基于生物信息學探究NR1H4在慢性萎縮性胃炎及藥物預測中的作用

彭曉婷 王文素 何典城 詹亞梅 游紹偉

[摘要]?目的?通過生物信息學方法獲得慢性萎縮性胃炎（chronic?atrophic?gastritis，?CAG）的差異基因，預測治療CAG的小分子藥物。方法?通過基因表達綜合（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數據庫獲取2份CAG芯片（GSE27411、GSE116312）基因表達樣本，利用R語言篩選出CAG差異表達基因，獲得CAG免疫相關基因進行基因本體論（gene?ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）分析。利用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein?interaction，PPI）網絡，篩選出核心基因，進一步研究核心基因的免疫浸潤，預測其小分子化合物，通過MOE2022進行分子對接，通過GEPIA2網站進行生存分析。結果?基于GEO數據庫篩選出差異基因517個。GO富集分析發現主要涉及粒細胞趨化性、白細胞趨化性、中性粒細胞趨化性等生物過程。KEGG富集分析顯示主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、核因子κB信號通路、白細胞介素-17信號通路。PPI網絡篩選前6個核心基因即NR1H4、CCK、CCL20、CXCL1、LCN2、SAA1，通過相關驗證，NR1H4作為核心基因。免疫細胞浸潤分析結果顯示中央記憶CD8?T細胞、效應記憶CD4?T細胞、γδT細胞、自然殺傷細胞、中性粒細胞等免疫細胞可能參與CAG的發生發展，而中性粒細胞與NR1H4呈正相關。分子對接顯示柯里拉京、豆甾醇、梔子苷、桔皮素、鵝去氧膽酸、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯6種小分子藥物與NR1H4有較好的結合力。結論?本研究初步探討CAG的潛在機制，NR1H4作為關鍵基因與中性粒細胞可能在CAG“炎-癌轉化”進程中具有重要意義，可為CAG的“炎–癌轉化”機制研究提供一定的參考依據。

[關鍵詞]?慢性萎縮性胃炎；生物信息學；NR1H4；差異基因；免疫浸潤

[中圖分類號]?R573.32??????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.04.002

Study?on?the?role?of?NR1H4?in?chronic?atrophic?gastritis?and?drug?prediction?based?on?bioinformatics

PENG?Xiaoting1，?WANG?Wensu2，?HE?Diancheng3，?ZHAN?Yamei4，?YOU?Shaowei3

1.The?Second?Clinical?Medical?College，?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang?550002，?Guizhou，?China;?2.Department?of?Cadre?Healthcare，?the?Second?Affiliated?Hospital?of?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang?550003，?Guizhou，?China;?3.Department?of?Gastroenterology，?the?Second?Affiliated?Hospital?of?Guizhou?University?of?Traditional?Chinese?Medicine，?Guiyang?550003，?Guizhou，?China;?4.Department?of?Pharmacy，?Guizhou?Provincial?Peoples?Hospital，?Guiyang?550002，?Guizhou，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?differential?gene?expression?profile?and?small?molecule?drugs?for?chronic?atrophic?gastritis?（CAG）?by?bioinformatics?technology.?Methods?Two?gene?expression?samples?of?CAG?chips?（GSE27411，?GSE116312）?were?obtained?through?the?Gene?Expression?Synthesis?（GEO）?database，?screen?the?differentially?expressed?genes?（DEGs）?of?CAG?by?R?language，?and?CAG?immune-related?genes?were?obtained?for?gene?ontology?（GO）?and?Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes?（KEGG）?analysis.?Protein-protein?interaction?（PPI）?network?was?constructed?using?STRING?database?to?screen?out?core?genes，?further?study?on?immune?invasion?of?core?genes?based?on?GSE27411?dataset，?small?molecular?compounds?interacting?with?core?genes?were?predicted，?molecular?docking?was?carried?out?by?MOE2022，?and?survival?analysis?was?carried?out?by?GEPIA2?website.?Results?A?total?of?517?DEGs?were?screened?out?based?on?GEO?database.?GO?function?enrichment?analysis?found?that?it?mainly?involved?in?granulocyte?chemotaxis、leukocyte?chemotaxis?and?neutrophil?chemotaxis?biological?processes.?KEGG?pathway?enrichment?analysis?showed?that?it?mainly?involved?in?cytokine-cytokine?receptor?interaction、nuclear?factor?kappa?B?signaling?pathway、interleukin-17?signaling?pathway.?Six?key?genes?of?NR1H4、CCK、CCL20、CXCL1、LCN2、SAA1?were?obtained?by?PPI?network，?through?relevant?verification，?NR1H4?was?regarded?as?the?core?gene.?Immune?cell?infiltration?analysis?showed?that?central?memory?CD8?T?cell、effector?memeory?CD4?T?cell、gamma?delta?T?cell、natural?killer?T?cell、neutrophil?and?other?immune?cells?may?be?involved?in?the?development?of?CAG，?and?the?neutrophil?was?positively?correlated?with?NR1H4.?It?was?predicted?that?six?small?molecular?drugs，?corilagin，?stigmasterol，?geniposide，?tangeretin，?chenodeoxycholic?acid?and?epigallocatechin?3-gallate，?have?good?binding?force?with?NR1H4.?Conclusion?The?potential?mechanism?of?CAG?is?preliminarily?explored?in?this?study，?the?key?gene?of?NR1H4?and?neutrophil?may?play?an?important?role?in?the?“inflammatory?cancer?transformation”?process?of?CAG，?which?can?provide?a?certain?reference?for?the?study?of?the?“inflammatory?cancer?transformation”?mechanism?of?CAG.

[Key?words]?Chronic?atrophic?gastritis;?Bioinformatics;?NR1H4;?Differentially?expressed?genes;?Immune?infiltration

慢性萎縮性胃炎（chronic?atrophic?gastritis，CAG）是指胃腺丟失，伴或不伴化生或假幽門腺化生的一種慢性炎癥性胃腸疾病，在胃“炎-癌轉化”進展中發揮重要作用，屬胃癌前狀態[1]。CAG無特異性臨床表現，部分患者可無任何癥狀，部分患者表現為持續或反復發作性上腹痛、腹脹和飽脹感，可伴焦慮、睡眠障礙等心身疾病，嚴重影響日常生活，目前治療CAG主要以根除幽門螺桿菌（helicobacter?pylori，Hp）、抑酸、補充葉酸及中醫藥等治療為主，總體療效欠理想[2]。長期CAG有較大風險進展為胃癌，因此，探索CAG發病機制，尋找新的治療靶點，預測相關分子標志物及新的治療手段對防控“炎-癌轉化”具有重要意義。生物信息分析可預測基因與分子機制的聯系，初步篩選與疾病發生發展相關的關鍵基因，為疾病的機制研究提供新的靶標和思路。本研究基于生物信息學獲得CAG的差異基因，并探索新的治療手段。

1??資料與方法

1.1??數據獲取

從美國生物技術信息中心基因表達綜合（Gene?Expression?Omnibus，GEO）數據庫（https：//www.ncbi.?nlm.nih.gov/geo/）收集CAG相關數據，獲得訓練集GSE27411中6例CAG患者和6例健康對照（healthy?control，HC）的基因表達樣本及驗證集GSE116312中3例CAG患者和7例HC的基因表達樣本。從Immport數據庫（https：//www.immport.org/）中下載免疫相關基因，共獲得1793個。

1.2??差異基因表達分析

使用R軟件（版本4.2.20）中limma程序包分析GSE27411數據集的差異基因，其中以P<0.05且|LogFC|>1為條件進行篩選，并將排序靠前的結果進行可視化分析。同時使用Pheatmap程序包制作差異基因熱圖及使用ggplot2程序包制作火山圖。

1.3??免疫相關基因獲取及基因集富集分析

將差異基因與免疫相關基因取交集，即為CAG中的免疫相關基因，制作韋恩圖，通過R軟件用clusterProfiler包進行基因本體論（gene?ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto?Encyclopedia?of?Genes?and?Genomes，KEGG）通路富集分析，設置P值Cutoff=0.05，Q值Cutoff=0.05，并將排序靠前的結果進行可視化分析。

1.4??蛋白質-蛋白質相互作用網絡制作及核心基因的獲取驗證

將共同基因導入STRING11.5分析平臺（https：//?cn.string-db.org/），物種設置為“Homo?sapiens”（人類），構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-?protein?interaction，PPI）網絡并進行可視化。將結果以TSV格式導入Cytoscape3.8.2軟件，構建PPI網絡圖，采用Cytoscape的cytoHubba插件，依據Betweenness計算方法進行拓撲結構分析、篩選核心基因。同時基于驗證集GSE116312采用Wilcoxon檢驗進行表達差異驗證，驗證通過即為核心基因。

1.5??免疫浸潤分析

基于GSE27411數據集進一步研究核心基因免疫浸潤，使用GSVA程序包中ssGSEA算法可量化樣本中免疫細胞比例。通過ssGSEA算法對GSE27411數據集進行免疫浸潤分析，采用Wilcoxon檢驗CAG與HC之間免疫浸潤表達的差異，采用Ccrrplot程序包Spearman檢驗免疫相關基因與28個浸潤免疫細胞的相關性。

1.6??藥物預測、分子對接驗證、生存分析

通過HERB數據庫預測核心基因相互作用的小分子化合物，將預測小分子化合物進行分子對接。NR1H4的核心靶蛋白晶體結構從RCSB數據庫（https：//www.rcsb.org/pdb）下載，而小分子化合物2D結構從PubChem數據庫（https：//pubchem.?nc-bi.nlm.nih.gov/）下載。MOE2022軟件進行分子對接并計算靶蛋白和小分子之間的相互作用能量。對接前，用MOE2022軟件自帶QuickPrep設置處理受體蛋白，包括加氫、質子化等。使用MOE2022自帶Energy?Minimize設置對活性成分進行能量最小化。分子對接以MOE2022軟件General模型分析配體和受體的結合特性，得分越低，配體與靶蛋白的結合越穩定。使用GEPIA2網站預測NR1H4在胃癌中的無病生存期以評價治療后療效。

2??結果

2.1??數據處理

GSE27411數據集中6例CAG患者和6例HC繪制差異基因火山圖和熱圖，篩選出上調基因384個，下調基因133個，見圖1。

2.2??免疫相關基因獲取及基因集富集分析

差異基因與免疫相關基因取交集得到69個CAG中的免疫相關基因，并進行KEGG和GO分析，見圖2。GO富集分析主要涉及粒細胞趨化性、白細胞趨化性、中性粒細胞趨化性等生物過程。KEGG中存在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、核因子κB（nuclear?factor-κB，NF-κB）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）等信號通路。

2.3??PPI網絡及核心基因

CAG免疫相關基因PPI網絡節點68個，邊128條，平均度值3.76，圖中節點的大小及其顏色的深淺與其度值成正比，見圖3A。采用Cytoscape的cytoHubba插件，基于Betweenness計算取前6個核心基因即NR1H4、CCK、CCL20、CXCL1、LCN2、SAA1，見圖3B。基于驗證集GSE116312驗證，其中只有NR1H4提示具有統計學意義（P<0.05），即以NR1H4為本研究的核心基因，見圖3C。

2.4??免疫浸潤分析

使用ssGSEA算法估計GSE27411數據集中CAG患者和HC中28個免疫細胞的比例。研究發現GSE27411數據集中CAG患者和HC的中央記憶CD8?T細胞、效應記憶CD4?T細胞、γδT細胞、自然殺傷T細胞及中性粒細胞比較差異均有統計學意義（P<0.05），見圖4A；上述免疫細胞可能參與CAG的發生發展，其中中性粒細胞與NR1H4呈正相關（r>0.6，P<0.05），見圖4B。

2.5??藥物預測、分子對接及無病生存期

通過HERB數據庫預測特征基因NR1H4潛在小分子化合物，獲得柯里拉京、豆甾醇、梔子苷、桔皮素、鵝去氧膽酸、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯6個小分子化合物。分子對接能量低的配對是NR1H4-柯里拉京（–7.3663kcal/mol），能量最高的配對是NR1H4-豆甾醇（–6.298kcal/mol），全部對接能量值均<–5kcal/mol，提示有良好的對接活性，見表1。從GEPIA2網站獲得NR1H4在胃癌患者中的無病生存期結果，NR1H4低表達組胃癌患者的無病生存期顯著長于NR1H4高表達組（P<0.05），見圖5。

3??討論

胃癌是全球第六大常見癌癥，第四大癌癥死亡原因，長期慢性炎癥被認為是腫瘤發展的標志[3]。CAG作為胃“炎-癌轉化”中的重要一環受多種因素的影響，但其發生機制目前仍未有確切的定論，多種因素均可能參與其中，基因的調控作用或許是其發生發展的重要環節。

本研究通過GEO數據庫篩選出CAG相關數據集，最終篩選出CAG差異表達基因進行GO分析和KEGG分析。GO主要富集于抗微生物體液反應、粒細胞趨化性、白細胞趨化性、髓樣白細胞遷移、中性粒細胞趨化性等生物過程；KEGG分析主要涉及

細胞因子-細胞因子受體相互作用、NF-κB信號通路、IL-17信號通路等炎癥免疫調節相關通路。細胞因子-細胞因子受體相互作用通路包含15個基因中的7個，其中轉化生長因子-β是參與胃癌浸潤、轉移的重要刺激因子，其功能表現為抑制免疫系統殺傷腫瘤細胞，并在CAG、腸化生、胃癌中表達上調[4]。NF-κB在炎癥反應、細胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，在正常胃黏膜、慢性萎縮性胃炎、胃癌中均為陽性表達，且逐漸增強[5-6]。通過其上、下游的NF-κB蛋白表達調控胃黏膜上皮細胞的凋亡與增殖，從而逆轉胃“炎-癌轉化”發生[7]。IL-17信號通路參與炎癥反應、自身免疫疾病和腫瘤的發生發展，可增強中性粒細胞的浸潤及促進新生血管生成導致腫瘤的產生，還可激活NF-κB信號通路，促進炎癥因子分泌，改變腫瘤的炎癥微環境，促進胃癌細胞的遷移和侵襲[8-10]。以上提示CAG的發生發展與多種炎癥途徑和免疫相關。

在PPI網絡中，NR1H4作為核心基因可能在CAG病程中，甚至在“炎-癌轉化”病程中發揮重要作用。NR1H4又稱法尼酯衍生物X受體（Farnesoid?X?receptor，FXR），相關研究表明FXR激活可通過調節NF-κB通路降低炎癥反應[11-12]。Li等[13]研究發現脫氧膽酸通過激活FXR-NF-κB通路，參與正常胃上皮細胞中CDX2和MUC2的異位表達，從而導致胃黏膜腸化生。

免疫細胞浸潤分析結果提示，中性粒細胞與NR1H4呈正相關。中性粒細胞是浸潤最多的免疫細胞，有研究顯示腫瘤微環境中浸潤的嗜中性粒細胞可削弱T細胞免疫，促進胃癌的發展，活化的中性粒細胞與胃癌進展相關，且與患者存活率呈負相關[14]。中性粒細胞以CXC趨化因子依賴性方式被吸引到胃癌環境中，中性粒細胞、B7-H2可能是CD4+?T細胞產生IL-17A的主要驅動因素之一，參與胃癌的發生發展[15]。

通過HERB數據庫查詢獲得6種特異性針對NR1H4的小分子化合物。分子對接結果顯示其均與核心基因NR1H4有較好的親和力。柯里拉京具有抗炎、保肝、抗腫瘤活性，對正常細胞毒性較小，能抑制胃癌細胞增殖、凋亡和自噬，發揮較強的抗腫瘤活性[16-17]；豆甾醇具有很強的抗炎和抗氧化應激作用，可介導AMP活化蛋白激酶活化，并通過調節NF-κB或核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白通路發揮抗炎作用[18-19]；梔子苷具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性，通過抑制相關炎癥信號通路，減少炎癥反應及發揮抗腫瘤作用[20-21]；桔皮素可通過抑制Notch-1信號轉導和miR-410表達上調提高胃癌細胞的輻射敏感性及抑制輻射誘導的上皮–間充質轉化和轉移[22]；表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可調節多種關鍵的細胞信號通路，發揮抗炎、抗增殖和細胞凋亡誘導作用[23-26]；鵝去氧膽酸是膽汁酸受體和轉錄因子FXR最有效的天然激動劑，朱晗等[27]發現鵝去氧膽酸可降低BV2細胞中炎癥因子IL-6、腫瘤壞死因子-α和IL-1β的表達，抑制NF-κB信號通路及Akt的激活。基于藥理分析，認為以上小分子化合物可能是抑制CAG及其“炎-癌轉化”進程中的關鍵因素。

綜上所述，本研究通過生物信息學篩選出與CAG密切相關的基因NR1H4，對其進行深入研究可有助于進一步闡釋CAG發生、發展的機制及小分子藥物的預測，為藥物治療提供潛在靶點，也為病理篩查提供理論依據。但本研究尚缺少基礎研究數據的驗證，后續將繼續收集臨床樣本，對篩選出的關鍵基因進行深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] BANKS?M，?GRAHAM?D，?JANSEN?M，?et?al.?British?Society?of?Gastroenterology?guidelines?on?the?diagnosis?and?management?of?patients?at?risk?of?gastric?adenocarcinoma[J].?Gut，?2019，?68（9）：?1545–1575.

[2] 房靜遠，?杜奕奇，?劉文忠，?等.?中國慢性胃炎診治指南（2022年，?上海）[J].?胃腸病學，?2022，?27（4）：?193–224.

[3] SUNG?H，?FERLAY?J，?SIEGEL?R?L，?et?al.?Global?cancer?statistics?2020：?GLOBOCAN?estimates?of?incidence?and?mortality?worldwide?for?36?cancers?in?185?countries[J].?CA?Cancer?J?Clin，?2021，?71（3）：?209–249.

[4] 邵建富，?李興海，?馬文杰，?等.?TGF-β1對胃癌細胞增殖、凋亡及miR-302a和AKT通路的影響[J].?醫學分子生物學雜志，?2020，?17（1）：?46–51.

[5] ECHIZEN?K，?HORIUCHI?K，?AOKI?Y，?et?al.?NF-κB-?induced?NOX1?activation?promotes?gastric?tumorigenesis?through?the?expansion?of?SOX2-positive?epithelial?cells[J].?Oncogene，?2019，?38（22）：?4250–4263.

[6] 裴蓓，?劉云，?宋標，?等.?脾胃培源方治療慢性萎縮性胃炎脾胃虛弱證患者療效及對胃黏膜三葉因子2、核因子-κB表達的影響[J].?中國中醫藥信息雜志，?2023，?30（3）：?121–125.

[7] 游紹偉，?易旭，?趙琦，?等.?基于NF-κB信號通路探討萎胃通調湯對大鼠慢性萎縮性胃炎的作用機制[J].?中國實驗方劑學雜志，?2023，?29（2）：?88–97.

[8] YU?H?Y，?WU?H?W，?ZHENG?F?P，?et?al.?Gene-regulatory?network?analysis?of?ankylosing?spondylitis?with?a?single-cell?chromatin?accessible?assay[J].?Sci?Rep，?2020，?10（1）：?19411–19422.

[9] 陳錦霞，?單保恩，?李清靖，?等.?IL-17及其相關分子在胃癌組織中的表達和相關性分析[J].?腫瘤學雜志，?2019，?25（6）：?537–540.

[10] 宋靜靜，?單保恩，?王浩，?等.?外源性IL-17對胃癌細胞生物學特性的影響及其機制研究[J].?中國腫瘤，?2018，?27（11）：?867–873.

[11] PANG?J，?FENG?J?N，?Ling?W，?et?al.?Commentary：?Can?FXR?serve?as?a?potential?target?for?COVID-19?prevention？[J].?Acta?Pharm?Sin?B，?2023，?13（4）：?1786–1788.

[12] ZHAO?Y，?WEI?S，?CHEN?L，?et?al.?Primary?biliary?cholangitis：?Molecular?pathogenesis?perspectives?and?therapeutic?potential?of?natural?products[J].?Front?Immunol，?2023，?14：?1164202.

[13] LI?S，?CHEN?X，?ZHOU?L，?et?al.?Farnesoid?X?receptor?signal?is?involved?in?deoxycholic?acid-induced?intestinal?metaplasia?of?normal?human?gastric?epithelial?cells[J].?Oncol?Rep，?2015，?34（5）：?2674–2682.

[14] WANG?T?T，?ZHAO?Y?L，?PENG?L?S，?et?al.?Tumour-?activated?neutrophils?in?gastric?cancer?foster?immune?suppression?and?disease?progression?through?GM-CSF-PD-?L1?pathway[J].?Gut，?2017，?66（11）：?1900–1911.

[15] SHAN?Z?G，?CHEN?J，?LIU?J?S，?et?al.?Activated?neutrophils?polarize?protumorigenic?interleukin-17A-?producing?T?helper?subsets?through?TNF-α-B7-H2-?dependent?pathway?in?human?gastric?cancer[J].?Clin?Transl?Med，?2021，?11（6）：?e484.