破壞其Silk I結晶結構,結晶度更高,而甲酸處理可破壞其結晶結構,且其Silk I結晶結構并未完全恢復,致使其結晶度顯著下降。

3)對于絲素蛋白低結晶部分,甲酸處理表現出了更加顯著的促結晶作用,可使絲素蛋白低結晶部分的結晶結構再生,而乙醇處理的促結晶作用較弱。

通過研究可知,甲酸不僅在溶解絲素蛋白材料時具有破壞其結晶結構的能力,而在基于甲酸溶劑的溶解液的干燥過程中還具有促使絲素蛋白結晶的能力,且這種能力以使絲素蛋白向Silk Ⅱ轉變為主。