磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法測(cè)定VEGF的性能驗(yàn)證和臨床應(yīng)用效果評(píng)估

屠競(jìng)揚(yáng),周 琰,邵文琦△,潘柏申,王蓓麗,郭 瑋,2,3,4

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200032;2.上海市老年醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科,上海 201104;3.上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200940;4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建廈門 361015

近年來,肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì),這對(duì)于人們的身心健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生了巨大的影響。很多惡性腫瘤患者由于初期癥狀不明顯,而耽誤了最佳治療時(shí)機(jī)。因此,臨床需要更多的早期腫瘤標(biāo)志物對(duì)于各種惡性腫瘤患者進(jìn)行早期篩查。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種相對(duì)分子質(zhì)量為34～46×103的高度糖基化的二聚體可溶性堿性糖蛋白,具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、繁殖及增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性的能力,并且在許多病理生理過程中都有表達(dá)。在眾多血管生成因子當(dāng)中,VEGF是公認(rèn)的主要誘導(dǎo)血管生成的物質(zhì),是腫瘤血管生成的最有效的刺激因子,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系。VEGF雖作為一種新型腫瘤標(biāo)志物備受臨床關(guān)注,但目前國內(nèi)對(duì)惡性腫瘤患者血清VEGF水平的檢測(cè)尚處于初級(jí)階段,臨床普及率仍較低。使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)VEGF水平相較于目前臨床上常用的直接化學(xué)發(fā)光法,其能通過磁場(chǎng)分離出VEGF,使檢測(cè)的準(zhǔn)確率更高。本研究擬對(duì)VEGF測(cè)定試劑盒(磁微粒化學(xué)發(fā)光法)做性能分析和初步臨床應(yīng)用效果評(píng)估。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2023年8月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院(以下簡稱本院)確診為實(shí)體惡性腫瘤患者80例作為癌癥組,其中肺部、結(jié)直腸、胰腺、胃部腫瘤患者各20例,良性病變患者80例作為良性疾病組,其中肺部、結(jié)直腸、胰腺、胃部疾病患者各20例。癌癥組及良性疾病組入組排除并發(fā)風(fēng)濕、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心肌梗死及其他心臟疾病、血管炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、嚴(yán)重感染及嚴(yán)重內(nèi)科疾病的患者。另選取于本院體檢的表觀健康者20例作為健康對(duì)照組。健康對(duì)照組平均(40.90±12.14)歲,良性疾病組平均(56.25±13.44)歲,癌癥組平均(61.59±12.69)歲,3組年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(B2018-099),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2樣本采集與檢測(cè) 采用黃頭采血管(含促凝劑惰性分離膠)采集所有研究對(duì)象靜脈血5 mL,室溫靜置30 min,再置于4 ℃環(huán)境下以 1 007×g離心10 min,分離血清后置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。排除有明顯溶血、脂血、黃疸的樣本。檢測(cè)儀器為Aurora-1000i全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,購自山東康華生物醫(yī)療科技股份有限公司。VEGF測(cè)定試劑盒內(nèi)含試劑1、試劑2及配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。

1.3方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.3.4線性范圍驗(yàn)證 選用VEGF低濃度(L)樣本(40 pg/mL)和高濃度(H)樣本(3 200 pg/mL)各1份,1份取2 mL,并按5H、4H∶1L、3H∶2L、2H∶3L、1H∶4L、5L的比例混合成6個(gè)10 mL的混合樣本,編號(hào)分別為L6、L5、L4、L3、L2、L1,每個(gè)濃度樣本重復(fù)檢測(cè)2次。根據(jù)CNAS-GL037文件[2]規(guī)定,以實(shí)測(cè)值為Y,理論測(cè)定值為X,擬合線性回歸方程Y=a×X+b,線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99為符合要求。

1.3.6參考范圍驗(yàn)證 廠家聲明的VEGF參考范圍為<160 pg/mL。本實(shí)驗(yàn)室抽取20例表觀健康人群。根據(jù)WS/T 402-2012:《臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間的制定》[3]中小樣本驗(yàn)證的規(guī)定,所選取的20例樣本落在參考限外的測(cè)定值不超過兩個(gè),可認(rèn)為引用的參考區(qū)間適合本實(shí)驗(yàn)室。

春節(jié)回家，看到老家父母的房子已經(jīng)破舊到冬天漏風(fēng)，夏天漏雨的程度，老人住了幾十年，舍不得拆，想進(jìn)行維修，他果斷的說“拆了翻蓋吧，這事我定了”。

1.3.7干擾驗(yàn)證 選取低值樣本(VEGF水平為145 pg/mL)和高值樣本(VEGF水平為1 000 pg/mL),各取200 μL,分別加入10 μL干擾物質(zhì)(30 mg/mL甘油三酯、2 mg/mL血紅蛋白、350 μmol/L膽紅素)為實(shí)驗(yàn)組,空白樣本為對(duì)照組。同時(shí)測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組VEGF水平,依據(jù)產(chǎn)品說明書,加入干擾物質(zhì)后低值樣本陰陽性不變,高值樣本測(cè)值偏差在15%以內(nèi)為符合要求。

1.4臨床評(píng)估 分別檢測(cè)癌癥組、良性疾病組、健康對(duì)照組VEGF水平,統(tǒng)計(jì)分析3組間水平差異,評(píng)估臨床應(yīng)用效果。

2 結(jié) 果

2.1重復(fù)性驗(yàn)證 低值樣本重復(fù)檢測(cè)20次的結(jié)果為(133.381±5.849)pg/mL,CV為4.38%;高值樣本重復(fù)檢測(cè)20次的結(jié)果為(972.146±12.868)pg/mL,CV為1.32%,均滿足目標(biāo)CV(≤6.25%),重復(fù)性驗(yàn)證通過。見表1。

表1 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.2中間精密度驗(yàn)證 低值樣本測(cè)量10次的結(jié)果為(128.914±3.062)pg/mL,CV為2.38%;高值樣本測(cè)量10次的結(jié)果為(960.202±18.142)pg/mL,CV為1.92%。均滿足目標(biāo)CV(≤8.33%)?？膳袛嘀虚g精密度驗(yàn)證通過。見表2。

表2 中間精密度驗(yàn)證結(jié)果(pg/mL)

表3 正確度驗(yàn)證結(jié)果(pg/mL)

圖1 線性相關(guān)分析圖

表4 線性范圍驗(yàn)證(pg/mL)

2.5可報(bào)告范圍驗(yàn)證 稀釋比為1.0∶5.0樣本的偏差為-3.17%,是偏差絕對(duì)值<12.5%的樣本中稀釋倍數(shù)最大的,因此,VEGF測(cè)定試劑盒的最大可信稀釋比為1.0∶5.0,可報(bào)告范圍為40～16 000 pg/mL。見表5。

表5 不同稀釋比下可報(bào)告范圍驗(yàn)證

2.7干擾驗(yàn)證 干擾驗(yàn)證后,低值樣本的VEGF水平均仍呈陰性結(jié)果(<160 pg/mL),膽紅素、血紅蛋白、甘油三酯干擾物高值實(shí)驗(yàn)組的偏差分別為5.34%、2.59%、3.08%,小于產(chǎn)品說明書聲明的15.0%,對(duì)檢測(cè)結(jié)果未產(chǎn)生影響,干擾驗(yàn)證通過。見表6。

表6 在不同干擾物干擾下VEGF的測(cè)定結(jié)果(pg/mL)

圖2 VEGF診斷惡性腫瘤的ROC曲線

3 討 論

VEGF是一種具有血管通透性的同型二聚體糖蛋白[4],在調(diào)控血管形成和發(fā)育中起關(guān)鍵作用[5]。人類VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、胎盤生長因子(PLGF)及內(nèi)分泌腺衍生的VEGF (EG-VEGF)。臨床上通常所說的VEGF往往指VEGF-A,其在新生血管生成中發(fā)揮重要作用,可引起細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、血管通透性增加、血管舒張、炎癥細(xì)胞向損傷部位募集等[6]。而惡性腫瘤不斷進(jìn)展,生長到超出預(yù)先存在的脈管系統(tǒng)范圍的器官組織,就會(huì)誘導(dǎo)新生血管形成以促進(jìn)其進(jìn)一步發(fā)生、發(fā)展。因此,血管異常被認(rèn)為是惡性腫瘤的標(biāo)志之一[7]。已有部分研究顯示血清VEGF可作為惡性腫瘤的診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)[8-9],乳腺癌[10]、宮頸癌[11]、原發(fā)性肝癌[12]等惡性腫瘤患者均有VEGF水平升高的現(xiàn)象。

目前對(duì)于VEGF的檢測(cè)一般采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、熒光層析法、化學(xué)發(fā)光法等,但這些方法都存在一定不足,如檢測(cè)時(shí)間長、靈敏度低等問題。 本研究采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)VEGF水平,將雙抗體夾心法免疫測(cè)定原理與超順磁性納米微球標(biāo)記技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析相結(jié)合,定量檢測(cè)人血清樣本中的VEGF水平。結(jié)果顯示,磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清VEGF的重復(fù)性、中間精密度、正確度、線性范圍、可報(bào)告范圍、參考區(qū)間、干擾物質(zhì)影響下準(zhǔn)確度均通過了驗(yàn)證。

已有部分研究證明,血清VEGF診斷肺鱗癌[13]、結(jié)直腸癌[14]的靈敏度較高。本研究結(jié)果顯示,相比于良性病變患者及健康人群,惡性腫瘤患者血清VEGF水平顯著升高,VEGF診斷惡性腫瘤的靈敏度為0.69,特異度為0.95,AUC為0.90,提示血清VEGF對(duì)于惡性腫瘤有著較高的篩查價(jià)值。CHIN等[15]在2003年就提出血清VEGF水平升高是結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,并且TKACZ等[16]也提出在惡性腫瘤早期,VEGF水平在患者血清中升高。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn),癌癥組患者VEGF水平顯著高于健康對(duì)照組和良性疾病組(P<0.05),這初步提示可以將血清VEGF作為診斷惡性腫瘤的輔助指標(biāo),結(jié)合患者影像學(xué)及其他腫瘤標(biāo)志物,將有助于進(jìn)一步提高診斷惡性腫瘤的特異度和靈敏度。

本研究也存在一定局限性。(1)入組樣本數(shù)較少,尚需進(jìn)一步入組更多臨床樣本,探討VEGF在惡性腫瘤鑒別診斷中的價(jià)值;(2)未收集患者隨訪數(shù)據(jù),在后續(xù)研究中筆者將補(bǔ)充癌癥組臨床資料,評(píng)價(jià)VEGF在預(yù)測(cè)疾病預(yù)后中的價(jià)值。

綜上所述,本研究所采用的磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)VEGF水平不僅成本低、操作簡單,且靈敏度高、穩(wěn)定性好,適合臨床常規(guī)工作,對(duì)于協(xié)助惡性腫瘤的診斷有一定價(jià)值。