基于網絡藥理學和細胞實驗探究鹽酸藥根堿抗酒精性肝炎的作用機制

陳心雨，趙冰潔，鄭浩東，賈愛亭，張志君

湖北科技學院藥學院（湖北咸寧 437100）

酒精性肝炎（alcoholic hepatitis, AH）是酒精性肝病的一種分支，主要表現為黃疸和不斷加重的炎癥肝損傷[1]。AH 病程長且易復發，可能誘發各種復雜癥狀，酒精依賴度高的AH 患者生活質量和健康狀況將大大下降。長期大量飲酒可導致嚴重肝損傷，并逐漸發展為AH[2]。我國尚缺乏全國性酒精性肝病的流行病學資料，但地區性流行病學調查結果顯示，近年來我國飲酒人群比例和酒精性肝病患病率均呈上升趨勢，一般人群酒精性肝病患病率為15%～20%。AH 已成為我國最主要的慢性肝病之一，極大地威脅肝臟健康，若患者未得到及時治療，可能轉變為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌[3]。煙草、病毒感染、遺傳因素等也是AH 的主要誘因[4]。AH 的發展進程與氧化應激密切相關，肝細胞內環境的氧化平衡遭到破壞，導致氧化應激信號分子混亂，從而引發肝臟脂肪積累，變異的脂毒素刺激氧化應激，對肝細胞形成二次打擊[5]。酒精在肝臟內能被氧化為乙醛，進一步激活肝臟星狀細胞，從而對肝細胞產生毒性[6]。酒精攝入也可能破壞肝細胞內鈣平衡，誘發內質網應激，加速肝臟氧化應激損傷和炎癥反應。

鹽酸藥根堿（jatrorrhizine hydrochloride,JH），又名藥根堿鹽酸鹽，為復方二妙顆粒中黃柏的主要組成元素之一[7]。研究表明，JH 具有抗炎、抗菌、降血糖、保護神經、抗心律失常及調節脂肪細胞糖脂代謝等作用[8-12]。目前臨床實踐尚未找到AH 有效的治療方法，其發病原因復雜且不斷變化，很大程度上妨礙了新藥研制工作[13]。因此，尋找并研究能有效治療AH 的藥物，以延緩或阻止肝硬化和肝癌等肝病的發展具有重要意義。JH 對AH 的預防效果尚未明確，網絡藥理學通過研究生物分子網絡的結構和功能來理解中藥的藥效，并將網絡生物學的觀念和方法應用于中藥藥理學的研究，這為深入研究JH 是否能對AH產生療效及其機制原理提供了新視角[14-15]。本研究基于網絡藥理學和體外細胞實驗，探討JH 對AH 的關鍵靶點及其可能的作用機制，以期為AH的治療提供新的研究路徑及參考。

1 資料與方法

1.1 網絡藥理預測及分子對接

1.1.1 JH靶點篩選

以“jatrorrhizine hydrochloride”為關鍵詞，通過PubMed 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找該藥物成分，通過SWISS 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）查找JH 靶點。每個目標蛋白的名字均已通過UniProt 數據庫校驗并得到了JH 可能的目標名稱。

1.1.2 AH靶點篩選

以“Alcoholic Hepatitis”為關鍵詞，在GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org）和OMIM 數據庫（http://www.omim.org）中查找AH相關靶點。根據GeneCards 數據庫，靶點與病癥間的緊密度與Relevance score 值呈正比，篩選與整合OMIM 數據庫的靶點后剔除重復項，獲取AH 的作用靶點，接著將這些靶點與JH 關聯靶點進行交集，并通過韋恩圖加以呈現，從而找出JH治療AH 的關鍵靶點。

1.1.3 JH靶點網絡及蛋白質互作網絡構建與拓撲學分析

借助STRING 數據庫設立藥物與疾病之間共享靶點蛋白質的交互關系，利用Cytoscape 3.9.0 軟件構建蛋白質互作網絡（protein-protein interaction network, PPI），線的密集程度代表其影響深遠程度，然后對其進行拓撲分析，并計算度數、緊鄰中心度和中介中心度作為過濾標準，通過這些標準篩選出關鍵目標，對其按照數值高低進行排列，數值越高，越能突顯該目標的關鍵性。

1.1.4 GO功能富集與KEGG通路富集分析

利用DAVID 平臺（https://david.ncifcrf.gov/）以輸入的JH 和AH 的交互作用為靶點，進行基因本體（gene ontology, GO）功能分析以研究JH和AH 相互影響的基因靶點，分析涵蓋生物過程（biological process, BP）、分子功能（molecular function, MF） 及細胞組成（cellular component,CC）。利用P＜0.05 的判別規則，挑選排名前十的項目繪制柱狀圖。同時進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）路徑富集分析，以P＜0.05 作為富集顯著性的篩選條件，確定JH 治療AH 的主導路徑。最后，按照P＜0.05 的準則，選取前20 個信號路徑制作氣泡圖。

1.1.5 JH與關鍵作用靶點分子對接

選擇PDB 數據庫（https://www.rcsb.org）中的關鍵活性成分及主導的目標分子進行對接。利用AutoDock Vina 1.5.6 軟件進行JH 與主要作用對象的分子對接，優化最低的結合能力方式進行下一步分析。利用Autodocking 軟件執行分子對接操作，運用PyMOL 軟件解讀分子對接結果，并進行可視化展示和處理。

1.2 細胞實驗材料及驗證方法

1.2.1 細胞和試劑

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 由湖北科技學院公共平臺贈送，JH（純度不低于98%）購自上海源葉公司，不低于97%純度的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）購自美國Sigma-Aldrich公司，小鼠TNF-α 和IL-6 ELISA 試劑盒購自上海酶聯公司，DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2.2 細胞培養

將RAW264.7 巨噬細胞在37℃、5%的CO2環境下，利用含有10%的胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM 培養液進行培育。

1.2.3 JH對RAW264.7細胞活力的影響

將RAW264.7 細胞按每孔8 000 個細胞的密度分布在96 孔板上，并讓其在4 h 內附著在孔壁。隨后，注入濃度為0、5、25、50、75 和100 μM的JH 于RAW264.7 細胞，并持續處理24 h。然后，在DMEM 培養液中混入MTT 試劑，并將其置于37℃的細胞孵化箱中孵化4 h。接下來，采用MTT檢測法檢測24 h 處理后JH 對RAW264.7 細胞增殖的影響，并在450 nm 的光波下使用酶標儀測定光密度（optical density, OD）。

1.2.4 體外炎癥模型建立

將LPS 粉末用配置好的DMEM 配成1 mM 的LPS 母液，隨后加入培養基，濃度稀釋為20 μM，將含有LPS 的培養基加入至細胞培養皿中培養24 h，誘導RAW264.7 細胞向M1 型巨噬細胞轉化。

1.2.5 細胞分組與處理

選取發育良好的RAW264.7 細胞進行分組，包括基礎對照組、實驗模型組（LPS 組）和JH 低度、中度、高度濃度組。其中對照組不給藥，LPS組按1.2.4 部分的方法處理，JH 組先以LPS（20 μM）刺激24 h 后，再分別給予50 μM（SK50）、75 μM（SK75）、100 μM（SK100）3 種濃度的JH。

1.2.6 利用ELISA技術對RAW264.7細胞上清液中的TNF-α和IL-6的濃度進行測量

將密度為每孔有8 000 個RAW264.7 細胞栽培于96 孔板上，讓細胞附壁的過程持續4 h 后，按照1.2.5 部分的步驟對RAW264.7 細胞施加藥品處理，每組均有3 個重復的孔。完成處理后，收集每組細胞的上層溶液，并依照ELISA 試劑盒的使用方法測定上層溶液中的TNF-α 和IL-6 濃度。

1.3 統計學方法

采用Image J 和Graphpad Prism 8.0 軟件處理和分析數據，實驗共執行3 次，并對各組數據進行t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 JH抗AH作用靶點

如圖1 所示，將篩選出的71 個JH 作用靶點和6 410 個AH 靶點通過韋恩圖取交集，獲得28 個共同交集靶點，共呈現56 條邊，30 個節點，見圖2。

圖1 JH與AH靶點交集韋恩圖Figure 1. Venn diagram of intersection of targets between JH and AH

圖2 JH抗AH的靶點網絡Figure 2. Target network of JH against AH

2.2 共同靶點PPI網絡

JH 抗AH 的PPI 網絡見圖3，包含25 個節點和56 條邊，PPI 網絡中度值排名前25 位的靶點見圖4。在度值＞2、緊鄰中心度＞0.005 和中介中心度＞0.003的基礎上選取核心目標構建網絡，借助網絡拓撲進行分析，找出了25 個關鍵目標，見表1。排名前10 位的基因按MCC 算法評分由高到低的順序依次為ESR1、NT5E、PGR、PIK3CA、PDE4D、ATM、ITPR1、PDE5A、PRKDC和PDE4A。

表1 JH抗AH核心作用靶點的拓撲學參數Table 1. Topological parameters of the core target of JH against AH

圖3 JH抗AH的PPI網絡Figure 3. PPI network of JH against AH

圖4 JH抗AH作用核心靶點網絡Figure 4 The core target network of JH against AH

2.3 GO功能富集分析

圖5 展示了GO 功能富集分析中前10 個富集項目，這些目標點涉及多種BP，包含信號傳遞、反應缺氧、cAMP 的代謝分解；同時也與細胞膜、質膜、胞質溶質、細胞核周邊區域等CC 有關；從MF 角度看，它們包括了3,5,-環核苷酸磷酸二酯酶活性、3,5,-環腺苷酸磷酸二酯酶活性、磷酸腺肌醇-3-激酶等。

圖5 JH抗AH的GO功能富集分析Figure 5. GO enrichment analysis of JH against AH

2.4 KEGG通路富集分析

JH 抗AH 的KEGG 路徑富集分析結果見圖6，根據P值大小排列，展示了最相關的前20 個通路富集結果，cAMP 信號通道（cAMP signaling pathway）、雌激素信號通道（estrogen signaling pathway）以及嘌呤代謝（purine metabolism）等路徑富集狀況較豐富。

圖6 JH抗AH的KEGG通路富集分析Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis of JH against AH

2.5 JH與核心靶點的分子對接分析

將JH與ESR1核心靶點的分子進行對接操作，結合能量低表示這個分子對接更穩定。結合能低于-5.0 kcal·mol-1，說明配體與受體的自我結合有較強的親和性。利用PyMOL 軟件可視化展示對接后的結果，見圖7。

圖7 JH與ESR1分子對接復合物成鍵信息三維圖Figure 7. Three-dimensional diagram of bonding information between JH and ESR1 molecular docking complex

2.6 細胞體外實驗結果

2.6.1 JH對RAW264.7巨噬細胞活力的影響

在5～100 μM 的濃度區間，JH 對RAW264.7巨噬細胞無任何副作用。當濃度達到100、75 和50 μM 時，JH 能刺激RAW264.7 巨噬細胞生長。因此，本研究選擇這三個濃度分別作為JH 的高、中、低濃度參考值，見圖8。

圖8 JH對RAW264.7巨噬細胞增殖的影響Figure 8. Effect of JH on proliferation of RAW264.7 macrophages

2.6.2 JH對炎癥模型細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6分泌的影響

與對照組相比，LPS 組RAW264.7 M1 型巨噬細胞關聯的促炎細胞因子TNF-α 和IL-6 的分泌顯著增加（P＜0.05），見圖9。與LPS 組相比，JH 組細胞上清液中的TNF-α 和IL-6 促炎因子分泌均降低（P＜0.05）。隨著JH 濃度提高，JH組TNF-α 和IL-6 的分泌也逐漸降低（P＜0.05）。

圖9 JH處理24 h對細胞上清中各炎癥因子表達的影響Figure 9. Effect of JH treatment for 24 h on the expression of various inflammatory factors in the cell supernatant

3 討論

隨著我國經濟社會的發展，人們的生活水平和飲食習慣有所改變，尤其是酒精消費量穩步升高，AH 的發病數量也隨之逐年增加，已成為肝臟疾病的主要死亡原因。深入探究AH 的病因及防治方法對社會具有深遠意義，應得到更為廣泛的關注和重視[16]。

本研究首先基于TCMSP 數據庫篩選JH 的成分靶點，再通過GO 富集與KEGG 通路分析，得到了25 個JH 治療AH 的關鍵靶點，說明JH可通過多個靶點發揮抗炎作用。對JH 抗AH 的核心基因進行了GO 和KEGG 富集分析，結果顯示，這些關鍵基因主要關聯了信號傳輸、缺氧反應、G 蛋白偶聯受體信號路徑、3,5-環核苷酸磷酸二酯酶功能、3,5-環腺苷酸磷酸二酯酶功能等，主要影響的病理途徑包括雌激素信號途徑、嘌呤代謝和cAMP 信號途徑等。此外，本研究利用STRING 數據庫建立PPI 網絡中的相互作用目標，發現了與AH 發病最密切相關的10 個基因，分別為ESR1、NT5E、PGR、PIK3CA、PDE4D、ATM、ITPR1、PDE5A、PRKDC和PDE4A。

ESR1是一種關于AH 疾病具有極高幾率降低表達的基因，也是一種依賴配體的轉錄因子。它在肝臟內部結合雌激素及雌激素受體（尤指ESR1），能有效地緩解肝臟纖維化、延緩肝細胞死亡，同時抑制腫瘤細胞增長，這揭示了ESR1表達減少可能導致肝病的發生發展。竇橙云探討了通過檢測ESR1、DNMT3b和CDH1基因起始子的甲基化程度，早期乙型肝炎相關性肝癌中ESR1基因啟動子甲基化情況是否能成為評估乙型肝炎肝衰竭患者短期28 天生存現狀的生物學指標的可能性[17]。

炎癥反應的功能為觸發并釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子及細胞因子，LPS 刺激巨噬細胞用于模仿人體在某一元素影響下產生的炎癥反應。IL-6、TNF-α 等炎癥因子在炎癥產生與發展的進程中起了重要作用[18-21]。研究證實，TNF-α 是TNF 家族中起主導作用的一種炎癥傳遞物質，主要在脂肪細胞和（或）周圍組織中形成，能激發活性氧產生和各類轉錄調節途徑的相關機制，從而引起特定組織的炎癥反應[22]。

體外實驗證實，當JH濃度為50、75和100 μM時，可以促進RAW264.7 巨噬細胞增殖。ELISA 實驗數據顯示，與對照組相比，LPS 組RAW264.7 細胞M1 型巨噬細胞相關炎性細胞因子TNF-α 和IL-6 的產生顯著增多。然而，相對于LPS 組，JH組細胞的上清液中炎癥因子TNF-α 和IL-6 的產生明顯降低，且隨著JH 濃度增高，其降低趨勢更為明顯。該結果初步表明，在炎癥模型細胞中，JH可以調控M1極化，可能是治療AH的潛在藥物。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學探索JH的靶點，并發掘了治療AH 的潛在靶點，通過PPI 網絡獲得了JH 治療AH 的關鍵基因，為臨床應用JH 治療AH 提供了一定的參考。ESR1為治療AH 的潛在靶點，但本研究僅利用分子對接技術驗證，后續可進一步通過蛋白印跡法、qPCR、敲低等生物學技術加以驗證，并通過動物實驗進一步探究JH 治療AH 的作用機制。