基于網絡藥理學和分子對接探討清熱類中藥作用機制

柯麗娟 ，李小陽 ，劉駿 ，雷蕾 ，王忠

1.中國中醫科學院中醫藥信息研究所，北京 100700；2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所，北京 100700

清熱藥主要功效為清解里熱，常用于治療里熱證。熱證有衛分、氣分、營分、血分、實熱、虛熱等不同證型，臨床應用清熱藥既取其共性特征，又根據證型配伍用藥。本研究探究清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥、清熱涼血藥和清虛熱藥作用機制[1]，為清熱功效的現代生物學機制研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選及對應靶點獲取

5組清熱類中藥見表1。以藥物名稱為檢索詞，在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCMID（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）、 NPASS （https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4452）數據庫中檢索其活性成分。利用微生信在線平臺（https://www.bioinformatics.com.cn）繪制韋恩圖，得到5組藥物各自特有活性成分集合及共有成分集合。

表1 清熱類中藥類別及藥物名稱

檢索DrugBank（https://go.drugbank.com/legal/terms_of_use）、 NPASS （https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/4452）數據庫，獲取成分對應靶點，導入UniProt數據庫進行規范化處理。

1.2 核心靶點篩選

將5類清熱藥活性成分對應靶點及共有成分對應靶點分別輸入STRING數據庫（https://cn.string-db.org），選擇“multiple protein”，物種為“Homo sapiens”，設置confidence＞0.7，得到蛋白相互作用（PPI）網絡；將數據導入Cytoscape3.9.1軟件，利用CytoHubba插件獲得各組及共有成分的核心靶點。

1.3 GO功能、KEGG通路及疾病富集分析

利用DAVID數據庫（https://david.ncifcrf.gov）對靶點進行GO功能、KEGG通路及疾病富集分析。GO功能富集結果通過基迪奧生物信息云平臺tu2（https://www.omicshare.com）進行可視化展示，KEGG通路通過微生信在線平臺進行可視化處理。再將5類清熱中藥及共有成分核心靶點分別導入 Metascape 數據庫（https://metascape.org）進行DisGeNET富集分析。

1.4 分子對接驗證

對清熱藥共有成分及核心靶點進行分子對接。從RCSB PDB數據庫（https://www.rcsb.org）獲得靶點的蛋白晶體結構，使用Discovery Studio 4.5.0軟件“small molecules-prepare ligand”模塊獲得配體分子三維結構，使用small molecules minimize ligands 及CHARMm 力場進行能量最小化，保存為配體分子集；蛋白分子去除晶體水分子后，使用“clean protein”模塊加氫、補充不完整氨基酸殘基，導入“CDOCKER”模塊進行分子對接；以原配體對接的CDOCKER_INTERACTION_ENERGY為參考值，判斷其相互作用情況。

2 結果

2.1 活性成分與對應靶點

共獲得清熱類中藥活性成分2 715個，清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥、清熱涼血藥、清虛熱藥活性成分分別為297、609、1 196、224、389個，特有活性成分分別為174、412、849、145、205個。

5組藥物共有活性成分7個，分別為亞油酸（Linoleic Acid）、棕櫚酸（Palmitic Acid）、槲皮素（Quercetin）、糠醛（Furfural）、2-戊基呋喃（2-Pentylfuran）、香草酸（Vanillic Acid）、壬醛（Nonanal）。清熱藥物活性成分韋恩圖見圖1。清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥、清熱涼血藥、清虛熱藥及共有活性成分分別獲得靶點117、241、402、87、260、196個。

圖1 清熱類中藥活性成分韋恩圖

2.2 蛋白相互作用網絡構建與核心靶點

采用Cytoscape3.9.1構建清熱類中藥PPI網絡，見本文OSID碼。利用CytoHubba插件，以P值篩選核心靶點，5組藥物及共有成分分別得到10個核心靶點，見表2。

表2 5組清熱類中藥及共有成分核心靶點（前10位）

2.3 GO功能富集分析

使用在線平臺DAVID對5類清熱藥特有活性成分及共有成分對應靶點進行GO富集分析，包括生物過程（BP）、分子功能（MF）及細胞組分（CC）。每類藥物P值排序前10位BP條目見圖2。其中，清熱瀉火藥參與的BP有外源代謝過程、對脂多糖的反應、葡萄糖醛酸基轉移酶活性負調控、細胞葡萄糖醛酸化負調控、類黃酮葡萄糖醛酸化等；MF包括酶結合、轉錄輔激活因子結合、鋅離子結合、肽-賴氨酸-N-乙酰轉移酶活性、葡糖醛酸基轉移酶等；CC為核質、核、細胞質、膜筏、細胞外泌體等。清熱燥濕藥參與的BP有外源代謝過程、類固醇代謝過程、對外源性刺激的反應、單碳代謝過程、雌激素代謝過程等；MF包括酶結合、碳酸鹽脫水酶活性、水解酶活性、鋅離子結合、芳香化酶活性等；CC為質膜的組成部分、質膜、突觸前膜的組成部分、突觸后膜、乙酰膽堿門控通道復合體等。清熱解毒藥參與的BP有外源代謝過程、細胞葡萄糖醛酸化、線粒體電子運輸、細胞色素c到氧、腺苷酸環化酶激活腎上腺素受體信號通路、對外源性刺激的反應等；MF為酶結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結合、細胞色素c氧化酶活性、相同蛋白結合、延遲整流鉀通道活性等；CC為線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ、線粒體、質膜、電壓門控鉀通道復合物、質膜的組成部分等。清熱涼血藥參與的BP有對β淀粉樣蛋白的反應、單碳代謝過程、膠原分解代謝過程、細胞外基質分解、細胞對UV-A 的反應等；MF為鋅離子結合、碳酸鹽脫水酶活性、水解酶活性、酶結合、內肽酶活性等；CC為核質、胞質溶膠、細胞質、核、細胞外區等。清虛熱藥參與的BP有興奮性突觸后電位、神經系統過程、化學性突觸傳遞、離子跨膜轉運、膜電位的調節等；MF為神經遞質受體活性、遞質門控離子通道活性參與突觸后膜電位的調節、細胞外配體門控離子通道活性、鐵離子結合、L-抗壞血酸結合等；CC為突觸后膜、突觸、質膜的組成部分、神經元投射、GABA-A受體復合物等。共有成分對應靶點參與的BP有外源代謝過程、蛋白質磷酸化、蛋白質自磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、雌激素代謝過程等；MF為蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、酶結合、蛋白激酶活性、ATP結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等；CC為核質、細胞質、胞質溶膠、核、大分子復合物等。

圖2 5類清熱類中藥GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

P值排序前10位的KEGG通路富集分析結果見圖3。其中，清熱瀉火藥特有活性成分對應靶點富集通路77條，主要涉及化學致癌作用-受體激活、化學致癌作用-DNA加合物、類固醇激素生物合成、視黃醇代謝、藥物代謝-細胞色素P450等；清熱燥濕藥特有活性成分對應靶點富集通路101條，主要涉及類固醇激素生物合成、化學致癌作用-受體激活、藥物代謝-細胞色素P450、氮代謝、細胞色素P450等；清熱解毒藥特有活性成分對應靶點富集通路186條，主要涉及代謝途徑、化學致癌作用-受體激活、膽汁分泌、藥物代謝-細胞色素P450、血清素能突觸等；清熱涼血藥特有活性成分對應靶點富集通路37條，主要涉及氮代謝、膀胱癌癥、脂質與動脈粥樣硬化、內分泌抵抗、甲狀腺激素信號通路等；清虛熱藥特有活性成分對應靶點富集通路96條，主要涉及尼古丁成癮、神經活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、逆行內源性大麻素信號傳導、GABA能突觸等；共有成分對應靶點富集通路143條，主要涉及內分泌抵抗、化學致癌作用-DNA加合物、氮代謝、細胞色素P450對外源性物質的代謝、化學致癌作用-受體激活等。

圖3 5類清熱類中藥對應靶點KEGG通路富集分析

2.5 疾病富集分析

5類清熱類中藥活性成分及共有成分對應靶點疾病富集分析結果見表3。“疾病-靶點” Circos圖見圖4。由圖4可知，清熱瀉火藥和清熱燥濕藥、清熱燥濕藥和清熱解毒藥相同核心靶點較多，可能說明商戶類別藥物富集的疾病相似度較高。

圖4 5類清熱類中藥對應靶點Circos圖

表3 5類清熱類中藥及共有成分對應靶點疾病富集分析

2.6 分子對接結果

7個共有活性成分與其核心靶點進行分子對接，結果見表4。其中，SRC和棕櫚酸、槲皮素、亞油酸的對接結果，MAPK和棕櫚酸、槲皮素的對接結果及ESR2和棕櫚酸、槲皮素、亞油酸的對接結果均優于原配體。SRC-棕櫚酸、MAPK-槲皮素、ESR2-亞油酸的作用模式見圖5。

圖5 SRC-棕櫚酸、MAPK-槲皮素、ESR2-亞油酸作用模式

表4 A6組清熱類藥物有效成分與核心靶點分子對接結果（kcal/mol）

3 討論

由圖2可知，5類清熱藥活性成分相應靶點GO富集結果BP條目都包含外源代謝過程和單碳代謝過程，說明中藥可能通過以上2個過程發揮功效；其中，清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥特有靶點BP相似度較高，達60%，主要富集在外源代謝過程、單碳代謝過程、葡萄糖醛酸基轉移酶活性的負調控、細胞葡萄糖醛酸化的負調控、雌激素代謝過程、細胞葡萄糖醛酸化。清熱涼血藥、清虛熱藥特有靶點BP與其他3類中藥BP相似度不高，具有特異性。

由圖3可知，代謝途徑是5類清熱藥共有信號通路，該信號通路可能在清熱功效中發揮重要作用。清熱瀉火藥、清熱燥濕藥、清熱解毒藥主要富集在新陳代謝類信號通路，相似度達60%，包括代謝途徑、化學致癌作用-受體激活、類固醇激素生物合成、視黃醇代謝、藥物代謝-細胞色素P450、膽汁分泌等通路。清熱涼血藥和清虛熱藥與其他3類相似度較低，具有特異性。清熱涼血藥和清虛熱藥主要富集在生物體系統類信號通路，其中，清熱涼血藥富集在內分泌系統類的信號通路較多，清虛熱藥富集在神經系統類的信號通路較多。

結合GO功能、KEGG和疾病富集分析結果發現，清熱瀉火藥可治療的優勢疾病為乳腺癌、腫瘤，其功效可能與生物過程對脂多糖的反應、脂肪酸代謝過程的負調節、外源性葡萄糖醛酸化和信號通路癌癥途徑有關；清熱燥濕藥可治療的優勢疾病為抑郁癥、乳腺癌、肥胖，可能與類固醇代謝過程、對尼古丁的反應有關；清熱解毒藥可治療的優勢疾病為抑郁癥、乳腺癌、肥胖，可能與生物學過程線粒體電子運輸、腺苷酸環化酶激活腎上腺素受體信號通路、蛋白質均低聚、藥物代謝-其他酶、化學致癌作用-活性氧等有關；清熱涼血藥可治療的優勢疾病為乳腺癌、炎癥反應、肺氣腫，可能與生物過程對β淀粉樣蛋白的反應、膠原分解代謝過程、細胞外基質分解、膀胱癌癥、甲狀腺激素信號通路、松弛素信號通路等有關；清虛熱藥可治療的優勢疾病為慢性酒精中毒、抑郁癥，可能與生物過程興奮性突觸后電位、神經系統過程、化學性突觸傳遞、尼古丁成癮、神經活性配體-受體相互作用、逆行內源性大麻素信號傳導等有關。5種藥物發揮清熱功效可能與生物學過程中外源代謝過程、單碳代謝過程以及信號通路中代謝途徑有關，可治療的疾病為腫瘤、乳腺癌。

清熱藥抗乳腺癌的核心活性成分可能是棕櫚酸、槲皮素、香草酸、亞油酸。付紅萍等[2]研究發現，棕櫚酸水平可反映乳腺癌發展過程潛在代謝變化，可能成為潛在的乳腺癌標志物；Abramczyk等[3]研究表明，棕櫚酸可作為乳腺癌的關鍵分子靶點。清熱藥知母、紫草、蒲公英、魚腥草、牛黃、穿心蓮、青蒿、金銀花、梔子、地骨皮、連翹、大青葉、板藍根、黃柏、黃芩均含有棕櫚酸。研究表明，槲皮素可下調葡萄糖轉運蛋白1表達，減少乳腺癌細胞對葡萄糖的攝取，增加乳腺癌細胞內三磷酸腺苷水平，對乳腺癌細胞能量代謝具有調控作用，可作為潛在的抗癌劑或抗癌輔助劑[4]；同時，槲皮素可激活PTEN蛋白表達，抑制PI3K/AKT和JNK信號通路，誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡[5]。清熱藥苦參、金銀花、蒲公英、青蒿、黃連、梔子、黃柏、山豆根、牡丹皮、連翹、魚腥草均含有槲皮素。三葉青三氯甲烷部位的體外抗腫瘤活性由多種成分共同作用產生，包含連翹、梔子、地骨皮、黃連、牡丹皮、山豆根、金銀花中的香草酸[6]。此外，清熱藥紫草、蒲公英、金銀花、魚腥草、梔子、地骨皮、板藍根、連翹、黃芩中均含有亞油酸，亞油酸可通過調節microRNA表達水平抑制乳腺癌的發生[7]。

既往研究中，清熱藥相關網絡藥理學研究多關注單味中藥或處方，如陳光輝等[8]發現梔子苷具有抗抑郁作用、楊思慧等[9]發現黃芩湯可減輕子宮內膜癌化療不良反應等。但相同功效藥物之間分子機制對比研究較少，本文為中藥功效分子機制研究提供新的思路。

綜上所述，本文運用網絡藥理學與分子對接方法探討5類清熱類中藥各自功效與共同功效的作用機制，篩選藥物中可能具有抗乳腺癌活性的活性成分，為新藥研發提供思路，但本研究結論仍需實驗進一步驗證。