14種喀斯特地區(qū)植物藥提取物的體外抗氧化活性比較*

鄒健, 鄧婕, 王道平, 吳昌學(xué), 曾曉曉, 向潔, 冉龍艷, 肖霄,喻彥龍, 官志忠, ***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)教研室,貴州 貴陽(yáng),550004;2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng),550004;3.貴州省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng),550004;4.貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng),550014)

喀斯特地區(qū)植物藥基于獨(dú)特的地理環(huán)境、氣候因素和土壤因素等,通過(guò)單一或相互作用影響著藥用植物的品質(zhì)和療效,具有鮮明的地域性和民族特性[1];其含有的生物堿、黃酮類、皂苷、揮發(fā)油等有其獨(dú)特的藥理作用,對(duì)某些疾病的治療具有顯著優(yōu)勢(shì)[2-3],在抗氧化、抗炎、改善微血管內(nèi)皮炎癥損傷、抗白血病等方面有重要作用[4-5],其活性成分在抗氧化方面具有療效好、副作用少的優(yōu)點(diǎn)。氧化應(yīng)激與慢性氟中毒[6]、糖尿病[7]、高血壓[8]及肝纖維化[9]等疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),故抗氧化成為了治療的重要手段。但目前對(duì)藥物的抗氧化能力的評(píng)價(jià)沒(méi)有科學(xué)、有效的手段。以往的研究中,往往用單一抗氧化指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)藥用植物的抗氧化能力[10],或者雖然多種抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià),但沒(méi)有將各抗氧化指標(biāo)聯(lián)系起來(lái)[11],這樣往往無(wú)法準(zhǔn)確反映藥物的實(shí)際抗氧化能力。為解決這一情況,本研究選用了14種喀斯特地區(qū)具有經(jīng)濟(jì)和生態(tài)保護(hù)價(jià)值、且推廣應(yīng)用度較高的優(yōu)勢(shì)植物藥品種。構(gòu)建了體外抗氧化測(cè)定體系[12-15],分別檢測(cè)這些植物藥提取物的抗氧化能力,并且引入模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)分析法[16-17]的概念對(duì)植物藥和維生素C進(jìn)行抗氧化能力的綜合評(píng)價(jià)并排序,篩選出具有抗氧化價(jià)值的藥物,為后續(xù)的體內(nèi)藥物干預(yù)提供理論支持及指導(dǎo)作用,同時(shí)促進(jìn)喀斯特地區(qū)特色藥用資源的開發(fā)利用,也為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的藥物開發(fā)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植物藥提取物來(lái)源 選用14種植物藥(表1),仙桃草、錦茵陳、瓜子金、涼粉柴、響鈴草的供試部位為地上全株,吳茱萸、皂角、薏苡仁、菟絲子的供試部位為成熟果實(shí),一朵云的供試部位為全株,玉竹、鎖陽(yáng)、天冬、黃精的供試部位為塊莖,通過(guò)75%乙醇提取分別獲得這些藥物的提取物(由貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)。以上植物藥有效成分提取方法：藥材陰干,粉碎成大小約1 mm的粗粉,稱取約5 g,每次加10倍量75%乙醇溶液回流提取1.5 h,過(guò)濾待用。重復(fù)3次,合并提取液,減壓濃縮,蒸干乙醇,真空干燥得供試品。

表1 喀斯特地區(qū)植物藥的中、英文及拉丁文藥名Tab.1 Chinese, English, and Latin names of phytomedicines in Karst areas

1.1.2主要試劑和儀器 羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒(Micro Hydroxyl Free Radical Scavenging Capacity Assay Kit,貨號(hào)BCBC1325,中國(guó)SOLARBIO公司)、維生素C(ascorbic acid,貨號(hào)A8100,中國(guó)SOLARBIO公司)、大豆卵磷脂(L-α-Lecithin,貨號(hào)L8050,中國(guó)SOLARBIO公司)、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,貨號(hào)D807279-100 mg,中國(guó)MACKLIN公司)、鐵氰化鉀[potassium hexacyanoferrate(3-) ,貨號(hào)13746-66-2,中國(guó)天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司],上述化學(xué)試劑均為分析純。所使用的主要儀器有Varioskan LUX多功能微孔讀數(shù)儀(Thermo Fisher公司,美國(guó))、VCX750超聲破碎儀(Sonics公司,美國(guó))、Exceed-AC-08型超純水儀(艾科公司,中國(guó))、5424R型制冷微量高速離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó))。

1.2 研究方法

1.2.1喀斯特地區(qū)植物藥提取物的制備 取適量的14種植物藥提取物,分別加入去離子水制備成10 g/L的藥物混合液。將植物藥混合液經(jīng)超聲充分混勻后,使用無(wú)菌針頭過(guò)濾器過(guò)濾,將得到的濾過(guò)液加入去離子水分別稀釋成不同濃度(0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L)[18-19]備用。

1.2.2清除羥自由基能力的測(cè)定 羥自由基可以使組織中的糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化,遭受氧化性損傷和破壞,羥自由基清除能力是樣本抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。將實(shí)驗(yàn)分為空白組、陽(yáng)性對(duì)照組(維生素C)及實(shí)驗(yàn)組,其中實(shí)驗(yàn)組藥物濃度分別為0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L,實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵照羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。樣品混勻后37 ℃孵育60 min,10 000 r/min常溫離心10 min,取200 μL上清液于96 孔板中536 nm處測(cè)定其吸光度。空白管、對(duì)照管和測(cè)定管的吸光值分別記為A空、A對(duì)及A實(shí)。羥自由基清除率D(%)=(A實(shí)-A對(duì))/(A空-A對(duì))×100%。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差[12]。

1.2.3清除2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力測(cè)定 稱取4 mg DPPH,用無(wú)水乙醇100 mL配制成0.04 g/L的DPPH乙醇溶液。實(shí)驗(yàn)分為空白組、陽(yáng)性對(duì)照組(維生素C)及實(shí)驗(yàn)組,其中實(shí)驗(yàn)組濃度分別為0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L的待測(cè)藥物溶液500 μL,再加入DPPH 500 μL,充分混勻,室溫反應(yīng)30 min后,取200 μL混合液于96 孔板內(nèi)測(cè)其在517 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的吸光值分別記為Ao和As(無(wú)水乙醇代替待測(cè)液)。DPPH自由基清除率=(Ao-As)/Ao×100%。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差[13]。

1.2.4鐵氰化鉀還原能力測(cè)定 以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照,分別取0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L的待測(cè)藥物溶液200 μL于試管中,隨后加入PBS 500 μL,以保證溶液反應(yīng)的PH環(huán)境。再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鐵氰化鉀溶液500 μL,搖勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min。冰水中快速冷卻后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸500 μL,反應(yīng)完全后,4 000 r/min常溫離心10 min。取上清液500 μL,依次加入去離子水500 μL和0.1%三氯化鐵(FeCl3)溶液100 μL,充分混勻后靜置10 min,取200 μL混合液于96孔板于700 nm處測(cè)定吸光值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差[14]。藥物中的抗氧化活性成分能使Fe3+還原成Fe2+,Fe2+進(jìn)一步和FeCl3反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸收的藍(lán)色沉淀,通過(guò)測(cè)定吸光度值可間接評(píng)價(jià)抗氧化劑的還原能力。所測(cè)藥物的還原能力越強(qiáng),測(cè)得的吸光度值越大。

1.2.5抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力測(cè)定 稱取30 mg大豆卵磷脂(LLS)溶于30 mL pH7.4的10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,經(jīng)超聲充分混勻后,冰水浴保存?zhèn)溆谩⑷宜?TFA)15 g、硫代巴比妥酸(TBA)0.375 g和濃鹽酸2.1 mL依次溶于100 mL去離子水,配制得TFA-TBA-HCl混合液。依次向試管中加入LLS溶液200 μL, 0.4 mol/L硫酸亞鐵200 μL和濃度分別為0、0.05、0.1、2.5、5及10 g/L的待測(cè)藥物溶液200 μL,混勻后37 ℃水浴避光反應(yīng)60 min。隨后加入TFA-TBA-HCl混合液400 μL,于90～100 ℃水中反應(yīng)15 min,冰水浴中迅速冷卻,終止反應(yīng)。將混合液4 000 r/min離心10 min,取上清液200 μL于96孔板在532 nm處測(cè)定吸光值。每組試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值并求標(biāo)準(zhǔn)差[14]。大豆卵磷脂可通過(guò)一系列反應(yīng)后能生成粉紅色染料,抗氧化物與脂質(zhì)過(guò)氧自由基反應(yīng)從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的過(guò)程,表現(xiàn)為染料減少,吸光度值降低。即物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng),測(cè)得的吸光度值越小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2010和GraPhpad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,再利用隸屬函數(shù)法對(duì)14種喀斯特植物藥進(jìn)行體外抗氧化能力的綜合評(píng)價(jià)及篩選。隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：R (Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。式子中Xi為某藥物的某一指標(biāo)的測(cè)定值,Xmax為所有品種該指標(biāo)測(cè)定值中的最大值,Xmin為所有藥物該指標(biāo)測(cè)量值中的最小值,若某一指標(biāo)與藥物濃度呈負(fù)相關(guān),則可通過(guò)反隸屬函數(shù)公式計(jì)算其抗氧化能力的隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 喀斯特地區(qū)植物藥清除羥自由基能力測(cè)定

對(duì)14種喀斯特地區(qū)植物藥進(jìn)行清除羥自由基能力進(jìn)行檢測(cè),其中有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果如圖1所示,在0～10 g/L藥物濃度,錦茵陳、天冬、涼粉柴及瓜子金的藥物濃度與羥自由基清除率之間存在量效關(guān)系,除仙桃草和瓜子金外其余樣品都隨著濃度的增大,清除率逐漸增大。仙桃草和瓜子金在0.05 g/L時(shí)已達(dá)最大清除率,提示低濃度的仙桃草和瓜子金有較強(qiáng)的抗氧化能力,且能預(yù)測(cè)半抑制濃度(IC50)值小于涼粉柴,但瓜子金的羥自由基清除率隨著濃度增加而下降。以上藥物表現(xiàn)出了較強(qiáng)的羥自由基清除能力,且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組,其余藥物羥自由基清除率較低且弱于對(duì)照組。多種受測(cè)植物藥對(duì)羥自由基的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)橄商也荨⒐献咏?涼粉柴>天冬>錦茵陳>維生素C>其余藥物(除仙桃草、瓜子金及其他藥物外,IC50依次為0.298、2.248、2.741、7.232 g/L)。

圖1 14種喀斯特地區(qū)植物藥、維生素C對(duì)羥自由基的清除率Fig.1 Hydroxyl radical scavenging rates of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.2 喀斯特地區(qū)植物藥清除DPPH自由基

對(duì)14種喀斯特地區(qū)植物藥進(jìn)行清除DPPH自由基能力檢測(cè),其中有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果如圖2所示,所測(cè)藥物均表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性,隨著濃度的增加,清除能力增強(qiáng)。在0～10 g/L藥物濃度范圍內(nèi),DPPH自由基清除能力稍遜或與對(duì)照組相當(dāng)。多種受測(cè)植物藥對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)弱順序?yàn)榫S生素C>鎖陽(yáng)>吳茱萸>響鈴草>皂角>薏苡仁>仙桃草>其余藥物(除其他藥物外,IC50依次為0.222、0.224、0.226、0.687、0.919、1.183、1.999 g/L)。

圖2 14種喀斯特地區(qū)植物藥、維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rates of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.3 喀斯特地區(qū)植物藥的還原能力

對(duì)14種喀斯特地區(qū)植物藥進(jìn)行還原能力檢測(cè),其中有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果如圖3所示,所測(cè)藥物均具有一定的還原能力,在0～10 g/L藥物濃度范圍內(nèi),與羥自由基清除率之間存在量效關(guān)系。隨著藥物濃度的增加其在700 nm處的吸光度也逐漸增加,即還原能力增強(qiáng)。吳茱萸、仙桃草、鎖陽(yáng)、錦茵陳及菟絲子的還原能力比陽(yáng)性對(duì)照組強(qiáng),響鈴草和皂角的還原能力與陽(yáng)性對(duì)照組相近,其余植物藥的還原能力弱于陽(yáng)性對(duì)照組。

圖3 14種喀斯特地區(qū)植物藥、維生素C的還原能力Fig.3 Reducing ability of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.4 喀斯特地區(qū)植物藥抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力

14種喀斯特地區(qū)植物藥進(jìn)行抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力檢測(cè),其中有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果如圖4所示,在0～10 g/L藥物濃度范圍內(nèi),所測(cè)藥物均具有一定的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。存在一定的量效關(guān)系,隨著藥物濃度的增加其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力越強(qiáng)。多種受測(cè)植物藥抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)闆龇鄄?仙桃草>響鈴草>吳茱萸>菟絲子>玉竹>瓜子金>天冬>維生系C>其他藥物(除其他藥物外,IC50依次為0.122、0.250、0.256、0.471、0.590、1.318、3.381、4.100、8.915 g/L)。

圖4 14喀斯特地區(qū)植物藥、維生素C對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率Fig.4 Inhibition activity on lipid peroxidation of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

2.5 隸屬函數(shù)分析對(duì)喀斯特地區(qū)植物藥抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)

由表2可以看出14種植物藥按隸屬函數(shù)加權(quán)值大小排列分別為仙桃草>吳茱萸>維生素C>涼粉柴>響鈴草>鎖陽(yáng)>天冬>皂角>瓜子金>薏苡仁>菟絲子>錦茵陳>黃精>一朵云>玉竹,反映了這些藥物抗氧化能力的強(qiáng)弱順序。這些藥物中仙桃草和吳茱萸的加權(quán)值高于維生素C,展現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力。

表2 14種植物藥和維生素C的隸屬函數(shù)值Tab.2 Membership function values of 14 Karst-area phytomedicines and Vitamin C

3 討論

本研究對(duì)14種喀斯特地區(qū)優(yōu)勢(shì)植物藥提取物進(jìn)行了清除自由基、還原金屬離子和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等抗氧化能力的綜合檢測(cè),結(jié)合隸屬函數(shù)分析,對(duì)14植物藥和維生素C的抗氧化能力強(qiáng)弱進(jìn)行了綜合客觀的評(píng)價(jià)及排序。目前隸屬函數(shù)多用于對(duì)農(nóng)作物的抗逆性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[16,20],鮮見用于植物藥的抗氧化能力評(píng)價(jià)。引入隸屬函數(shù)分析,提供了一條在多指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上對(duì)藥物抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的途徑,更具科學(xué)性和信服力。解決了單一指標(biāo)或者多指標(biāo)評(píng)價(jià)但無(wú)整體分析對(duì)比抗氧化能力的局限性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)仙桃草的抗氧化能力最為顯著。

仙桃草為玄參科植物蚊母草的帶蟲癭的全草,其性味甘、苦,其主要含黃酮類和酚酸類成分[21-22],多用于外傷止血[23]、促進(jìn)骨愈合[24],仙桃草中的活性物質(zhì)具有抗癌作用[25-26]。但有關(guān)仙桃草抗氧化應(yīng)激的文獻(xiàn)報(bào)道較少,有學(xué)者從仙桃草中提取了8個(gè)環(huán)烯醚萜苷和4個(gè)酚類化合物,發(fā)現(xiàn)部分成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性[27]。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了仙桃草具有較顯著的抗氧化能力,此外天然抗氧化活性成分與合成的抗氧化劑相比,具有毒性小活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[28],具有極大的發(fā)掘潛力。

本研究處于對(duì)植物藥提取物的抗氧化能力的初步研究階段。植物藥提取物是化合物,其成分繁雜,各組成成分之間的功效及抗氧化作用不甚清楚[29-30]。明確有效的抗氧化單體成分(如多酚類、維生素類、多糖類等)是極為必要的,不同的抗氧化成分之間可具有協(xié)同性,聯(lián)合使用時(shí)能更好地增加療效和降低成本[31]。后續(xù)可通過(guò)高通量分子篩選[32]等手段,從分子、細(xì)胞水平對(duì)仙桃草和吳茱萸等進(jìn)行檢測(cè),以期發(fā)現(xiàn)抗氧化的新靶標(biāo)或潛在的有效成分,最終用于以氧化應(yīng)激升高為主要發(fā)病機(jī)制的疾病的干預(yù)治療。綜上所述,喀斯特地區(qū)植物藥是我國(guó)醫(yī)藥的重要寶庫(kù),對(duì)其有效成分的研究應(yīng)不僅僅局限于抗氧化功效,在抗炎、抗菌、抗腫瘤等方面可能有著巨大潛力,值得進(jìn)一步深入研究。