基于網絡藥理學探討清腎顆粒主要藥物治療慢性腎臟病作用機制

孫璇君，金華，張磊，王億平

安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是由各種原因造成的腎臟結構和/或功能異常或不明原因腎小球濾過率下降（＜60 mL/min·1.73 m2）超過3個月[1]。研究表明，CKD流行性廣、發病率高[2-3]，其防治工作至關重要。清腎顆粒是安徽中醫藥大學第一附屬醫院開發的院內制劑，為治療CKD常用方，相關臨床研究表明，其可達到改善腎功能及并發癥的目的[4-6]，目前尚未進行藥理機制研究。本研究利用網絡藥理學方法，選取清腎顆粒的君藥、臣藥及重要使藥，即大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參，探討其治療CKD的作用機制，為其臨床應用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點獲取

利用TCMSP數據庫（https://www.tcmsp-e.com/），分別以大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參為檢索詞，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫獲得上述成分的SDF結構，并將上述成分導入SwissTargetPrediction數據庫，以藥物靶點預測值＞0作為篩選條件。

1.2 疾病靶點獲取

以“chronic renal failure”為關鍵詞，分別檢索OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、GeneCards數據庫（https://previous.genecards.org/）、TTD數據庫（https://ngdc.cncb.ac.cn/）獲取CKD相關靶點，合并后刪除重復值，獲取CKD靶點。

1.3 中藥成分-疾病靶點獲取

將以上4味中藥活性成分對應靶點及CKD靶點輸入Venny2.1 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，得到4味中藥治療CKD潛在靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點-疾病網絡構建

將4 味中藥活性成分及治療CKD 潛在靶點導入Cytoscape3.7.2軟件，使用Network Analyzer插件進行網絡拓撲分析，構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡。按照degree值大小排序，degree值與重要性呈正相關。

1.5 蛋白相互作用網絡構建

將“1.3”項中交集靶點導入STRING 數據庫（https://string-db.org/），設置為“Homo sapiens”，交互分數≥0.4，構建交集靶點蛋白相互作用（PPI）網絡，并下載.tsv格式文件。

1.6 核心靶點篩選

利用Cystoscape3.7.2 軟件的Network Analyzer 插件對PPI網絡進行拓撲分析，計算出degree值、中介中心性（BC）、平均最短路徑長度（ASPL）和緊密中心性，結果以degree值排序，使用R3.6.1對前30個靶點繪制條形圖。將“1.5”項中的.tsv文件導入Cytoscape軟件，使用MCODE模塊進行基因簇分析，以基因分值大于平均分作為核心靶點篩選標準。

1.7 GO功能與KEGG通路富集分析

利用R3.6.1 調用BiocManager、ClusterPr ofiler 等程序包，以P＜0.05、Q＜0.05為篩選條件，進行GO功能分析，包括細胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物過程（BP）。利用ClusterProfiler、org.Hs.eg.db等軟件包進行KEGG通路富集分析，利用pathview包繪制信號通路圖，根據P值排序，選取前20位繪圖。

2 結果

2.1 藥物活性成分及作用靶點收集

通過檢索TCMSP數據庫，共獲取大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參活性成分99種，藥物靶點873個。將活性成分按degree值排序，排名前10位見表1，包括槲皮素、木犀草素、丹參醇A等活性成分。

表1 白花蛇舌草、大黃、丹參、黃連活性成分

2.2 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建

通過檢索OMIM、GeneCards、TTD數據庫，去重后獲得1 010個CKD相關靶點。將CKD相關靶點與藥物活性成分對應靶點取交集，得到102個交集靶點，即為大黃、黃連、白花蛇舌草、丹參治療CKD的潛在靶點。利用Cytoscape3.7.2軟件構建藥物-活性成分-靶點-疾病網絡，見圖1。

圖1 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD藥物-活性成分-靶點-疾病網絡

2.3 蛋白相互作用網絡構建及核心靶點篩選

將102個交集靶點導入STRING數據庫，得到由102個節點、1 250條邊構成的PPI網絡（見圖2）。導入Cytoscape3.7.2軟件，利用Network Analyzer工具計算網絡中各節點的拓撲屬性，核心靶點的基因分值以大于平均分作為篩選標準，并使用R3.6.1對前30個靶點繪圖（見圖3），由大到小排序，前5位核心靶點依次為VEGFA、EGFR、AKT1、SRC、STAT3。

圖2 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD靶點PPI網絡

圖3 基于拓撲分析的核心靶點篩選（前30位）

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析結果

將102 個交集靶點導入R3.6.1，進行GO 功能與KEGG通路富集分析。其中GO富集分析得到2 212個BP條目、36個CC條目、126個MF條目。BP主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、蛋白質自身磷酸化、肌肉細胞增殖等；CC主要涉及薄膜筏、膜微疇、膜區域、質膜筏、細胞頂端部分、頂端質膜、焦點黏附、細胞-基質黏附體連接等；MF主要包括蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、生長因子結合、胰島素受體底物結合等。根據P值選取各項前20條目繪圖，見圖4。

圖4 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD靶點GO功能富集分析

共得到143條KEGG通路，靶點主要富集于缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、MAPK信號通路等。按照P值選取前20條目繪制條形圖，見圖5。

圖5 白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD靶點KEGG通路富集分析

3 討論

引起CKD的原因很多，如急/慢性原發性腎小球腎炎、間質性腎炎、腎病綜合征，代謝性疾病如高血壓病、1型或2型糖尿病、高尿酸血癥，結締組織病如系統性紅斑狼瘡、抗中性粒細胞抗體血管炎等。西醫治療多為單靶點治療，鑒于CKD機制的復雜性，需要多靶點、多通路進行治療。研究表明，中醫藥防治CKD作用顯著[7]。清腎顆粒中大黃味苦性寒，具有瀉下清熱、解毒逐瘀之功，為君藥，黃連、白花蛇舌草及丹參具有清熱利濕、化瘀泄濁之功[8]。

治療CKD除針對原發病治療之外，中醫藥防治也至關重要。清腎顆粒可以顯著改善患者血肌酐、尿素氮，減輕大小鼠腎臟炎癥及纖維化，調節免疫及糾正貧血，并通過不同信號通路如PI3K-Akt、Janus激酶信號通路等實現對腎間質纖維化治療作用[9-11]。Louren?o等[12]通過對CKD貓模型研究中發現，VEGFR在CKD模型組中表達明顯下降，且與CKD生物標志物如血肌酐呈負相關性。Patel等[13]指出，單側輸尿管梗阻模型小鼠中的TGF-β1下游EGFR與腎纖維化呈正相關性，而Kim等[14]指出，AKT基因沉默小鼠的腎纖維化程度明顯加重。Li等[15]研究表明，SRC家族激酶對于急性腎損傷（AKI）治療發揮關鍵作用。Park等[16]研究表明，STAT3 可能影響AKI 到CKD 的發展，在此過程中，STAT3亞型有不同程度的表達。

GO富集分析結果表明，BP主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修飾、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正向調節、蛋白質自身磷酸化、肌肉細胞增殖等；MF主要富集于蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、生長因子結合、胰島素受體底物結合等。CC主要涉及囊泡腔、前緣薄膜、嗜苯胺藍粒腔等。氨基酸代謝是CKD關鍵調節機制之一，這與GO富集分析結果一致[17]。

KEGG 結果顯示，HIF-1、PI3K-Akt、Rap1、MAPK信號通路參與治療CKD。Liang等[18]研究表明，活化Rap1能調節TNF-α以控制腎纖維化。Ye等[19]研究發現，TGF-β1/Smad3 和HIF1 信號通路在老齡小鼠AKI中發揮作用。Shi等[20]指出，PI3K信號通路參與AKI過程，而Rana等[21]研究發現，MAPK信號通路參與CKD 小鼠發病。本研究發現，VEGFA、EGFR、AKT1、SRC、STAT3等重要靶點及HIF-1、PI3K-Akt、Rap1、MAPK等重要信號通路參與CKD治療。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法探討中藥復方清腎顆粒中白花蛇舌草、黃連、丹參、大黃治療CKD的潛在活性成分可能是槲皮素、木犀草素、丹參醇A等，核心靶點涉及VEGFA、EGFR、AKT1，可能涉及HIF-1、PI3K-Akt、Rap1、MAPK 等信號通路。本研究為進一步揭示清腎顆粒治療CKD的作用機制提供了新思路。但限于中藥數據庫相關信息招募過程中潛在的遺漏，仍需開展相關實驗驗證，才能更好地闡明中藥多成分-多靶點-多途徑治療CKD的生物學特性與作用機制。