孟魯司特鈉聯合布地奈德通過p38MAPK 通路抑制哮喘炎性反應#

王一迪 朱旭陽 辛子敏 卓馨 江舟 汪宇輝 成姝婷 Δ

（1. 四川大學華西藥學院，四川 成都 610041；2. 四川大學華西第二醫院，四川 成都 610041；3. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院生物醫學工程研究室，四川 成都 610041；4. 國家衛生健康委員會時間生物學重點實驗室（四川大學），四川 成都 610041）

支氣管哮喘（Bronchial Asthma，BA）是一種慢性炎癥性呼吸系統疾病，主要癥狀包括呼吸急促、喘息和咳嗽，其癥狀隨時間的推移而逐漸加重，可嚴重危害人類生命健康和生活質量。哮喘發病人數眾多，全球哮喘患者已超過3.6 億，具有包含全年齡段、全社會階層和無性別差異等多種特征[1]。我國約有3000 萬哮喘患者，哮喘致死率為36.7/10 萬，是全球哮喘致死率最高的國家之一[2]。因此探尋哮喘有效的防治方法意義重大。

布地奈德混懸液（Budesonide suspension）屬于吸入式強效糖皮質激素（Glucocorticoid，GCs)，對內皮細胞和平滑肌細胞具有顯著的穩定作用，能夠減輕哮喘癥狀，但單一給藥中藥效不穩定，常需要與其他藥物聯用[3]。而孟魯司特鈉（Montelukast Sodium）是一種白三烯受體拮抗劑（Leukotriene Receptor Antagonists，LTRA)，能夠通過抑制氣道炎癥反應而有效減輕氣道受阻現象[4]。根據目前的研究進展及臨床用藥經驗，孟魯司特鈉與吸入式布地奈德聯合給藥能夠明顯改善患者的肺功能，并減輕其炎癥反應[5-7]，即白三烯（Leukotriene，LT）和糖皮質激素聯合給藥可更好的改善哮喘治療效果，但其具體機理尚不明確。已知白三烯和糖皮質激素均可影響絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的活性[8,9]，因此我們認為，吸入式糖皮質激素與抗白三烯藥物聯合給藥可能是通過共同于MAPK通路而增強了哮喘治療的效果。

為驗證上述假設，本實驗擬通過卵清蛋白誘導法構建支氣管哮喘小鼠模型，對比聯合給藥與兩種藥物單一給藥后的的治療效果，并比較各組小鼠肺組織中MAPK 信號通路的活性，為新藥研發和聯合給藥在臨床治療中的應用提供新的參考及依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

雄性SPF 級BALB/C 小鼠24 只，6 周齡，體質量15～20 g，購買于成都藥康生物科技有限公司。所有雄鼠均飼養于12L: 12D 光暗循環環境，自由飲水進食。適應性喂養3 d 后，將小鼠按照隨機數字表法分為空白組、哮喘組、哮喘+孟魯司特鈉組、哮喘+布地奈德組、哮喘+聯合給藥組。其中空白組和哮喘組各6 只，其余組各4 只。

1.1.2 藥品與試劑

卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）（Sigma，批號：A5503-1G）；小鼠白細胞介素5（Interleukin-5，IL-5）ELISA 科研試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）；RIPA裂解液（Servicebio，貨號G2002-100ML）；蛋白Marker（Servicebio，貨號G2083-250UL）；BCA 蛋白定量檢測試劑盒（Servicebio，貨號G2026）；β-actin 抗體、p-p38MAPK 抗體，HRP- 山羊抗兔抗體（Servicebio，貨號分別：GB15003、GB113380、GB23303）；蘇木精－伊紅( Hematoxylin eosin，HE) 染色試劑盒、顯影液（上海碧云天生物技術公司，貨號分別：C0105S、C1091）、美國通用Rehydragel@LV 鋁佐劑（北京博奧森生物技術有限公司）、孟魯司特鈉片（四川大冢制藥有限公司）、吸入式布地奈德混懸液（正大天晴藥業集團）。

1.1.3 儀器

熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯，型號：CKX53）；醫用低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司，型號：DW-86L490J）；高速冷凍離心機（德國艾本德，型號：5804R）；超靈敏化學發光成像儀（美國通用電氣公司，型號：ImageQuant LAS 4000mini）

1.2 方法

1.2.1 過敏性哮喘小鼠模型的構建及給藥

除空白組外，其余各組小鼠均按照OVA 法進行小鼠過敏性哮喘模型的建立[10]。方法如下：使用OVA與生理鹽水（Normal saline，NS）配制0.8 mg·mL-1的OVA 溶液后與等體積的氫氧化鋁凝膠免疫佐劑制得OVA 致敏劑，腹腔注射，1 次·7d-1，共三次（0 d、7 d、14 d），此過程是全身致敏階段；d18 對各組小鼠使用OVA 溶液霧化30min（溶液配制：將20mg OVA溶解于10 mL NS 中），d20、d22 重復上述操作，該過程為霧化激發階段，構建小鼠過敏性哮喘模型。

因由OVA 法所制得的過敏性哮喘小鼠模型具有較強的自愈性，故本實驗采用霧化激發與分組給藥同時進行的方式，于每次霧化激發的兩小時后對哮喘+聯合給藥組和哮喘+布地奈德組給予0.125 mg·kg-1布地奈德霧化操作；空白組、哮喘組和哮喘+孟魯司特鈉組給予等量生理鹽水霧化；由于孟魯司特鈉在臨床中常以睡前給藥的方式用藥，同時小鼠是夜行動物，有著晝伏夜出的行為節律，故于霧化后一天動物房開燈前一小時對哮喘+孟魯司特鈉組和聯合給藥組給予1.5 mg·kg-1孟魯司特鈉藥液灌胃；空白組、哮喘組和哮喘+布地奈德組予以等量生理鹽水灌胃。最后一次灌胃給藥結束12 h 后，進行功能及指標檢測。

1.2.2 觀察氣道炎癥

用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，打開小鼠胸腔，以灌注針插入心尖，剪開右心耳，先以生理鹽水灌注，待到心耳處流出液體清亮后換用4%多聚甲醛繼續灌注20 mL。取出小鼠肺組織放入4%多聚甲醛繼續固定24 h 后，經組織脫水、透化、石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、PBS 沖洗，HE 染色后，于160 倍顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理學改變并作對比。

1.2.3 檢測支氣管肺泡灌洗液白細胞介素-5（Interleukin-5，IL-5）水平

頸椎脫臼法處死小鼠后，將小鼠仰臥位固定氣管插管，取1.0 mL 生理鹽水灌洗肺泡 3 次，每次灌洗反復緩慢抽吸3 遍，并記錄回收量（回收率＞80%）。回收的支氣管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）裝入EP 管中，4℃ 1500 rpm 離心15 min，吸取上清液，按照ELISA 檢測試劑盒說明書測定肺泡灌洗液中IL-5 水平并對各組數據進行比較。

1.2.4 檢測小鼠肺組織p38MAPK 信號通路蛋白水平

將1.2.3 中回收了BALF 的小鼠肺組織取出、剪碎，液氮碾磨成細粉狀，按照 1 ∶ 5 質量與體積比加入裂解液，于冰上裂解 30 min，4℃ 12000 rpm 離心10 min 后分離上清待用。BCA 法測定上清中總蛋白濃度。以Western blot 的方法檢測各組小鼠肺組織中p-p38MAPK 蛋白質水平。

1.2.5 統計學分析

實驗結果數據使用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 病理切片HE 染色結果分析

HE 染色顯示：空白組小鼠氣道黏膜組織正常，見極輕微的炎性細胞浸潤，見圖1A；哮喘組小鼠小鼠氣道黏膜組織明顯增厚，且出現明顯的炎性細胞浸潤，顯示造模成功，見圖1B；哮喘+孟魯司特鈉組與哮喘+布地奈德組在HE 染色的結果觀察上無明顯差異，小鼠氣道均出現黏膜組織組織增厚和炎性細胞浸潤的現象但介于空白組與哮喘組之間，見圖1C 和1D；哮喘+聯合給藥組小鼠氣道亦出現黏膜組織增厚和炎性浸潤的現象但增厚程度與浸潤程度均明顯低于兩單一給藥組，見圖1E。

圖1 各組小鼠氣道組織的形態學變化（HE，160×）

圖2 各組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平的比較（，n=3）

圖3 p38 MAPK 通路蛋白在各組小鼠肺組織中的表達（，n=3）

2.2 各組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平比較

與空白組相比，哮喘組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平明顯升高（P＜0.05），哮喘+聯合給藥組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平明顯降低（P＜0.05）。與哮喘組相比，哮喘+孟魯司特鈉組、哮喘+布地奈德組、哮喘+聯合給藥組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平均明顯降低（P＜0.05）；而與哮喘+孟魯司特鈉組和哮喘+布地奈德組相比，哮喘+聯合給藥組小鼠肺泡灌洗液IL-5 水平明顯降低（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠肺組織p-p38MAPK 通路蛋白表達

與哮喘組相比，哮喘+孟魯司特鈉組、哮喘+布地奈德組、哮喘+聯合給藥組小鼠肺組織中p-p38MAPK水平均明顯降低（P＜0.05)。

與哮喘+孟魯司特鈉組相比，哮喘+聯合給藥組小鼠肺組織中p-p38MAPK 的水平明顯降低（P＜0.05)；但與哮喘+布地奈德組相比，哮喘+聯合給藥組小鼠肺組織中的p-p38MAPK 蛋白水平雖有降低，但無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

支氣管哮喘是一種在全球范圍內廣泛威脅人類健康的慢性呼吸系統疾病，具有多種治療的方向，其中臨床上廣泛采用吸入式布地奈德與孟魯司特鈉聯合給藥的方式進行治療，且在臨床結果上證明其具有很好的治療效果[11]，但其治療機理尚不明確。為此，本研究首先通過對各組小鼠進行OVA 法哮喘建模和分組給藥，結果顯示，與空白組相比哮喘組小鼠氣道黏膜組織明顯增厚，且出現明顯的炎性細胞浸潤，顯示造模成功。

與哮喘組相比，各給藥組小鼠氣道黏膜組織均出現不同程度的增厚且出現炎性細胞浸潤現象但程度均較輕，同時哮喘+聯合給藥組小鼠氣道增厚程度和炎性細胞浸潤程度最低。該結果初步表明吸入式布地奈德與孟魯司特鈉聯合給藥對哮喘具有明顯的療效上的優勢，但有關其作用機制尚不明確。

支氣管哮喘作為一種由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病，與氣道高反應性密切相關。其中嗜酸細胞的趨化是哮喘氣道炎性反應的關鍵環節，而IL-5 能夠促使嗜酸細胞向氣道炎性區域處遷移并誘導B 細胞產生IgE 抗體引發炎性效應[12]，因而肺泡灌洗液中IL-5 的水平與炎性效應的嚴重程度密切相關。本研究檢測結果顯示，與哮喘組、哮喘+孟魯司特鈉組、哮喘+布地奈德組相比，哮喘+聯合給藥組小鼠肺泡灌洗液中IL-5 水平存在明顯的下降趨勢，炎性效應明顯減輕。本研究結果顯示，孟魯司特鈉+吸入式布地奈德聯合給藥途徑能夠明顯降低哮喘肺泡灌洗液中IL-5 水平從而緩解小鼠疾病狀態，提示聯合給藥能夠通過抑制p38MAPK 通路進而抑制白細胞系分泌IL-5[13]，從而減輕哮喘炎性效應起到治療哮喘的作用。

對于本實驗中空白組小鼠肺泡灌洗液中IL-5 水平明顯低于哮喘+聯合給藥組的現象（P＜0.05），結合HE 染色結果中空白組小鼠氣道也出現了部分黏膜組織增厚和炎性浸潤現象，我們認為空白組小鼠由于實驗過程中的腹腔注射、灌胃、生理鹽水霧化以及日常飼養的過程中存在出現炎癥反應的現象[14]，且聯合給藥的抑制炎性反應的效果十分明顯，故會出現哮喘+聯合給藥組肺泡灌洗液IL-5 水平平均值低于空白組的現象。p38 途徑是MAPK 家族中的一個重要組成部分，其中p38δ主要在肺、腎、腸、唾液腺的表皮細胞及睪丸、卵巢、腎上腺和垂體表達，其與組織炎癥反應有密切地聯系[15]。既往研究表明，p38MAPK 通路能夠抑制哮喘的氣道炎癥[16]。并且p38MAPK 信號通路能夠在受到刺激的時候以磷酸化的方式激活，進而廣泛地參與到例如調控炎性反應的多種生物學效應中[17]。本研究檢測結果顯示，與哮喘+孟魯司特鈉組和哮喘+布地奈德組相比，哮喘+聯合給藥組小鼠肺組織中p-p38MAPK 的水平有降低的趨勢。本研究結果表明，孟魯司特鈉+吸入式布地奈德聯合給藥能夠通過抑制p38MAPK 磷酸化激活來降低哮喘炎性反應從而減輕哮喘癥狀。

綜上所述，本研究通過探究孟魯司特鈉+吸入式布地奈德聯合給藥對于哮喘模型小鼠炎性反應的作用發現，聯合給藥能夠有效改善哮喘的炎性反應的發生及發展，其機制可能與抑制體內p38MAPK 磷酸化激活有關。以上研究結果初步揭示了孟魯司特鈉+吸入式布地奈德聯合給藥對于哮喘的治療機制，為哮喘治療方法的優化以及新藥研發提供了可能的思路。但本研究也存在一定的局限性，未能從細胞層面對研究結果進行進一步論證。為此，本研究計劃在未來通過體外培養支氣管上皮細胞進一步明確孟魯司特鈉+吸入式布地奈德聯合給藥對于哮喘的治療機制，以期為哮喘臨床治療方法及新藥研發提供新的思路。