健心顆粒通過調控Apelin 通路對心力衰竭大鼠心室-動脈偶聯的影響

歐陽秋芳，游 濤，許 榮，林 晴，嚴錦賢，陳永忠，李 濱，郭進建

（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350001）

目前我國心力衰竭患者約450 萬人，其中80%是老年人，約60%患者在確診5 年內死亡。因此，心力衰竭已成為老年人死亡的主要原因。其臨床綜合征為左室功能紊亂后，左室泵功能和血管阻抗不匹配導致［1］。

心室-動脈脫偶聯是心力衰竭發生發展的病理基礎。心臟結構、功能狀態影響外周動脈，而外周動脈通過改變負荷影響心臟。心臟和動脈樹組成閉合環路，結構相互聯系，功能相互偶聯，這種心室與動脈系統之間的相互作用稱為心室-動脈偶聯（ventricular-arterial coupling，VAC）［2］。當心室與動脈的彈性匹配、功能偶聯時，能使心臟的搏出功趨于最佳，效率最高。合理的匹配是心室和動脈間能量高效傳輸的重要保障。倘若心室-動脈脫偶聯，則會導致心臟所做的功利用減少［3］。愛帕琳肽（Apelin） 是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的新成員，對維持心血管穩態偶聯具有重要作用［4］。Apelin 通過活化下游血管緊張素1 型受體相關蛋白（angiotensin type 1 receptor related protein，APJ），激活一氧化氮信號通路，介導血管舒張。

健心顆粒是本院已獲得專利的院內制劑，臨床與基礎實驗均表明它治療心力衰竭療效顯著［5-6］，但其是否通過活化Apelin/APJ、改善心室-動脈脫偶聯來治療心力衰竭目前尚無報道，故本實驗對此進行研究。

1 材料

1.1 動物 18 月齡雄性大鼠60 只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （滬）2018-0006］，飼養于福建中醫藥大學動物實驗研究中心SPF 級動物房［實驗動物使用許可證號SYXK （閩） 2019-0007］，常規飼料飼養，自由飲水，適應性飼養2 周后開始實驗。動物實驗經福建中醫藥大學附屬第二人民醫院倫理委員會批準（倫理號FJPSPH-IAEC2019061）。

1.2 試劑與藥物 健心顆粒組方藥材（黃芪10 g、紅參5 g、蒲黃3 g、丹參5 g、豬苓5 g、白術5 g、桂枝3 g、葶藶子5 g） 購自福建省藥材有限責任公司，嚴格按照相關制劑及質量標準，由本院制劑室制成顆粒劑。Apelin 抗體（貨號ab133624） 購自英國Abcam 公司； APJ 抗體（貨號20341-1-AP） 購自美國Proteintech 公司； ［Pyr1］ -Apelin-13、F13A （貨號217082-60-5、568565-11-7） 均購自美國Sigma 公司； Masson 三色染色試劑盒（貨號G1340） 購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥 除假手術組（12 只） 外，其余大鼠參考文獻［7］ 報道，采用結扎冠狀動脈左前降支建立左室心肌缺血模型，術后第7 天，以射血分數小于60%為心力衰竭模型成功建立的標志［8］，采用超聲剔除未達到標準者。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、健心顆粒組（3.2 g/kg，折合生藥量4.38 g/kg，相當于臨床等效劑量，灌胃）、Apelin 組（200 μg/kg ［Pyr1］ -Apelin-13，腹腔注射）、健心顆粒＋F13A 組 （3.2 g/kg 健心顆粒灌胃＋200 μg/kg F13A 腹腔注射）； 假手術組穿線但不結扎冠狀動脈，灌胃給予純水。給藥期間，觀察大鼠活動度、精神狀態、皮毛狀況、體質量、心臟指數（心臟質量/體質量）等變化，干預12 周后檢測血流動力學并取材。

2.2 心導管測量血流動力學 給藥結束后，參考文獻［9］ 報道測量心率、收縮壓、舒張壓、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室壓力最大上升速率 （＋dP/dtmax）、左室壓力最大下降速率 （-dP/dtmax）。

2.3 超聲法測量脈搏波傳導速度 采用超聲儀無創測量脈搏波傳導速度（pulse wave velocity，PWV），大鼠鼻尖至尾根部直線距離即體長L； 采用超聲儀進行血流速度頻譜的采集，并結合心電圖進行測量頸-股脈搏波傳播時間，為股動脈與頸總動脈脈搏波波起始點與心電圖R 波頂點的時間間隔差，即TR-股動脈-TR-頸動脈［10］，計算大鼠主動脈PWV，公式為PWV＝ （0.461 4L＋1.833 5） /頸-股脈搏波傳播時間。

2.4 心室-動脈偶聯指數計算 給藥結束后，參考文獻［11］ 報道記錄壓力-容積曲線，計算有效動脈彈性Ea（Ea＝左室收縮末期壓力/收縮末期容積）、左室收縮末彈性Ees ［左室收縮末期壓力/（每搏輸出量-非張力心室容積）］ 和心室-動脈偶聯指數（Ea/Ees）。

2.5 胸主動脈環血管張力測定分析血管舒縮功能 參考文獻［12］ 報道，取大鼠胸主動脈，用Power Lab 多通道生理信號采集處理系統描記張力變化，血管環舒張效應以該血管舒張張力絕對值與1.0×10-5mmol/L 去甲腎上腺素所引起血管收縮張力絕對值的比值（百分比） 表示，并計算最大舒張百分比，最大舒張效應用Emax表示。舒張反應敏感性用pD2值表示，表示EC50以10 為底的負對數值［產生50%最大效應（E＝1/2Emax） 的摩爾濃度的負對數］。

收縮功能檢測： 給予100 μL 氯化鉀（10～100 mmol/L）和去甲腎上腺素（1.0×10-10～1.0×10-4mol/L），記錄血管收縮時相應的張力值。血管環收縮效應用血管收縮張力絕對值與氯化鉀預收縮張力絕對值的比值表示，并計算最大收縮百分比。

舒張功能檢測： 給予100 μL 去甲腎上腺素溶液（1.0×10-3mol/L） 預收縮血管，待血管收縮至最大幅度時累積給予乙酰膽堿或硝普鈉溶液100 μL （1.0×10-10～1.0×10-4mol/L），用乙酰膽堿或硝普鈉誘發的舒張率來分別評價內皮依賴性舒張或非依賴性舒張功能。

2.6 主動脈組織形態學觀察 取大鼠降主動脈5 mm，于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水浸蠟，石蠟包埋，制成4 μm 切片，脫蠟，Masson 復合染色分析主動脈膠原密度，Verhoeff 染色分析主動脈彈力纖維情況。

2.7 Western blot 法檢測胸主動脈Apelin、APJ 蛋白表達取大鼠胸主動脈100 mg，剪碎，冰上裂解，離心取上清，蛋白定量后加熱變性（50 μg），將其電泳分離并轉移到PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃孵育過夜，沖洗，二抗孵育，免疫印跡顯色。用圖像分析系統對圖片進行灰度掃描，以GAPDH 為內參，進行半定量分析，以比值表示其相對表達。

2.8 血清Apelin、BNP、NO 水平檢測 大鼠下腔靜脈取血2 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心，收集血清，用酶聯免疫吸附 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 法檢測Apelin、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP） 水平，硝酸還原酶法檢測一氧化氮 （nitrogen monoxide，NO） 水平，均嚴格按照試劑盒說明書操作。

2.9 統計學分析 通過SPSS 軟件進行處理，符合正態分布的計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間均數比較采用LSD 法； 非正態分布資料采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 健心顆粒對心力衰竭大鼠一般情況的影響 假手術組死亡1 只； 模型組死亡5 只，死亡率為41.7%； 健心顆粒組和Apelin 組死亡3 只，死亡率為25%； 健心顆粒＋F13A組死亡4 只，死亡率為33.3%，存活8 只。假手術組大鼠飲食、活動正常，皮毛整潔，體質量增加，無心肌梗死情況； 與假手術組比較，模型組大鼠進食、活動明顯減少，皮毛干燥無光澤，體質量降低（P＜0.05）； 與模型組比較，健心顆粒組體質量增加（P＜0.05），其作用與［Pyr1］ -Apelin-13 類似，見表1。

表1 健心顆粒對心力衰竭大鼠一般情況的影響（±s）

表1 健心顆粒對心力衰竭大鼠一般情況的影響（±s）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與健心顆粒組比較，＆P＜0.05。

組別動物數/只體質量/g死亡數（死亡率/%）假手術組11588.34±35.731（8.3）模型組7516.69±69.33*5（41.7）健心顆粒組9565.17±45.16＃3（25.0）Apelin 組9557.42±47.69＃3（25.0）健心顆粒＋F13A 組8537.25±39.46＃4（33.3）

3.2 健心顆粒對心力衰竭大鼠心功能及血流動力學的影響如表2 所示，與假手術組比較，模型組心臟指數、心肌梗死面積和LVEDP 值升高（P＜0.05），±dP/dtmax值降低（P＜0.05），表明心力衰竭失代償； 與模型組比較，健心顆粒組心臟指數、心肌梗死面積和LVEDP 值降低 （P＜0.05），±dP/dtmax值升高（P＜0.05），其作用與［Pyr1］ -Apelin-13 相當，而F13A 能逆轉健心顆粒的作用 （P＜0.05）。

表2 健心顆粒對心力衰竭大鼠心功能及血流動力學的影響（±s，1 mmHg＝0.133 kPa）

表2 健心顆粒對心力衰竭大鼠心功能及血流動力學的影響（±s，1 mmHg＝0.133 kPa）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與健心顆粒組比較，＆P＜0.05。

組別動物數/只 心臟指數/（g·kg-1） 心肌梗死面積/%心率/（次·min-1）收縮壓/mmHg舒張壓/mmHg假手術組112.19±0.360.00±0.00403±31142.79±12.4795.03±18.73模型組73.67±0.46*43.51±3.16*429±58115.43±17.7071.44±20.59健心顆粒組92.58±0.20＃30.78±4.87＃416±65128.56±11.6281.23±9.16 Apelin 組92.93±0.17＃32.01±3.12＃415±33135.37±16.6575.46±6.70健心顆粒＋F13A 組83.16±0.27＆40.09±4.51＆426±52123.92±20.1589.81±20.24組別動物數/只收縮壓/mmHg舒張壓/mmHgLVEDP/mmHg＋dP/dtmax/（mmHg·s-1）-dP/dtmax/（mmHg·s-1）假手術組11142.79±12.4795.03±18.735.41±0.348 902±573-7 218±580模型組7115.43±17.7071.44±20.5918.28±1.39*5 894±603*-5 347±495*健心顆粒組9128.56±11.6281.23±9.168.39±0.60＃6 719±726＃-6 785±597＃Apelin 組9135.37±16.6575.46±6.7010.96±1.83＃7 171±550＃-6 584±805*健心顆粒＋F13A 組8123.92±20.1589.81±20.2415.27±1.62＆6 235±693＆-5 962±621＆

3.3 健心顆粒對心力衰竭大鼠頸-股脈搏波傳導速度的影響 如表3 所示，與假手術組比較，模型組頸-股PWV 值升高（P＜0.05），表明在心力衰竭情況下，動脈樹明顯僵硬； 與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組頸-股PWV 值降低（P＜0.05）； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A 組頸-股PWV 值升高（P＜0.05）。

表3 健心顆粒對心力衰竭大鼠頸-股脈搏波傳導速度的影響（±s）

表3 健心顆粒對心力衰竭大鼠頸-股脈搏波傳導速度的影響（±s）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與健心顆粒組比較，＆P＜0.05。

組別動物數/只頸-股PWV/（m·s-1）假手術組115.27±0.36模型組76.75±0.71*健心顆粒組95.79±0.62＃Apelin 組96.03±0.47＃健心顆粒＋F13A 組86.58±0.54＆

3.4 健心顆粒對心力衰竭大鼠心室-動脈偶聯的影響 如圖1 所示，與假手術組比較，模型組VAC 值升高 （P＜0.05）； 與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組VAC 值降低（P＜0.05）； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A 組VAC 值升高（P＜0.05）。

圖1 健心顆粒對心力衰竭大鼠心室-動脈偶聯的影響（±s，n＝7～11）

3.5 健心顆粒對心力衰竭大鼠胸主動脈舒縮功能的影響如圖2 所示，假手術組大鼠胸主動脈對去甲腎上腺素的Emax值為（31.98±3.61）%、pD2值為-6.15±0.60； 與假手術組比較，模型組大鼠胸主動脈對去甲腎上腺素的Emax值升高（P＜0.05），為（75.69±4.10）%，pD2值降低（P＜0.05），為-6.74±0.48，去甲腎上腺素劑量反應曲線非平行性向右下移位； 與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組血管環收縮效應降低（P＜0.05）； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A 組血管環收縮效應增強（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠胸主動脈對去甲腎上腺素的濃度依賴性收縮曲線（±s，n＝7～11）

如圖3 所示，假手術組胸主動脈對硝普那的Emax值為（96.31±6.90）%，pD2值為-7.72±0.10； 與假手術組比較，模型組胸主動脈對硝普那的Emax值降低（P＜0.05），為（63.9±5.6）%，pD2值升高（P＜0.05），為-7.12±0.80；與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組胸主動脈對硝普那的Emax值升高 （P＜0.05），分別為 （89.29 ± 8.4）%、（72.05±6.07）%，pD2值降低（P＜0.05），分別為-7.59±0.62、-7.63±0.82； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A組胸主動脈對硝普那的Emax值降低（P＜0.05），為（68.34±9.50）%，pD2值升高（P＜0.05），為-7.20±0.46。

圖3 各組大鼠胸主動脈對硝普那的濃度依賴性舒張曲線（±s，n＝7～11）

如圖4 所示，假手術組胸主動脈對乙酰膽堿的Emax值為（93.69±7.10）%，pD2值為-7.75±0.51； 與假手術組比較，模型組胸主動脈對乙酰膽堿的Emax值降低（P＜0.05），為（21.98±3.1）%，pD2值升高（P＜0.05），為-6.43±0.45； 與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組胸主動脈對乙酰膽堿的Emax值升高 （P＜0.05），分別為 （55.59±4.5）%、（65.97±5.21）%，pD2值降低（P＜0.05），分別為-7.12±0.60、-7.46±0.58； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A 組胸主動脈對乙酰膽堿的Emax值降低（P＜0.05），但pD2值無明顯變化（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠胸主動脈對乙酰膽堿的濃度依賴性舒張曲線（±s，n＝7～11）

3.6 健心顆粒對心力衰竭大鼠主動脈形態學的影響 各組胸動脈橫截面積、管腔直徑、壁腔比均無明顯差異。如圖5所示，與假手術組比較，模型組膠原沉積增多（P＜0.05）；與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組胸主動脈膠原沉積減少（P＜0.05）； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A 組膠原沉積增多（P＜0.05）。

圖5 健心顆粒對心力衰竭大鼠主動脈膠原沉積的影響（Masson，×200，±s，n＝7～11）

如圖6 所示，各組間的彈力纖維層數無明顯變化（P＞0.05），但模型組彈力纖維排列明顯紊亂，甚至有斷裂現象。與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組彈力纖維板排列緊密、有序，彈力板結構完整。

圖6 健心顆粒對心力衰竭大鼠主動脈彈力纖維的影響（Verhoeff，×200，±s，n＝7～11）

3.7 健心顆粒對心力衰竭大鼠主動脈Apelin、APJ 蛋白表達的影響 如圖7～8 所示，與假手術組比較，模型組大鼠主動脈Apelin、APJ 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組大鼠主動脈Apelin、APJ 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A組大鼠主動脈Apelin、APJ 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖7 各組大鼠胸主動脈Apelin 蛋白免疫組化染色（×200）

圖8 健心顆粒對心力衰竭大鼠主動脈Apelin、APJ 蛋白表達的影響（±s，n＝7～11）

3.8 健心顆粒對心力衰竭大鼠血清Apelin、BNP、NO 水平的影響 如表4 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清BNP 水平升高 （P＜0.05），Apelin、NO 水平降低 （P＜0.05）； 與模型組比較，健心顆粒組和Apelin 組大鼠血清BNP 水平降低 （P＜0.05），Apelin、NO 水平升高 （P＜0.05）； 與健心顆粒組比較，健心顆粒＋F13A 組大鼠血清BNP、Apelin、NO 水平降低（P＜0.05）。

表4 健心顆粒對心力衰竭大鼠血清Apelin、BNP、NO 水平的影響（±s）

表4 健心顆粒對心力衰竭大鼠血清Apelin、BNP、NO 水平的影響（±s）

注： 與假手術組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，＃P＜0.05； 與健心顆粒組比較，＆P＜0.05。

組別動物數/只Apelin/（ng·mL-1）BNP/（pg·mL-1）（NO2-/NO3-）/（μmol·L-1）假手術組116.69±0.8351.78±4.7225.68±3.05模型組72.17±0.35*593.35±65.68*12.58±4.20*健心顆粒組93.67±0.46＃362.57±40.27＃19.31±2.40＃Apelin 組94.25±0.51＃240.63±31.58＃17.58±1.69＃健心顆粒＋F13A 組83.03±0.26＆156.42±32.80＆14.05±2.47＆

4 討論

全身動脈彈性及左心室功能的協調是冠狀動脈血流和左心室功能的重要決定因素。正常情況下，左室與動脈系統互相匹配形成穩定、有效的VAC 關系，使心室泵血功能優化達到最大傳遞效能［13］。心力衰竭時心室-動脈偶聯關系異常，機械性能下降。本研究發現健心顆粒能改善心力衰竭大鼠左室功能，降低動脈PWV，減少胸主動脈膠原含量，改善心力衰竭中的心室-動脈脫偶聯，且上述效應隨著Apelin 通路活化或抑制而發生相應變化。Ceiler 等［14］研究表明，冠狀動脈結扎18 周后，胸主動脈順應性降低，僵硬度增加。有研究表明，心肌梗死后心力衰竭大鼠出現胸主動脈膠原纖維增加，收縮血管反應性增強，舒張反應減弱［15-16］。本研究結果與報道一致，大鼠冠狀動脈結扎13 周后，模型組大鼠LVEDP、心臟指數、PWV 值和胸主動脈膠原含量增加，彈力纖維排列紊亂。但也有研究認為大鼠心肌梗死后3 ～4 周主動脈彈性沒有任何變化，這可能與心肌梗死后，血管結構變化發生較晚有關［17］。目前尚無治療心力衰竭的中成藥改善動脈彈性的文獻報道。本研究發現，健心顆粒能降低心力衰竭大鼠PWV 值，改善胸主動脈膠原纖維、彈力纖維重構和動脈舒縮功能。

近年來，以優化心室-動脈偶聯為導向的治療方案已成為研究的新亮點，在臨床治療中獲益頗豐［18］。Ea/Ees 比值是經典評估VAC 的方法［19］，通常在1.0±0.36 左右［20］。心力衰竭時，收縮性下降，僵硬度增加，導致Ees 下降，全身組織灌注不足，腎素-血管緊張素-醛固酮系統和交感神經系統過度激活，增加血容量和動脈負荷，代償受損的全身灌注，使得Ea 增加，Ea/Ees 值增高，發生脫偶聯，最終導致終末器官灌注不足［21］。通過擴血管藥物和（或） 正性肌力藥物可以改善收縮期心力衰竭患者的偶聯和功能。研究表明擴血管藥物能降低Ea，而正性肌力藥物能增加Ees，兩者都可改善Ea/Ees 值［22］。另有研究發現，大鼠前降支結扎8 周后，出現Ea/Ees 值增高； 而美托洛爾能降低Ea/Ees 值［23］。本研究結果顯示，心力衰竭大鼠出現心室-動脈偶聯指數增高，而健心顆粒能降低VAC，說明其可能通過抑制心室重構與神經內分泌系統激活，糾正心力衰竭中的脫偶聯關系，最終改善終末器官灌注。

Apelin/APJ 受體系統是調控心血管生理功能的重要內分泌系統，其活性異常參與高血壓、動脈粥樣硬化及心力衰竭等心血管疾病的發生、發展。Apelin 通過促進內皮細胞釋放NO，從而擴張血管、增加心肌收縮力［24］。本研究結果表明，健心顆粒可增加心力衰竭大鼠Apelin、APJ 蛋白表達和血清NO 水平，其作用與Apelin 相似； 用F13A 拮抗Apelin 后，健心顆粒上調Apelin、APJ、NO 的作用被抑制。

綜上所述，健心顆粒可能通過Apelin-APJ-NO 通路改善心力衰竭大鼠心室-動脈脫偶聯與動脈彈性，為健心顆粒治療心力衰竭提供新的依據，但本實驗結果有待系統臨床研究進行進一步驗證。