肝龍膠囊對Balb/c裸鼠腋下移植瘤的影響

楊逸鑫 王彥權 彭芳

[摘要]?目的?探討肝龍膠囊對Balb/c裸鼠腋下移植瘤的影響。方法?將人肝癌敏感株BEL-7402接種于裸鼠腋下造模，造模成功后將其分為模型組、索拉非尼組、CII-3組、脫脂膏組、肝龍膠囊高、中、低劑量組，正常裸鼠為空白組，連續給藥14d。比較各組的抑瘤率、臟器指數、生化指標、缺氧微環境相關蛋白及其mRNA表達水平。結果?各藥物治療組均能抑制腫瘤生長，其中肝龍膠囊中劑量組的平均抑瘤率最高；與模型組相比，各藥物治療組裸鼠的心臟指數、腎臟指數、肝臟指數、肺臟指數均有所升高，脾臟指數均有所下降，但多數變化不大；各項生化指標顯示，肝龍膠囊安全性良好，并未出現明顯的組織損傷；索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組裸鼠的低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible?factor-1α，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）和血管內皮生長因子受體2（vascular?endothelial?growth?factor?receptor?2，VEGFR2）的mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.05）；免疫組織化學結果顯示，各藥物治療組的VEGFR2、HIF-1α、VEGF、Ki-67和CD31蛋白表達均表現出不同程度的抑制，其中以索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組及CII-3組的抑制作用較強。結論?肝龍膠囊可有效抑制Balb/c裸鼠腋下移植瘤的生長，并下調移植瘤中缺氧微環境相關蛋白及其mRNA表達水平。

[關鍵詞]?肝龍膠囊；肝癌；腋下移植瘤；美洲大蠊

[中圖分類號]?R965.2??????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.04.018

Effect?of?Ganlong?capsule?on?axillary?graft?tumour?in?Balb/c?nude?mice

YANG?Yixin1，2，?WANG?Yanquan1，2，?PENG?Fang1，2

1.College?of?Pharmacy，?Dali?University，?Dali?671000，?Yunnan，?China;?2.Yunnan?Provincial?Key?Laboratory?of?Entomological?Biopharmaceutical?R&D，?Dali?671000，?Yunnan，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?Ganlong?capsule?on?axillary?graft?tumour?in?Balb/c?nude?mice.?Methods?BEL-?7402，?a?human?hepatocellular?carcinoma?sensitive?strain，?was?inoculated?into?the?armpit?of?nude?mice?for?modeling.?After?successful?modeling，?mice?were?divided?into?model?group，?sorafenib?group，?CII-3?group，?degreasing?cream?group，?and?Ganlong?capsule?high-dose，?medium-dose?and?low-dose?groups，?and?normal?nude?mice?were?included?in?blank?group.?All?groups?were?given?continuous?administration?for?14?days.?The?tumor?inhibition?rate，?organ?index，?biochemical?index，?anoxic?microenvironment?related?proteins?and?their?mRNA?expression?levels?were?compared?among?all?groups.?Results?All?drug?treatment?groups?could?inhibit?tumor?growth，?and?the?average?tumor?inhibition?rate?was?the?highest?in?Ganlong?capsule?medium-dose?group.?Compared?with?the?model?group，?the?heart?index，?kidney?index，?liver?index?and?lung?index?of?nude?mice?in?all?drug?treatment?groups?were?increased，?and?the?spleen?index?were?decreased，?but?most?of?the?changes?were?little.?Various?biochemical?indexes?showed?that?Ganlong?capsule?was?safe?and?did?not?cause?obvious?tissue?damage.?The?mRNA?expressions?of?hypoxia-inducible?factor-1α?（HIF-1α），?vascular?endothelial?growth?factor?（VEGF）?and?vascular?endothelial?growth?factor?receptor?2?（VEGFR2）?in?sorafenib?group?and?Ganlong?capsule?medium-dose?group?were?significantly?lower?than?those?in?model?group?（P<0.05）.?Immunohistochemical?results?showed?that?all?drug?treatment?groups?showed?different?degrees?of?inhibition?on?VEGFR2，?HIF-1α，?VEGF，?Ki-67?and?CD31?protein?expressions，?among?which?sorafenib?group，?Ganlong?capsule?medium-dose?group?and?CII-3?group?had?stronger?inhibitory?effects.?Conclusion?Ganlong?capsule?can?effectively?inhibit?the?growth?of?axillary?graft?tumour?in?Balb/c?nude?mice，?and?down-regulate?the?expression?level?of?hypoxic?microenvironment?related?protein?and?their?mRNA?in?the?graft?tumor.

[Key?words]?Ganlong?capsule;?Hepatocellular?carcinoma;?Axillary?graft?tumor;?Periplaneta?Americana

肝細胞癌是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴重威脅我國人民的生命和健康[1-3]。2020年，我國肝癌年新發病例達41萬人，占全球45.3%，死亡39.1萬人，占全球47.1%[4-6]。乙型肝炎病毒和（或）丙型肝炎病毒感染、過度飲酒、非酒精性脂肪性肝炎、其他原因引起的肝硬化及有肝癌家族史者均為肝癌高危人群[1]。乙型肝炎是肝癌重要的發病因素，肝纖維化可演變為慢性肝硬化，最終導致肝癌發生。肝龍膠囊是國家藥品監督管理局（National?Medical?Products?Administration，NMPA）批準的治療乙型肝炎的二類中藥新藥，由美洲大蠊提取物研制而成，其主要活性成分為黏氨糖，具有疏肝理脾、活血解毒及抗肝纖維化作用[7]。肝癌的發生與慢性肝炎、肝硬化有關。研究顯示，同樣來源于美洲大蠊的兩種粗提物（CII-3和脫脂膏）對惡性腫瘤有著不錯的療效，由此推測肝龍膠囊可能在治療肝癌方面具有同樣的效果。本研究擬觀察肝龍膠囊是否具有治療肝癌的作用，現將結果報道如下。

1??材料與方法

1.1??實驗動物、細胞、主要藥品及器材

7～9周SPF級Balb/c裸鼠，體質量18～22g，64只，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：430727200101104518。人肝細胞癌敏感細胞株BEL-7402（MXC050）由上海美軒生物科技有限公司提供。美洲大蠊粗提物脫脂膏、美洲大蠊粗提物CII-3由大理大學藥學院提供；肝龍膠囊（批準文號：國藥準字Z20050113，生產單位：昆明賽諾制藥股份有限公司，規格：每粒重0.3g，含美洲大蠊提取物0.15g）；索拉非尼（批號：1017R021）購自北京索萊寶科技有限公司；尿素氮測試盒、超氧化物歧化酶試劑盒、小鼠血清肌酐試劑盒、丙氨酸轉氨酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；聚合酶鏈反應（polymerase?chain?reaction，PCR）逆轉錄試劑盒、PCR熒光試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2??實驗方法

1.2.1??藥液配制??肝龍膠囊、CII-3、脫脂膏用生理鹽水稀釋至實驗所需濃度并過濾后使用；索拉非尼與羧甲基纖維素鈉、甘油混合，配制成濃度為3mg/ml的索拉非尼混懸膠漿備用。

1.2.2??裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分組給藥??Balb/c裸鼠適應性飼養1周后，于左前肢腋下注射含有5×107個BEL-7402細胞株的細胞懸液，其后放置SPF級動物房飼養1周，直至裸鼠腋下腫瘤組織體積達到100mm3。將造模成功的裸鼠分為模型組、索拉非尼組（給予索拉非尼30mg/kg）、CII-3組（給予CII-3?200mg/kg）、脫脂膏組（給予脫脂膏200mg/kg）、肝龍膠囊高、中、低劑量組（分別給予肝龍膠囊360mg/kg、180mg/kg、90mg/kg），同時選取正常裸鼠作為空白組，每組各8只，造模成功后第7天開始按上述給藥劑量進行灌胃給藥（0.1ml/10g），模型組和空白組給予等體積生理鹽水，均連續給藥14d。

1.2.3??對裸鼠腋下移植瘤抑瘤率及臟器指數的影響??實驗結束后頸椎脫位處死裸鼠，摘取心、肝、脾、肺及腎，剝離腋下移植瘤，檢測臟器指數及抑瘤率[8]。抑瘤率（%）=（模型組瘤重–給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%。臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（g）。

1.2.4??對裸鼠生化指標的影響??實驗結束后眼眶靜脈叢取血，按試劑盒說明書檢測各組裸鼠的肌酐清除率、尿素氮、轉氨酶、超氧化物歧化酶水平。

1.2.5??對裸鼠腋下移植瘤缺氧微環境相關蛋白及其mRNA表達水平的影響??實時熒光定量PCR法檢測各組裸鼠腋下移植瘤腫瘤組織缺氧微環境中低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible?factor-1α，HIF-1α）、血管內皮生長因子（vascular?endothelial?growth?factor，VEGF）、血管內皮生長因子受體2（vascular?endothelial?growth?factor?receptor?2，VEGFR2）mRNA表達水平；免疫組織化學染色法檢測各組裸鼠腋下移植瘤缺氧微環境中相關蛋白HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ki-67、CD31的表達水平。

1.3??統計學方法

應用SPSS?18.0軟件對實驗數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析；計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗。數據圖使用Graphpad?Prism?8軟件進行繪制。P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??對裸鼠腋下移植瘤生長的影響

與模型組比較，不同藥物處理后裸鼠的腫瘤瘤重均呈下降趨勢，且索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組的腫瘤瘤重均顯著低于模型組（P<0.05），肝龍膠囊中劑量組的平均抑瘤率最高，見表1。

2.2??對裸鼠腋下移植瘤臟器指數的影響

與模型組相比，各藥物治療組裸鼠的心臟指數、腎臟指數、肝臟指數、肺臟指數均有所升高，脾臟指數均有所下降，多數變化不大，見表2。

2.3??對裸鼠生化指標的影響

與空白組相比，模型組和各治療組裸鼠的尿素氮、肌酐水平均顯著降低（P<0.05）；除脫脂膏組外，各治療組裸鼠的丙氨酸轉氨酶水平均顯著高于空白組（P<0.05）；除肝龍膠囊低、高劑量組外，各治療組裸鼠的天冬氨酸轉氨酶水平均顯著低于空白組和模型組（P<0.05），見表3。

2.4??對裸鼠腋下移植瘤組織缺氧微環境相關蛋白mRNA表達水平的影響

索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組和脫脂膏組裸鼠的HIF-1α?mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.05）；索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組裸鼠的VEGF?mRNA和VEGFR2?mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.05），見表4。

2.5??對裸鼠腋下移植瘤組織缺氧微環境相關蛋白表達的影響

免疫組織化學染色結果顯示：各藥物治療組對VEGFR2、HIF-1α、VEGF、Ki-67和CD31蛋白表達均表現出不同程度的抑制作用，其中以索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組及CII-3組的抑制作用較強，見圖1。

3??討論

腫瘤微環境成分復雜，包含多種細胞及其他非轉化型細胞，其特點是缺氧、低pH值和高還原性，其中缺氧是大多數實體瘤的典型特征[9-11]。腫瘤細胞和腫瘤微環境之間相互影響，在促進腫瘤細胞生長的同時也能抑制免疫細胞的活性[12]。

HIF-1α是腫瘤對缺氧適應性反應的重要觸發因素[13]。研究表明，HIF-1α在肝癌中高度表達，腫瘤組織缺氧越嚴重，HIF-1α表達越高[14-15]。HIF-1α可通過激活下游基因促進腫瘤細胞的生長且抑制細胞凋亡，其在肝癌和基質形成中起重要的轉錄調控作用。

VEGF的表達需要HIF-1α的激活，即使在缺氧的情況下也是如此[16]。VEGFR是特異性結合VEGF的高親和力受體，其亞型VEGFR2在血管內皮的形成中發揮至關重要的作用；它可抑制內皮細胞凋亡，在一定程度上增加血管通透性[17]。研究表明，VEGF與肝癌的發生和發展密切相關，肝癌組織中VEGF陽性表達率顯著高于其他相鄰或非相鄰的實質組織[18]。

本研究結果顯示，各治療組在一定程度上均可抑制裸鼠肝癌移植瘤的生長，提高臟器指數（除脾臟指數外），以索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組效果最好；各項生化指標顯示，肝龍膠囊安全性良好，并未出現明顯的組織損傷；索拉非尼組和肝龍膠囊低、中、高劑量組均可降低裸鼠腫瘤組織中HIF-1α、VEGF和VEGFR2?mRNA的表達量，其中以索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組效果顯著，提示索拉非尼組和肝龍膠囊中劑量組具有下調體內上述3種缺氧微環境相關蛋白mRNA的能力。

免疫組織化學染色結果表明，與模型組相比，各治療組均可抑制裸鼠腋下移植瘤內HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ki-67、CD31蛋白的表達；其中索拉非尼組、肝龍膠囊中劑量組及CII-3組對HIF-1α、VEGFR2、Ki-67蛋白表達的抑制作用效果較好；索拉非尼組對VEGF蛋白表達的抑制效果最優；肝龍膠囊中劑量組和CII-3組對CD31蛋白表達的抑制效果較為顯著，且優于索拉非尼組。

綜上，肝龍膠囊可有效抑制Balb/c裸鼠腋下移植瘤的生長，誘導腫瘤細胞凋亡，且下調裸鼠移植瘤缺氧微環境相關蛋白及其mRNA的表達水平。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

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