基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討芩薊涼血合劑治療便秘作用機制

李鵬，金文琪，李小嘉，胡婕，朱影，郭修田

上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071

便秘是全球常見問題，歐美國家成人功能性便秘患病率為7.9%～8.6%[1]。主要包括排便次數(shù)減少、排便不盡、排便時間延長、便質(zhì)干結(jié)等癥狀[2-3]。便秘和年齡、飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，隨著年齡增長，不僅患病率逐漸增加，患者焦慮心理也逐步加重。便秘分為原發(fā)性與繼發(fā)性，原發(fā)性便秘包括便秘型腸易激綜合征、功能性便秘、慢傳輸便秘及肌肉或神經(jīng)損傷引起的排便障礙，繼發(fā)性便秘可能由代謝紊亂（如高鈣血癥）、藥物（如阿片類藥物）、原發(fā)性結(jié)腸疾病（如結(jié)腸癌、直腸炎）和神經(jīng)系統(tǒng)疾病導致[4-5]。目前，便秘有藥物、非藥物等療法，但藥物依賴性強、遠期復發(fā)率較高[6]。

芩薊涼血合劑是上海市中醫(yī)醫(yī)院臨床應(yīng)用近30年的成藥復方，包括熟地黃、大薊、黃芩、火麻仁、茜草、地榆、槐角、側(cè)柏葉、仙鶴草、甘草，共奏清熱涼血、潤腸通便之功，臨證發(fā)現(xiàn)其不僅可改善早期急性痔出血，還可減少排便時間，緩解便質(zhì)干結(jié)、排便不盡等癥狀[7]。該方治療便秘療效顯著，但作用機制尚未闡明，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探索芩薊涼血合劑治療便秘的活性成分、核心靶點及作用機制，以期為芩薊涼血合劑治療便秘提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 芩薊涼血合劑活性成分及靶點篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18進行篩選，獲取黃芩、火麻仁、熟地黃、側(cè)柏葉、大薊、地榆、茜草、槐角、仙鶴草、甘草的活性成分及靶點，并在UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中明確靶蛋白對應(yīng)的基因名稱與ID。

1.2 便秘潛在靶點篩選

采用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/about）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）及DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/），以“Constipation”為關(guān)鍵詞，以“gene”與“homo sapiens”為限制條件檢索便秘相關(guān)疾病靶點，并挖掘DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）涉及的疾病靶點為補充，刪除重復靶點后建立便秘的疾病靶點庫。

1.3 芩薊涼血合劑-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用BioVenn在線作圖軟件工具平臺（http://www.biovenn.nl/）制作芩薊涼血合劑活性成分靶點與疾病交集靶點韋恩圖，獲取的交集靶點即芩薊涼血合劑治療便秘的潛在作用靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點篩選

將“1.3”中獲取的交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org），選擇“Homo sapiens”，最小相互作用閾值（minimum required interaction score）為0.9，隱藏游離節(jié)點，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)并下載.tsv格式文件，將以上數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.8.1軟件，利用CytoNCA插件進行數(shù)據(jù)分析，計算出節(jié)點的中介中心性（BC）、接近中心性、度中心性（DC）及特征向量中心性（EC）。最后，按照上述4類數(shù)值均大于中位數(shù)篩選，得出核心靶點。將Network及Type數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.8.1軟件構(gòu)建芩薊涼血合劑治療便秘中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析節(jié)點連接度、介度等。采用CytoHubba插件對中藥-活性成分-便秘靶點網(wǎng)絡(luò)進行度值計算，選取排名前5位的關(guān)鍵成分。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

以P＜0.01 為限定條件，利用Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）對核心靶點進行GO 功能與KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括細胞組分（CC）、分子功能（MF）及生物過程（BP）。采用KEGG富集分析獲取芩薊涼血合劑與便秘的共同靶點所富集的信號通路，并以條形圖展示結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 芩薊涼血合劑活性成分篩選結(jié)果

全方共篩選得出活性成分134個，其中側(cè)柏葉7個、大薊7個、地榆9個、茜草13個、槐角6個、仙鶴草5個、火麻仁6個、熟地黃2個、黃芩12個、甘草88個，靶點共289個。

2.2 便秘潛在靶點收集

通過數(shù)據(jù)庫檢索并刪除重復基因后，共得到857個便秘靶點（見圖1），芩薊涼血合劑與便秘交集靶點共216個（見圖2）。

圖1 綜合數(shù)據(jù)庫便秘靶點韋恩圖

圖2 芩薊涼血合劑與便秘交集靶點韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將216個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖3），代表相互作用的邊共823條。

圖3 芩薊涼血合劑治療便秘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點篩選結(jié)果

最終得出55個核心靶點（見圖4），排名前10位的關(guān)鍵基因為：HSP90AA1、STAT3、MAPK3、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、TNF、FOS、IL6。

圖4 芩薊涼血合劑治療便秘核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 核心靶點篩選結(jié)果

采用Cytoscape構(gòu)建芩薊涼血合劑治療便秘-靶點網(wǎng)絡(luò)。圖中共360個節(jié)點、3 167條邊（見圖5）。A1為側(cè)柏葉、大薊共有成分，B1為側(cè)柏葉、地榆、茜草共有成分，C1、C2為側(cè)柏葉、地榆、甘草、槐角、仙鶴草共有成分，D1為大薊、甘草、火麻仁、茜草共有成分，D2為大薊、火麻仁、熟地黃共有成分，E1為地榆、甘草共有成分，E2為地榆、茜草共有成分，F(xiàn)1為槐角、黃芩共有成分，G1為火麻仁、仙鶴草共有成分。CytoHubba插件分析后得出度值排名前5位關(guān)鍵成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇及豆甾醇。

圖5 芩薊涼血合劑治療便秘中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果

對216個交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，分別選取前10位MF、CC、BP條目繪制條形圖。MF包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活動、磷酸酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)因子活性及MAP激酶活性；CC包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復合體、膜閥、囊腔、轉(zhuǎn)錄抑制因子復合體、質(zhì)膜蛋白復合體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合體、髓鞘、紡錘體、血小板α顆粒內(nèi)腔及細胞質(zhì)的核周區(qū)域；BP包括細胞對脂質(zhì)的反應(yīng)、腺體發(fā)育、細胞對化學應(yīng)激的反應(yīng)、對DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、對上皮細胞增殖的調(diào)控、對細胞分化的負調(diào)控、對輻射的反應(yīng)、對縮氨酸的調(diào)控及對miRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。KEGG通路富集分析主要富集在癌癥的途徑、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、化學致癌-受體激活、甲狀腺激素、HIF-1信號通路、PD-L1在腫瘤中的表達與PD-1檢查點通路、鉑類藥物耐藥性、JAK-STAT信號通路及甲狀腺癌（見圖6）。

圖6 芩薊涼血合劑治療便秘靶點GO功能和KEGG通路富集分析

3 討論

治療便秘的西藥如滲透性瀉藥、分泌性瀉藥及糞便膨化劑等，存在不良反應(yīng)較多[8]，長期應(yīng)用后腸道敏感性降低，對藥物耐受性增加，導致藥效變差，嚴重者最終只能選擇手術(shù)治療。芩薊涼血合劑不僅可改善早期急性痔瘡出血，還可改善糞質(zhì)干結(jié)的癥狀，有效緩解便秘，但相關(guān)機制仍未明確[9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探索芩薊涼血合劑治療便秘的作用機制，為后續(xù)芩薊涼血合劑的基礎(chǔ)實驗提供基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，芩薊涼血合劑關(guān)鍵成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等。槲皮素、山柰酚和木犀草素是常見的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎等藥理作用[10]。槲皮素是一種常見的天然黃酮類化合物，通常以糖基化形式存在，可影響多種生理過程及疾病的發(fā)生發(fā)展，包括血壓、免疫功能、神經(jīng)功能、癌癥、衰老等[11-12]。槲皮素在劑量為25 mg/kg、50 mg/kg時可增加腸道推進率、胃泌素、胃動素及P物質(zhì)水平，改善胃腸蠕動，并可通過增加腸道Cajal間質(zhì)細胞標志物水平，如c-kit、干細胞因子SCF、水通道蛋白3（AQP3），緩解由洛哌丁胺導致的便秘[13]。在胃腸道中，槲皮素不僅可穩(wěn)定肥大細胞，抑制組胺及其他化學物質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)小鼠回腸、結(jié)腸的鈣氯通道活性，以劑量依賴性的方式激活氯離子轉(zhuǎn)運，促進大鼠腸內(nèi)液體分泌，從而改善便秘[14-15]。槲皮素可通過調(diào)控mACHRs信號通路改善由洛哌丁胺誘導的大鼠便秘模型，增加大鼠胃腸道運動及黏蛋白分泌，表明槲皮素治療便秘有效[16]。山柰酚可通過抑制Toll 樣受體4（TLR4）、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）和核因子-κB（NF-κB）的激活，減輕脂多糖誘導的大鼠腸道微血管內(nèi)皮細胞（RIMVECs）炎癥介質(zhì)釋放，包括腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）[17]。還可改善豬腸上皮細胞的氧化損傷和凋亡，減輕敵草快誘導的氧化損傷和腸屏障功能障礙，表明攝入富含山柰酚的藥物及食物可能改善腸上皮細胞完整性和功能[18]。MAPK信號通路包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶和p38，與炎癥介質(zhì)的表達和氧化損傷密切相關(guān)，山柰酚可抑制人單核細胞系THP-1中脂多糖誘導的MAPK通路表達[19-20]。木犀草素是一種天然類黃酮，在細胞因子誘導的HT-29細胞（人上皮細胞系）中抑制Janus激酶（JAK）/STAT通路，減緩炎癥[21]。β-谷甾醇不僅可降低膽固醇，還具有抗炎、抗血管生成、免疫調(diào)節(jié)及化學預防等活性，可能對腸道疾病發(fā)揮作用。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)研究發(fā)現(xiàn)，芩薊涼血合劑治療便秘的核心靶點為HSP90AA1、STAT3、MAPK3、TP53、AKT1 等。HSP90AA1 基因編碼的熱休克蛋白90α（HSP90α）是分子伴侶蛋白HSP90應(yīng)激誘導亞型。細胞應(yīng)激時，HSP90α水平升高，組織特異性表達水平各異，在多種癌癥中上調(diào)，與疾病預后相關(guān)[22]。STAT是JAK的重要底物，JAK/STAT信號通路與細胞增殖、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)[23]。腸道微血管內(nèi)皮細胞是腸道毛細血管的主要組成部分，是炎癥過程中最重要的分泌和免疫細胞之一。MAPK是一組可被多種細胞外刺激物激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)等。MAPK1和MAPK3在MAPK信號通路中起關(guān)鍵作用，抑制MAPK通路可增加腸道水分、促進腸道蠕動，從而改善便秘[24]。TP53是抑癌基因，可抑制細胞分裂、增殖過快或防止突變以維持細胞穩(wěn)定性，抑制癌癥的發(fā)生。Vacante等[25]研究表明，便秘可導致腸道菌群失調(diào)或代謝物異常，導致腸道微環(huán)境異常引起的免疫異常、基因突變或缺失，從而參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞自噬持續(xù)缺失可能是便秘病理生理學的體現(xiàn)。AKT是PI3K/AKT/mTOR信號通路的樞紐，PI3K被生長因子與其同源受體結(jié)合而激活，被激活的PI3K 磷酸化后激活AKT，進一步通過TSC1/2復合物激活下游分子mTOR從而阻斷結(jié)腸Cajal間質(zhì)細胞自噬，改善便秘[26]。因此，芩薊涼血合劑可能通過槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等活性成分作用于JAK/STAT、MAPK等信號通路，從而改善腸道功能、緩解便秘。

綜上所述，基于芩薊涼血合劑治療便秘的臨床有效性，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對芩薊涼血合劑治療便秘的關(guān)鍵成分、關(guān)鍵靶點及通路進行預測與分析，體現(xiàn)芩薊涼血合劑通過多靶點、多通路治療便秘的作用特點，為臨床治療便秘提供依據(jù)，但今后仍需大量實驗驗證分析，以明確芩薊涼血合劑治療便秘的關(guān)鍵作用機制。