CRISPR-Cas系統在病原微生物分子診斷中的研究進展

龍文巧,許永杰 綜述,張 華,△ 審校

1.遵義醫科大學,貴州遵義 563000;2.貴州省人民醫院檢驗科,貴州貴陽 550000

常見的病原微生物如病毒、細菌、真菌等引起的感染性疾病仍是危害人類健康的主要原因之一[1]。因此,快速、靈敏、準確、簡便的檢測方法對感染性疾病的診斷、療效評估及預防控制具有重要意義。基于成簇規律間隔短回文重復序列(CRISPR)-CRISPR相關蛋白(Cas)系統的檢測技術因具有高靈敏度、高特異度、快速、便攜等優點而廣泛應用于病原微生物的檢測中[2]。

1987年ISHINO等[3]在大腸桿菌中首次發現了CRISPR基因組,2005年HAFT 等[4]鑒定了Cas的功能,隨后POURCEL等[5]證明了CRISPR-Cas系統是細菌抵抗噬菌體入侵的適應性免疫系統。目前CRISPR-Cas系統除了應用于基因編輯技術外,還廣泛應用于病原微生物核酸檢測技術[6]。基于CRISPR-Cas系統的核酸檢測技術表現出高靈敏度、高特異度、快速等優點,可實現現場檢測,在感染性疾病診斷方面具有巨大應用前景。同時,基于CRISPR-Cas系統的核酸檢測技術的進一步應用也存在許多挑戰,這些挑戰包括開發快速高效的核酸提取方式、簡便的檢測程序及高通量檢測技術等[7]。隨著基于CRISPR-Cas系統的核酸檢測技術的發展,非核酸分析物的檢測也成為當前研究熱點[8]。本文概述了CRISPR-Cas系統的作用機制和不同效應蛋白的核酸酶活性,綜述了CRISPR-Cas系統在病原微生物核酸檢測中的應用研究進展和挑戰,并進一步介紹了CRISPR-Cas系統在抗原、血清學抗體、病原體等非核酸分析物檢測方面的最新研究熱點。

1 CRISPR-Cas系統概述

CRISPR-Cas系統由存儲記憶的CRISPR和Cas基因組成,這兩部分共同作用形成CRISPR-Cas效應復合體,參與核酸識別、切割過程[4]。CRISPR-Cas系統通過將外來噬菌體DNA儲存到細菌宿主染色體中形成記憶,進而阻止噬菌體再次感染。CRISPR-Cas系統遵循免疫的3個主要階段[9]:(1)適應。對外來核苷酸序列識別、處理后將間隔序列整合到CRISPR基因座中,由此存儲首次感染的記憶。(2)CRISPR RNA(crRNA)成熟。間隔序列翻譯成crRNA和反式激活RNA通過堿基配對形成向導RNA(sgRNA),用于募集Cas。(3)干擾。Cas通過結合sgRNA形成效應復合物,在原間隔相鄰基序(PAM)的協助下對靶標識別并切割,完成對外來核苷酸序列的特異性清除。

不同的Cas具有不同的核酸內切酶活性,當前研究主要集中于Cas9、Cas12、Cas13、Cas14,Cas9結合sgRNA后特異性識別和切割靶標,通過對切割產物的分析實現靶標的檢測[10]。而Cas12、Cas13、Cas14識別并結合crRNA及靶標后形成效應復合體,該復合體可非特異性切割任意單鏈DNA或單鏈RNA,該過程被稱為反式切割。此類蛋白反式切割大量帶有標記的單鏈DNA或單鏈RNA報告探針,進而輸出檢測信號?；贑RISPR-Cas系統的病原微生物檢測技術可分為兩類[11]:第1類是通過提取基因組,聯合CRISPR-Cas系統建立核酸檢測方法;第2類是通過適配體或抗體識別非核酸分析物,直接或間接與CRISPR-Cas系統聯合,實現非核酸分析物的檢測。

2 基于CRISPR-Cas系統的病原微生物核酸檢測

基于CRISPR-Cas系統的核酸檢測技術常通過對樣品中的微量核酸進行特異性識別和信號放大完成相關檢測。目前,基于CRISPR-Cas9/Cas13/Cas12/Cas14系統的檢測技術具有高特異度、高靈敏度、快速等特點,已被廣泛應用于核酸檢測中?；贑RISPR-Cas9系統的檢測技術依賴于該系統識別及切割雙鏈DNA(dsDNA)的能力,用于病原微生物的核酸檢測。PARDEE等[12]將基于CRISPR-Cas9及含有激發序列的toehold傳感器聯合依賴核酸序列的擴增(NASBA)方法開發一種顯色紙片檢測技術,建立了可視化檢測寨卡病毒檢測技術,該技術通過比色法輸出檢測信號,檢測靈敏度可達3 fmol/L,能鑒別美洲和非洲寨卡病毒株,且不需要昂貴的設備。但NASBA需要3種酶使得反應成本較高,反應成分較復雜,檢測時間較長。選擇合適的核酸擴增方法對提高檢測平臺的綜合檢測性能至關重要。此外,去核酸酶活性的Cas9(dCas9)保留了dsDNA的結合能力,對目標核酸序列無切割活性,也可用于核酸檢測。HAIJIAN等[13]開發了CRISPR芯片(CRISPR-Chip)技術,該技術將dCas固定于石墨烯電子晶體管,在sgRNA輔助下,加入目標dsDNA后在晶體管上形成dCas-sgRNA-dsDNA復合物,該復合物會改變晶體管電導率,可根據電導率變化得出檢測結果。CRISPR-Chip技術無須對靶標進行檢測前擴增,可直接檢測到1.7 fmol/L的目標dsDNA,耗時15 min。Cas9和dCas9常用于核酸檢測,但此類技術的信號放大及輸出過程較復雜。Cas12a 、Cas13a 、Cas14等具有反式切割活性的發現為開發更簡便、快速、精準的基于CRISPR-Cas系統的檢測平臺提供更多可能。

基于CRISPR-Cas12/Cas13/Cas14系統的檢測技術通常利用Cas的反式切割活性直接切割帶標記的檢測探針,從而產生各種信號(如熒光、比色、電化學等),直接、快速地獲得較高的檢測靈敏度。KELLNER等[2]將重組酶聚合擴增技術(RPA)聯合CRISPR-Cas13a系統,建立了SHERLOCK技術。該技術通過切割淬滅的熒光報告探針放大和輸出檢測信號,在寨卡病毒檢測中可達到單堿基分辨率,并極大地提高了檢測的靈敏度。此外,Cas12a同樣具有強大的反式切割活性,CHEN等[14]將CRISPR-Cas12a系統聯合RPA開發了DETECTR技術。SHERLOCK及DETECTR技術具有高靈敏度、高特異度和快速等優點,并為開發更多新的基于CRISPR-Cas系統的檢測技術提供基礎。但此類技術有兩步反應,增加了檢測過程中被污染的風險,進一步的研究可通過將核酸擴增過程與CRISPR檢測過程整合于單一反應體系中進而降低檢測過程被污染的風險?；贑RISPR-Cas系統的檢測技術在實際應用中面臨著復雜的核酸提取方式和檢測程序,以及難以實現對單一crRNA及Cas進行多重靶標檢測等挑戰,這些挑戰限制了新技術在實際樣本檢測中的應用。

3 病原微生物核酸檢測的挑戰

基于CRISPR-Cas系統的病原微生物核酸檢測在臨床應用上面臨需開發簡易的核酸提取方法,簡化檢測程序,建立多重檢測平臺等諸多挑戰[7],筆者進一步討論了目前的一些解決方案。

3.1核酸提取的簡化 簡化核酸提取過程仍然是快速核酸檢測技術發展的主要瓶頸,因此需要開發快速高效的核酸提取方法促進基于CRISPR-Cas系統的檢測技術的應用。MYHRVOLD等[15]建立了樣本加熱消除核酸酶非提取(HUDSON)技術,將HUDSON與SHERLOCK技術聯合,在提取和純化DNA或RNA的情況下裂解病毒,可以直接從臨床樣本中檢測病毒核酸,極大地簡化了操作步驟,降低了氣溶膠污染的風險。然而,HUDSON技術缺乏純化和濃縮核酸的步驟,可能會降低檢測復雜樣本中目標核酸的能力。納米材料和技術可以通過簡便的工藝從復雜樣品中提取目標核酸。納米級的隔離膜具有較大的比表面積,RODRIGUEZ等[16]開發了基于紙張核酸擴增的流控芯片技術,該技術使用的隔離膜通過靜電作用和氫鍵結合力將高鹽溶液中的目標核酸快速、高效地分離,使吸附在膜上的核酸保持穩定的結合,通過環介導等溫擴增(LAMP)技術在原位擴增,實現目標序列的富集、純化和擴增,完成從樣品到結果的集成檢測。目前,芯片上的等溫放大步驟需要外部熱源,該技術使用加熱模塊來輔助等溫擴增,因此,若在基于紙張的微流控檢測平臺中整合一個集成的加熱系統將大大加強其便攜性。

3.2檢測過程的簡化 大多數基于CRISPR-Cas系統的檢測技術仍然使用標準的兩步檢測法,此類方法增加了檢測的時間和檢測過程中交叉污染的風險,這促使研究者開發單管檢測策略。常規兩步檢測法首先利用核酸擴增技術提高靶標的濃度,再聯合CRISPR-Cas系統產生放大的檢測信號[2]。但核酸擴增技術擴增靶標的同時,還增加了非特異性擴增的風險,故研究者們開發了無須靶標擴增的超靈敏的檢測方法。

3.2.1單管檢測策略 基于CRISPR-Cas系統的單管檢測技術將核酸擴增和CRISPR-Cas系統反應整合于一個緩沖體系,用于快速現場檢測。單管檢測是在反應管底部添加核酸擴增試劑,在反應管蓋上也添加Cas12a和crRNA試劑,反應管底部的核酸擴增完成后,將預先加在管蓋上的Cas12a和crRNA試劑通過離心移至管底,使Cas12a和crRNA試劑與擴增子混合,實現在1管內完成擴增和檢測,避免了氣溶膠污染[17]。但此技術先進行靶標擴增再將擴增產物與CRISPR-Cas系統反應,檢測時間較長。因此,研究者們將靶標的擴增與CRISPR-Cas系統整合于一個緩沖系統中同時進行反應,縮短了檢測時間。根據核酸擴增步驟和CRISPR-Cas系統反應的溫度偏好,JOUNG等[18]將LAMP介導的核酸擴增反應(55～65 ℃)與耐高溫的Cas12b(31～59 ℃)集中于一管中同時完成核酸擴增與信號檢測,建立了單管檢測技術。該技術不但降低了交叉污染的風險,還明顯縮短了檢測時間。同樣,該技術的核酸擴增過程也需要加熱,未來的研究可通過開發集成加熱系統,進一步簡化工作流程,進而在不同環境下均可進行相關核酸檢測。

3.2.2無擴增檢測策略 無核酸擴增步驟的檢測策略具有快速、避免非特異性擴增、不易產生交叉污染等優勢,但可能會造成檢測靈敏度下降。為解決靈敏度下降這一問題,研究者們通常使用超靈敏信號報告系統、信號級聯放大技術,以及微小體積等方式提高靈敏度[13]。首先,電化學傳感器、金屬納米材料、高性能的表面增強拉曼散射技術等可放大來自CRISPR-Cas系統的微弱信號,超靈敏地檢測低濃度靶標。其次,因實驗中CRISPR-Cas系統反應速率與Cas-crRNA復合物的數量呈正比,基于CRISPR-Cas系統的檢測用多個 Cas-crRNA復合物直接靶向目標序列的不同位點,通過加快信號積累速率,在更短的時間內達到檢測信號閾值[19]。此外,根據Cas的反式切割活性與底物濃度呈正比的原理,空間限制檢測體系可濃縮底物進而提高檢測靈敏度[20]。不同無擴增策略的組合可提高檢測的靈敏度。基于CRISPR-Cas系統的無擴增數字RNA檢測技術通過采用多個Cas13a-crRNA復合物靶向多個位點在空間限制體系(反應體積減小到nL水平)中檢測新型冠狀病毒(SARS-CoV-2),檢測限為5 fmol/L,耗時5 min[21]。因此,合理整合上述策略可以實現無擴增、快速、靈敏的靶標檢測。但由于缺乏靶標擴增步驟,用來增加靈敏度的策略可能會增加檢測方法的復雜性和費用,在選擇或設計檢測方法時,必須綜合考慮這些策略的優缺點。

3.3多重檢測 多重檢測可以提高診斷效能,實現大規模樣本的高通量檢測。GOOTENBERG等[22]利用PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b和Cas12a分別切割富含特定核苷酸序列的報告探針,實現了四重檢測。但在該檢測方法中,Cas的反式切割可能會產生信號重疊以降低檢測的特異度,且該技術涉及較多的蛋白質種類,導致檢測成本較高。因此,一種通過DNA阻斷劑調控Cas反式切割活性的檢測方法以單一蛋白實現了多重靶標的檢測一定程度上降低了檢測成本。HAN等[23]開發了一種基于Cas12a-DNA阻斷劑的多重檢測(CASTI)技術。CASTI可以通過聯合RPA擴增靶標,以一種Cas實現人乳頭瘤病毒(HPV)16和HPV18基因的檢測,檢測限為1 amol/L。該多重檢測平臺有助于在設備有限的條件下進行病原微生物的檢測。然而,與檢測人工合成的DNA靶標相比,該技術在細胞系和臨床樣本中檢測目標DNA的效率較低,因此,需要進一步優化實驗條件以避免樣本中其他DNA或RNA的干擾。此外,ACKERMAN等[24]將核酸多重評估的組合排列反應(CARMEN)聯合CRISPR-Cas13a系統,開發一種多通道檢測方法(CARMEN-Casl3)。CARMEN-Casl3已可同時檢測169種人類病毒,還能區分多種亞型的流感病毒,檢測時間為5 min。CARMEN-Cas13的靈敏度和特異度可與SHERLOCK技術匹配,這對病原微生物高通量檢測及流行病學研究至關重要。該技術可檢測來自不同人群的數千份樣本,需要專業人員對檢測結果進行仔細分析解釋。該技術若能與移動電話應用程序連接將直接讀出檢測結果,會有更大的應用潛力。

4 基于CRISPR-Cas系統相關的病原微生物非核酸分析物檢測

病原微生物及其抗原和血清學抗體等非核酸分析物往往在發病早期和治療開始后以低濃度出現。靈敏和可定量的基于CRISPR-Cas系統的檢測技術有助于發現早期病變和準確評估疾病療效[25]。近年來,基于CRISPR-Cas系統的檢測技術已用于檢測多種類型靶標,包括病原體、抗原、血清學抗體等。

4.1基于CRISPR-Cas系統相關的病原微生物直接檢測 基于CRISPR-Cas系統的病原微生物直接檢測常通過抗體或適配體識別致病菌,再與CRISPR-Cas系統聯合放大檢測信號,實現免培養、免提取的病原微生物直接檢測?；诳贵w的檢測方法利用抗體對靶細菌識別,通過免疫夾心法聯合CRISPR-Cas12a系統輸出檢測結果。DUAN等[26]開發了一種基于CRISPR-Cas12a系統引導、無DNA提取和擴增、可快速直接檢測病原體的生物傳感器(CATCHER)。CATCHER通過免疫夾心結構(標記鼠傷寒抗體的磁珠、靶細菌、標記鼠傷寒抗體和DNA核酸內切酶Ⅰ的膠體金),經磁分離后巧妙地利用DNA核酸內切酶Ⅰ將溶液中單鏈DNA激活探針降解為短寡核苷酸,改變CRISPR-Cas12a系統生物活性,進而輸出檢測結果,檢測限為7.9×101CFU/mL。該方法為非核酸分析物的檢測提供了一個通用平臺。相比價格較貴的抗體識別方法,適配體識別方法成本較低且步驟更簡便?；谶m配體的方法,研究者通常識別適配體靶標后釋放一個DNA或RNA激活探針用于激活CRISPR-Cas系統,進而完成信號的放大及輸出。SHEN等[27]開發了將核酸變構探針(AP)與CRISPR-Cas13a系統聯合的APC-Cas檢測方法。該方法通過AP識別靶細菌后暴露引物結合位點,引物在DNA聚合酶和T7 啟動子作用下進行DNA序列的延伸和轉錄,產生大量單鏈RNA激活探針及CRISPR-Cas13系統,通過熒光信號輸出結果。該技術可快速、直接、定量檢測各種樣本中腸炎單胞菌數(1～105CFU/mL)。以上病原微生物直接檢測技術省去了檢測前核酸提取和擴增步驟,明顯縮短了檢測時間。

4.2基于CRISPR-Cas系統相關的病原微生物抗原檢測 病原微生物抗原與致病力密切相關,抗原檢測也是傳染性疾病診斷的主要方式之一?；贑RISPR-Cas系統的檢測技術檢測抗原時大多需利用適配體識別抗原后將抗原轉化為核酸信號,聯合CRISPR-Cas系統放大檢測信號,實現抗原快速檢測。生物毒素是細菌產生的一類重要抗原,會引起人類急性中毒、致癌或致畸等,生物毒素的檢測有助于評估細菌感染嚴重程度和預防毒素引發的休克。ABNOUS等[28]利用核酸適配體聯合CRISPR-Cas12a系統識別黃曲霉毒素M1(AFM1),開發了簡便、高效的抗原檢測技術。在添加了AFM1的牛奶樣品中,該技術在 0.5～50.0 ng/L呈現出較寬的線性關系。該技術利用比色法,通過顏色的變化輸出檢測結果,不需要昂貴設備,信號輸出方式簡便,便于現場檢測,但比色這一信號輸出方式靈敏度相對較低。研究者可探索使用包括金屬有機框架在內的新型納米材料來提高傳感器的靈敏度。此外,病毒抗原往往決定了病毒的宿主、組織嗜性及其致病的能力,也成為檢測的重要靶標。通過適配體聯合CRISPR-Cas12a系統,研究者建立了SARS-CoV-2抗原的電化學檢測平臺[29],實現核衣殼蛋白的檢測。與常規抗原檢測法相比,基于CRISPR-Cas系統的抗原檢測技術提高了抗原檢測的特異度和靈敏度,并可對抗原進行定量檢測。

4.3基于CRISPR-Cas系統相關的病原微生物抗體檢測 抗體檢測在疾病診斷、療效評估和流行病學調查中具有重要意義。BARBER等[30]建立了CRISPR-Cas9系統介導的自組裝固定肽(PICASSO)技術。PICASSO技術通過將能與靶分子特異性結合的重組肽段與dCas9融合形成復合物,利用sgRNA引導該復合物與微陣列表面上特定位置的DNA進行自組裝,構建DNA-蛋白質微陣列,用于檢測不同抗體。PICASSO技術能快速識別樣本中的上千種抗體,實現了病原微生物血清學抗體快速高通量檢測。PICASSO技術已被用于檢測新型冠狀病毒感染(COVID-19)恢復期患者血清SARS-CoV-2的抗體。但該技術難以避免非特異性背景信號,未來的研究可通過改變微陣列表面寡核苷酸的間距密度及dCas9與其融合蛋白之間的連接長度等進一步優化實驗條件,提高檢測特異度。

5 總結與展望

基于CRISPR-Cas系統的檢測技術在病原微生物核酸和非核酸靶標的檢測中迅速發展,實現對超低濃度樣品的精確、靈敏檢測。本文歸納了基于CRISPR-Cas系統的檢測技術的構建和應用,討論了該技術目前存在的挑戰及可能的解決辦法,進一步闡述了基于CRISPR-Cas系統的檢測技術在病原微生物非核酸分析物檢測方面的最新研究熱點。核酸靶標的檢測通過開發簡易的核酸提取方法,簡化檢測程序,建立多重檢測平臺等方式提高了檢測性能。非核酸靶標的檢測則需通過適配體、抗體及其他方式將靶標轉換成核酸信號進一步完成檢測,在病原微生物檢測領域展現出了更廣闊的應用前景。

盡管CRISPR-Cas系統在病原微生物檢測中具有各種優勢,但仍有一些挑戰需要克服。(1) 靶基因片段選擇的局限性。CRISPR-Cas系統在Cas錨定目標序列時依賴于PAM,在選擇檢測的靶基因片段時存在一定的局限性。(2)crRNA 和單鏈DNA、單鏈RNA報告探針在添加RNA酶抑制劑的臨床復雜樣本中仍存在降解風險。(3)Cas存在一定的背景活性,不同批次的背景活性不同,導致樣品檢測結果不同。

基于CRISPR-Cas系統的檢測技術在臨床應用上具有巨大的潛力。基于CRISPR-Cas系統的檢測技術與人工智能相結合,可以促進感染性疾病的早期診斷,直接向衛生專家甚至普通人群發出警報。此外,基于CRISPR-Cas系統技術的檢測結果可以通過移動電話應用程序連接到云數據進行分析和儲存,可用于構建醫療大數據分析平臺,為臨床診療及科學研究提供有力證據。CRISPR-Cas 系統現在能夠檢測的不僅是基因組材料,還有望擴展到更多領域。除病原微生物及其抗原和血清學抗體等非基因組目標外,CRISPR-Cas 系統在癌癥生物標志物、人體樣本罕見突變、食品水樣污染檢測、植物病原微生物檢測等領域的新應用仍有待進一步探究。