體外沖擊波療法對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜和軟骨組織炎癥因子的影響及機(jī)制*

楊興月, 黃圓月, 安松松, 毛冬梅, 黃媛馨, 楊俊龍, 于子龍, 秦樂(lè), 王林, 沃春新***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 疼痛科, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎 (knee osteoarthritis, KOA),也稱(chēng)為慢性退行性關(guān)節(jié)炎,是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病,會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的關(guān)節(jié)功能障礙[1]。KOA患者的主要癥狀包括疼痛、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限,晚期還會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,甚至關(guān)節(jié)出現(xiàn)嚴(yán)重的內(nèi)翻、外翻畸形或屈曲攣縮畸形,降低患者的生活質(zhì)量[2]。有數(shù)據(jù)顯示,全球患KOA人數(shù)已達(dá)2.5 億[3]。研究表明,促炎細(xì)胞因子作為KOA的生化標(biāo)志物,如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及IL-6等在患者膝關(guān)節(jié)內(nèi)明顯升高[4];膝關(guān)節(jié)疼痛是KOA患者的主要癥狀,非甾體類(lèi)抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和阿片類(lèi)藥物可以緩解此疼痛癥狀,但NSAIDs易導(dǎo)致消化道潰瘍、出血和血小板下降、肝毒性等副作用,阿片類(lèi)藥物則易產(chǎn)生藥物成癮、認(rèn)知障礙、譫妄、跌倒和骨折等風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。KOA 疼痛的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜,可能與炎性疼痛(外周敏化)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)的敏感性改變(中樞痛覺(jué)敏化)有關(guān)[7];滑膜炎通過(guò)炎癥介質(zhì)引起疼痛,膝關(guān)節(jié)疼痛與 KOA患者滑膜炎的程度之間存在關(guān)聯(lián)[8];MIA誘導(dǎo)的KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨分解,軟骨下骨暴露并且損傷,支配軟骨下骨的神經(jīng)活動(dòng)和敏感性發(fā)生變化,會(huì)導(dǎo)致晚期骨關(guān)節(jié)炎的疼痛[9];軟骨降解產(chǎn)物可以促進(jìn)炎癥因子和化學(xué)物質(zhì)的釋放,這些物質(zhì)通過(guò)直接刺激傷害感受器、降低其疼痛閾值引發(fā)疼痛,炎性介質(zhì)也可刺激暴露的軟骨下骨內(nèi)的神經(jīng)而產(chǎn)生疼痛[10]。目前許多治療方法對(duì)KOA患者疼痛癥狀均未達(dá)到滿(mǎn)意的治療效果,減輕KOA患者痛覺(jué)敏化、防止KOA患者疼痛癥狀從急性疼痛向慢性持續(xù)性疼痛的轉(zhuǎn)變將是緩解KOA患者疼痛的一種潛在有效的、新穎的方法;減輕KOA患者的滑膜與軟骨組織的炎癥可能會(huì)延緩?fù)从X(jué)敏化,從而減輕KOA患者疼痛癥狀。許多臨床研究表明,體外沖擊波療法(extracorporeal shockwave therapy,ESWT)可以減輕KOA患者疼痛癥狀,改善膝關(guān)節(jié)功能[11-12],但其機(jī)制尚不清楚。因此,本研究欲探討ESWT對(duì) KOA大鼠滑膜及軟骨組織炎癥因子的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠30只,體質(zhì)量300 g,購(gòu)自北京華阜康科技股份有限公司[許可證號(hào)SCXK(京)2019-0008],飼養(yǎng)于室溫(23±1)℃的房間,12 h/12 h明暗循環(huán),自由進(jìn)食進(jìn)水;適應(yīng)飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑和儀器 碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate,MIA;貴陽(yáng)超研遠(yuǎn)誠(chéng)生物科技有限公司),多聚甲醛溶液(貴州偉博鑫生物科技有限公司),兔多克隆抗體 Anti-IL-1β抗體、兔多克隆抗體 Anti-TNF-α抗體、兔多克隆抗體 Anti-IL-6抗體(Affinity生物技術(shù)有限公司),免疫組織化學(xué)二抗辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白 G(immunoglobulin G,IgG ;武漢塞維爾生物科技有限公司);病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司),脫水機(jī)(意大利迪佩斯公司),PL-200熱刺痛儀(成都泰盟軟件有限公司),Von Frey纖維絲、電子測(cè)痛儀足底刺痛儀(ZS-PM,上海玉妍科學(xué)儀器有限公司),包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司),其余試劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1造模及實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組(n=10)、模型組(n=10)及沖擊波組(n=10),均予10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,于右側(cè)膝關(guān)節(jié)處剃毛器備皮、碘伏消毒;對(duì)照組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注射0.9%生理鹽水50 μL,模型組和沖擊波組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注射2 mg/50 μL MIA構(gòu)建KOA大鼠模型;造模后第14天,沖擊波組大鼠內(nèi)側(cè)軟骨下骨區(qū)域涂適量耦合劑后行體外沖擊波治療(1.0 bar,6 Hz,800 次;治療探頭為15 mm發(fā)散式;1次/周、共4次),對(duì)照組與模型組大鼠不予沖擊波干預(yù),僅予沖擊波聲音刺激。

1.2.2右后爪熱縮爪潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)檢測(cè) 各組大鼠于術(shù)前 (baseline, BL)和術(shù)后第3、7、14、21、28、35及42天測(cè)量PWTL。各組大鼠置于PL-200熱刺痛儀的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)箱,待其適應(yīng)安靜后,記錄大鼠右后爪從開(kāi)始加熱到抬起或舔后爪的間隔時(shí)間,測(cè)量時(shí)間不超過(guò)20 s;每只大鼠測(cè)量3次,間隔時(shí)間>15 min/次,取平均值做為PWTL。

1.2.3右后爪足底機(jī)械刺激縮足閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT)檢測(cè) 各組大鼠于BL和術(shù)后第3 、7、14、21、28、35及42天測(cè)量MWT。采用足底刺痛儀(ZS-PM)測(cè)量MWT,將各組大鼠放置于底部為網(wǎng)格的有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)20 min,四肢不頻繁活動(dòng)后開(kāi)始測(cè)定。觀察者未知測(cè)試時(shí)大鼠的分組。用標(biāo)準(zhǔn)化的纖維絲馮弗雷刺激大鼠右后爪中部足底,從2 g開(kāi)始,纖維絲彎曲至“C”或“S”型并維持4～8 s,觀察各組大鼠縮足反應(yīng)并記錄,陰性反應(yīng)則給予大一級(jí)力度纖維絲進(jìn)行刺激,陽(yáng)性反應(yīng)則給予小一級(jí)力度纖維絲進(jìn)行刺激,出現(xiàn)陰性到陽(yáng)性或陽(yáng)性到陰性變化時(shí)的最小陽(yáng)性纖維絲力度為MWT,以g為單位。

1.2.4右膝關(guān)節(jié)X線(xiàn)檢查 各組大鼠于術(shù)后第42天給予10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥位于檢查臺(tái),調(diào)整大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)置于檢查臺(tái)中央十字線(xiàn)中點(diǎn)處,行X線(xiàn)檢查。

1.2.5免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)右側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1β、IL-6及TNF-α 表達(dá) 取“1.2.4”X線(xiàn)檢查后各組大鼠,予2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,開(kāi)胸經(jīng)心臟灌注4% 多聚甲醛,取右側(cè)膝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛固定24 h,置于20%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)脫鈣液(25～30 ℃)中脫鈣,每2天觀察1次;至針可扎動(dòng)骨頭時(shí)(約1個(gè)月)取出,脫水,石蠟包埋、切片,滴加pH為8.0的EDTA抗原修復(fù)液至完全覆蓋組織,37 ℃烤箱孵育30 min,自然冷卻,玻片置于pH為7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)中于脫色搖床上晃動(dòng),洗滌3次、5 min/次;切片放入3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min,洗滌,加3%牛血清白蛋封閉30 min,分別加兔抗鼠抗體IL-1β、IL-6及TNF-α的一抗抗體,濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG,室溫孵育50 min;洗滌,滴加新鮮配制二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色液,蘇木素復(fù)染3 min、水洗,沖洗,蘇木素返藍(lán)液返藍(lán),沖洗,切片依次放入梯度酒精、二甲苯Ⅰ中脫水透明,取出晾干,封片,置于白光顯微鏡下進(jìn)行觀察滑膜組織,使用Image J軟件(美國(guó)National Institutes of Health 公司)分析免疫組織化學(xué)平均光密度(mean optical density,MOD)值。

1.2.6免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)右側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α 表達(dá) 取“1.2.4”X線(xiàn)檢查后各組大鼠,予2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌注后,取右側(cè)膝關(guān)節(jié)置于4%多聚甲醛固定24 h,于20% EDTA脫鈣液中脫鈣,脫鈣完成后取出脫水,石蠟包埋、切片后,滴加pH為8.0的EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)30 min,洗滌后切片放入3%雙氧水溶液,室溫避光孵育25 min,洗滌,加3%牛血清白蛋封閉30 min,分別加兔抗鼠抗體IL-1β、IL-6及TNF-α的一抗抗體,濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜;加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG,室溫孵育50 min;洗滌后滴加DAB顯色液,蘇木素復(fù)染3 min,水洗后蘇木素返藍(lán)液返藍(lán),沖洗,切片依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ5 min、正丁醇5 min、二甲苯Ⅰ5 min 中脫水透明,取出晾干,封片,置于白光顯微鏡下進(jìn)行觀察軟骨組織,使用Image J軟件分析免疫組織化學(xué)MOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PWTL

術(shù)后第3、7、14、21、28、35及42天,模型組與沖擊波組大鼠PWTL較對(duì)照組時(shí)間縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后第21天,沖擊波組大鼠PWTL時(shí)間較模型組延長(zhǎng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但術(shù)后第28～42天時(shí)2組比較、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)Tab.1 PWTL in three groups at each time

2.2 MWT

術(shù)后第3～42天,模型組與沖擊波組大鼠MWT均較對(duì)照組降低(P<0.05);術(shù)后第21～42天,沖擊波組大鼠與模型組相比MWT值升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠術(shù)后各時(shí)點(diǎn)Tab.2 MWT in three groups at each time

2.3 右膝關(guān)節(jié)X線(xiàn)特征

對(duì)照組大鼠右膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)間隙均勻,膝關(guān)節(jié)對(duì)線(xiàn)良好,關(guān)節(jié)面平整光滑,關(guān)節(jié)邊緣整齊規(guī)則、無(wú)骨贅,關(guān)節(jié)內(nèi)無(wú)游離體;模型組大鼠右膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)間隙明顯狹窄,膝關(guān)節(jié)對(duì)線(xiàn)不齊,關(guān)節(jié)面粗糙變形,關(guān)節(jié)邊緣有骨贅形成;沖擊波組大鼠右膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)間隙狹窄較模型組改善,膝關(guān)節(jié)對(duì)線(xiàn)不齊且較模型組輕,關(guān)節(jié)面粗糙變形且較模型組改善,關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成且較模型組減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠右膝關(guān)節(jié)的X線(xiàn)檢查結(jié)果Fig.1 X-ray examination results of right knee joint of rats in each group

2.4 滑膜組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)

與對(duì)照組比較,模型組、沖擊波組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)增加(P<0.05);與模型組比較,沖擊波組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)減少(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5 軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)

與對(duì)照組比較,模型組與沖擊波組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,沖擊波組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織TNF-α、IL-1β及IL-6表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

注：A、B分別為軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的染色結(jié)果和定量結(jié)果;(1)與對(duì)照組比較,P<0.05;(2)與模型組比較,P<0.05。

3 討論

KOA是一種高發(fā)病率的慢性進(jìn)行性疾病,可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,其中疼痛是最常見(jiàn)癥狀,易發(fā)展為慢性疼痛[13]。KOA病理改變主要包括軟骨退化、軟骨下骨硬化、骨贅形成、滑膜炎癥及韌帶鈣化[14],其中滑膜炎癥是其病理變化的重要特征[15]。林璐璐等[16]認(rèn)為KOA疼痛的原因包括外周和中樞敏化,炎癥反應(yīng)是KOA患者膝關(guān)節(jié)疼痛的驅(qū)動(dòng)因素,巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、炎癥介質(zhì)等均參與了KOA疼痛致敏的發(fā)生,導(dǎo)致了外周傷害感受器和脊髓神經(jīng)元的敏化。 痛覺(jué)敏化在慢性疼痛中扮演著至關(guān)重要的角色,如在KOA的病理過(guò)程中,關(guān)節(jié)內(nèi)的結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)、細(xì)胞及生化均會(huì)發(fā)現(xiàn)變化,易引起傷害性輸入的增加,從而導(dǎo)致痛覺(jué)敏化[17];臨床上KOA患者約20%可出現(xiàn)痛覺(jué)敏化現(xiàn)象,與單側(cè)或雙側(cè)受累無(wú)關(guān)[18-19]。Neogi等[20]研究表明,滑膜炎癥與KOA疼痛致敏有關(guān),早期靶向炎癥是預(yù)防KOA致敏的治療方法,可減輕疼痛嚴(yán)重程度;也有研究顯示,滑膜炎癥與膝關(guān)節(jié)疼痛有關(guān),滑膜炎是膝關(guān)節(jié)炎抗炎療法的候選治療靶點(diǎn),可發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[21]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),PWTL時(shí)間逐漸縮短,MWT閾值逐漸降低,表明KOA大鼠在形成慢性疼痛的過(guò)程中出現(xiàn)了痛覺(jué)敏化,ESWT可延長(zhǎng)降低KOA大鼠的PWTL,升高其MWT,從而改善其痛覺(jué)過(guò)敏。

KOA炎癥產(chǎn)生的IL-1β、IL-6及TNF-α不僅是關(guān)節(jié)炎癥和進(jìn)一步變性的介質(zhì),還可激活傷害感受器,誘導(dǎo)或促進(jìn)炎癥性疼痛以及神經(jīng)性疼痛,從而導(dǎo)致痛覺(jué)敏化[22]。有研究顯示,KOA患者滑液、滑膜及軟骨的IL-1β、IL-6及TNF-α水平升高[23],提示IL-1β、IL-6及TNF-α是KOA炎癥產(chǎn)生的主要促炎細(xì)胞因子。IL-1β可刺激IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的釋放[24];IL-1β、IL-6及TNF-α可直接作用于關(guān)節(jié)傷害性感受器導(dǎo)致疼痛癥狀,也可影響沿神經(jīng)軸的多個(gè)點(diǎn)的疼痛反應(yīng),增加感覺(jué)神經(jīng)的興奮性導(dǎo)致慢性疼痛[25]。本研究結(jié)果顯示,ESWT可降低KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子水平。

ESWT是一種將機(jī)械性脈沖聲波轉(zhuǎn)換為彈道式?jīng)_擊波,進(jìn)而作用于人體局部組織的物理療法,是肌肉骨骼系統(tǒng)疾病的許多病理改變的安全有效的治療方法,已用于許多肌肉骨骼疾病,具有無(wú)創(chuàng)、安全及有效等特點(diǎn)[26]。沖擊波可以產(chǎn)生間質(zhì)和細(xì)胞外反應(yīng),如緩解疼痛、血管形成、蛋白質(zhì)生物合成、細(xì)胞增殖、神經(jīng)和軟骨保護(hù)以及破壞肌肉骨骼結(jié)構(gòu)中的鈣沉積[27];沖擊波具有組織損傷修復(fù)重建、組織粘連松解、擴(kuò)張血管和血管再生作用、鎮(zhèn)痛及神經(jīng)末梢封閉作用、高密度組織裂解、炎癥及感染控制等生物作用[28]。Abe等[29]研究顯示,低能量ESWT在急性心肌梗死大鼠模型中除血管生成作用外,還有抗炎作用;多數(shù)臨床研究亦表明,ESWT對(duì)KOA患者具有治療作用[30-32]。本研究結(jié)果顯示,ESWT可降低KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)。

綜上所述,ESWT可降低KOA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨組織IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá),從而改善KOA炎癥;還可緩解KOA大鼠痛覺(jué)敏化癥狀,其機(jī)制可能與沖擊波改善局部炎癥因子的分泌、減少炎癥反應(yīng)有關(guān)。因此,本研究表明了ESWT對(duì)KOA具有治療作用,從而有助于推動(dòng)ESWT用于KOA的臨床治療。