基于網絡藥理學與分子對接探討參芪白石湯治療胃癌的機制

楊從影,唐莉華,孫龍華,羅 江,黃學娣

(1.江西省中西醫結合醫院 藥物臨床試驗機構辦公室,江西 南昌 330002;2.南昌大學第一附屬醫院 呼吸內科,江西 南昌 330006)

胃癌(gastric cancer,GC)起源于黏膜上皮細胞,是常見的消化道惡性腫瘤之一,是全球第四大常見癌癥,我國發病率位居世界第二[1-2]。中醫認為,胃癌是素體脾胃虧虛,復加外感六淫,飲食失調、情志紊亂等多種因素,導致氣血痰濕毒等多種病理產物夾雜的結果,歸納為痰氣瘀滯、胃熱傷陰、寒凝氣滯[3];治療多以化痰解毒、健脾益氣、溫中散寒為主,且不良反應少,契合胃癌復雜的病情特點[4-6]。

參芪白石湯(SBD)由黨參、黃芪、白術、白英、白花蛇舌草等中草藥組成,有健脾利濕、清熱解毒之功效,用于晚期胃癌、正虛邪實者,可隨癥加減[7]。本研究通過數據挖掘、GEO數據庫和分子對接的網絡藥理學方法,探討SBD治療胃癌GC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 SBD有效成分及靶點挖掘 通過查閱文獻[8]可知,SBD由白花蛇舌草、白術、黃芪、黨參、七葉一枝花、仙鶴草、石見穿、薏仁、白英9味中藥組成,利用中藥系統藥理學分析平臺 TCMSP( http: // lsp. nwu. edu. cn / tcmsp. Php)設置口服生物利用度 ( OB) ≥ 30% 、類藥性 (DL) ≥0.18篩選,并結合《中藥大辭典》進行補充,最后利用有機小分子生物活性數據 Pubchem ( https: // pubchem. ncbi. nlm. nih. gov / ) ,查詢篩選出的化合物結構式,并復制化合物的 SMILES 表達式,通過SIB分子構效相似性分析平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測靶點蛋白,然后使用Uniprot(http://www.uniprot.org)數據庫將所得靶點蛋白進行規范化處理。

1.2 GC差異表達基因的篩選 從 GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索組織來源為人,同時含有胃癌組織和正常胃組織樣本的基因表達數據集,篩選出 GSE118916探針芯片數據集,包含15個胃癌組織和 15個正常胃組織樣本基因表達譜,并利用 R語言的Limma 軟件包對芯片進行基因差異分析,用python軟件繪制火山圖,根據相關參數P.adjust<0.05和差異倍數logFC>1或<-1作為篩選條件。

1.3 交集靶點獲取及核心基因的篩選 為進一步明確藥物作用靶點與GC差異表達基因之間的關系,本研究將上述藥物與疾病靶點信息輸入在線Venn分析工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),繪制韋恩圖,獲得藥物與疾病的交集靶點,然后將交集靶點輸入蛋白互作和預測數據庫STRING(https://string-db.org/),生物種類選擇“Homo sapiens”,閾值設置為“medium confidence”(>0.4),其他參數選擇默認值,得到交集靶蛋白PPI網絡圖。并獲取其tsv格式,將其導入Cytoscape軟件中“Network Analyzer”插件分析網絡中各靶點的度中心性(DC)、中介中心性(BC)和緊密中心性(CC)3種拓撲屬性。

1.4 PPI蛋白互作網絡構建 利用蛋白互作和預測STRING 在線數據庫( https: // string-db.org / ) 構建核心靶點的蛋白-蛋白互作網絡即PPI網絡,利用Cytoscape v 3.9.1構建可視化網絡圖,并利用“Network Analyzer”插件根據DC、BC、CC值繪制核心靶蛋白PPI網絡圖。

1.5 GO和KEGG功能富集分析 將核心靶點導入在線分析平臺Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1),以“Homo sapiens”背景,設置閾值為,P Value Cutoff<0.01、Min Overlap(最小計數為3)、Min Enrichment(富集因子)>1.5, 對核心基因進行GO和KEGG功能富集分析。

1.6 核心基因的數據庫驗證 通過THPA(The Human Proterin Atlas)數據庫(https://www.proteinatlas.org/)獲得核心基因的蛋白表達情況,分析核心基因的蛋白免疫組化結果。

1.7 核心基因與主要化合物分子對接 通過Pubchem數據庫下載SBD中主要成分的2D結構,利用Chem3D21.0將小分子化合物的2D結構轉化為3D結構,在PDB數據庫 (http://www.rcsb.org/)中獲得蛋白三維結構并保存為PDB格式,用Pymol對蛋白去水及官能團,并用AutoDock加氫,保存為pdbqt格式作為分子對接受體,采用Vina1.2.0軟件進行分子對接,調整對接盒子大小到剛好包含蛋白的結合位點,并選取對接最佳構象作為分子對接結果,對結合能 (affinity) 評分并進行排序,結合能數值越低,表明結合越好,最后使用Pymol軟件對所得對接結果進行可視化展示。

2 結果

2.1 SBD活性成分篩選及靶點 通過查閱文獻得到SBD由9味中藥組成,在TCMSP數據庫中根據篩選條件OB≥30%和 DL≥0.18,共獲得63種有效成分,見表1,通過SIB分子構效相似性分析平臺,去重后使用Uniprot 數據庫將所得靶點蛋白進行規范化處理,結果共獲得930個有效靶點。

表1 SBD有效成分信息

2.2 GC差異表達基因獲取 使用 R語言Limma軟件包對GSE118916探針芯片數據集進行基因差異分析,去重后獲得1 933個GC差異表達基因,其中上調759 個,下調有1 174個,結果用生信繪制火山圖,如圖1所示。

圖1 GC差異表達基因火山圖

2.3 交集靶點獲取及核心基因的篩選 將SBD對應靶點與GC差異表達基因導入Venn分析工具,共獲得交集靶點142個,將其導入STRING數據平臺中構建PPI網絡圖,見圖2,去除未參與相互作用靶點,共有133個節點,534條邊,平均度值8.03,采用DC、BC、CC 3個參數來選擇節點,通過第一輪篩選閾值DC≥11、BC≥0.368、CC≥0.024,得到25條邊和110個節點;第二輪篩選閾值為DC≥17、BC≥0.015、CC≥0.447,共10條邊,41個節點。核心靶點及拓撲參數信息見表2。

注:A.交集靶點PPI蛋白互作網絡圖,線的粗細表示置信度大小;B.采用DC、BC、CC 3個參數來選擇節點,DC值越高的節點顏色越鮮艷、越大。

表2 SBD治療GC的核心靶點及其拓撲參

2.4 GO和KEGG功能富集分析 在Metascape在線數據庫平臺對10個核心靶點進行GO生物過程富集分析,經過篩選共涉及14個生物過程條目,包括平滑肌細胞增殖的調節、平滑肌細胞增殖的正向調節、對肽的反應、凋亡過程的正向調節、血管相關平滑肌細胞增殖的調節等。見表3。

表3 14個GO生物過程的聚類條目富集分析結果

為了進一步分析GO條目間的關系,選取子集豐富的條目,其中相似性為> 0.3的條目由邊連接,選擇P值最好的條目,限定每個聚類中的條目不超過15個,總數不超過250個,使用Cytoscape對網絡進行可視化,見圖3,其中每個節點表示一個GO條目。

注:A.按富集分析結果集群分類著色,具有相同集群的節點通常彼此靠近;B.根據P值大小,顏色越淺P值越大,P值越顯著富集的基因越多。

KEGG通路富集分析,設置閾值為:P Value Cutoff<0.01,Min Overlap(最小計數為3)、Min Enrichment(富集因子)>1.5。經過篩選,核心基因顯著富集在15條通路上(FDR<0.05),涉及癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等,見表4、圖4。

表4 排名前4個KEGG聚類條目富集分析結果

2.5 核心靶點的數據庫驗證 通過THPA數據庫獲得核心基因的蛋白免疫組化結果,如封三圖2所示,ICAM1、PTGS2、PPARG在GC組織中呈強陽性表達,PTGS2在正常組織中不表達,PPARG在正常組織中呈高表達,ICAM1在正常組織中呈中等表達;MMP9在GC組織中呈中等表達,在正常組織中不表達。

2.6 核心靶點與主要有效成分分子對接 根據度值排名選取度值較高的槲皮素Quercetin(degree=29)、3-Epioleanolic acid 3-表齊墩果酸(degree=51)、diosgenin,1薯蕷皂苷(degree=23)、Foliosidine單葉蕓香定(degree=20)、Mandenol扁桃醇(degree=17)與11個核心靶點進行分子對接,對接結果均小于-5.0 kcal/mol,說明SBD的主要生物活性成分與靶點具有較強的結合活性結合能,其中3-表齊墩果酸和槲皮素與核心靶點結合性最優(圖5),IL6、PTGS2與3-表齊墩果酸結合能分別為-8.1 kcal/mol、-7.9 kcal/mol;MMP-2、MMP-9與槲皮素結合能分別為-8.8 kcal/mol、-8.0 kcal/mol。

注:A. IL-6&3-Epioleanolic acid;B. MMP-2&Quercetin;C.PTGS2&3-Epioleanolic acid;D. MMP-9&Quercetin。

3 討論

中醫藥具有多成分、多靶點的藥效作用,能整體調節機體的異常活動。基于“扶正祛邪、顧護胃氣”的總體治療原則,中醫藥在改善胃癌患者生活質量方面有獨特的作用,如有效改善患者手術前后及放化療后的生活質量,能協調機體內陰陽平衡,糾正腫瘤紊亂的氣機,達到驅逐邪氣癌毒、抑制甚至殺死癌細胞的目的[9-10]。近年來,網絡藥理學成為胃癌治療的研究熱點,能以科學的分析全面地闡述中藥復方潛在的作用機制[11]。本研究基于網絡藥理學的方法,分析參芪白石湯有效成分治療胃癌的基因和通路機制,并通過分子對接技術進行驗證,以期為SBD治療GC提供理論依據。

槲皮素(quercetin,QE)是一種廣泛分布在水果、蔬菜及常見中草藥之中的天然黃酮類化合物,具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種作用[12-13],其作為一種天然的抗腫瘤藥物,已得到廣泛的認可[14]。槲皮素可抑制胃癌細胞增殖和侵襲,誘導其發生自噬、促進其凋亡,其機制可能與下調MMP-2基因表達有關[15-16]。動物試驗表明斛皮素的抗腫瘤機制通過對GC細胞G1期的阻斷作用,從而導致細胞分裂的延期[17]。這與本研究結果一致。3-表齊墩果酸是齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)的衍生物,OA是常見的天然產物,屬于五環三萜類化合物,以游離體及糖苷的形式存在于多種植物中,具有廣泛的生物活性,如保肝、降糖、降脂、抗腫瘤、抗高血壓、抗炎和抗 HIV 感染等[18]。本研究結果也顯示3-表齊墩果酸為抗GC的主要有效成分。基質金屬蛋白(matrix metalloproteinase MMP)家族成員中的 MMP-9和 MMP-2能有效地分解基底膜的主要成分IV型膠原蛋白,是一組鋅離子依賴性肽鏈內切酶[19-20],兩者的過度表達與人類某些惡性腫瘤的轉移密切相關[21-22],主要由腫瘤細胞和腫瘤周邊間質細胞產生,通過對細胞外基質的重塑促進腫瘤新生血管的生成,從而實現腫瘤的侵襲和轉移。研究發現,胃癌組織中MMP-2表達與淋巴結轉移和浸潤密切相關[23-24],這與本研究結果一致。前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)是前列腺生物合成的限速酶,對前列腺素的合成起著關鍵性的調控,已證實在許多病理生理過程中發揮著重要作用,是腫瘤、癌癥形成的促進劑[25],與本研究結果相符。IL6是由活化的T細胞和成纖維細胞產生的淋巴因子,在炎癥和 B細胞成熟中起重要作用,其功能與多種疾病的發生發展有關,如白血病、糖尿病等[26],IL6 基因的基因多態性與胃癌風險增加具有相關性[27],與本研究結果相符。

KEGG通路富集分析結果顯示,SBD治療GC的潛在作用機制除了直接作用于癌癥通路、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥中的轉錄失調以及金屬鉑耐藥,還包括脂質和動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、白細胞跨內皮細胞遷移、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、NF-kB信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞粘附分子等。流體剪切應力可以調節血管內皮細胞中相關基因的表達,影響著內皮細胞的形態、分化、遷移和增殖[28]。

綜上所述,SBD具有多成分、多靶點、多通路抗GC的特點,通過主要活性成分槲皮素、3-表齊墩果酸協同作用于GC相關通路從而發揮抗癌作用,為進一步的實驗研究提供了新的理論依據。但是中藥復方成分復雜,本文數據是通過一些數據庫獲得的,數據庫的信息還需要進一步完善且缺乏實驗支持,其機理有待進一步實驗驗證。