西伯利亞白刺L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因克隆與序列分析

高衛東，杜雨晴，張林鳳，蔣路園，劉 園，邱德有，陳貴林，楊艷芳*

1.中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091

2.內蒙古大學牧草與特色作物生物學教育部重點實驗室，呼和浩特 內蒙古 010020

3.國家林業和草原局國家公園（自然保護地）發展中心，北京 100013

4.北京市海淀區圓明園管理處，北京 100193

西伯利亞白刺NitrariasibiricaPall.為蒺藜科白刺屬落葉灌木，是我國分布最為廣泛的白刺種，因其具有良好的耐鹽堿、耐干旱等特性，多被種植在鹽堿或生態脆弱地區[1]。西伯利亞白刺除擁有極強的抗逆性外，在其葉、果、枝中還含有豐富的對人體有益的營養物質和微量元素等[2-3]，是優質的醫療保健、食品工業原材料。但現階段針對白刺的研究多集中在其抗性方面，而對其營養價值、活性成分的研究較少。

維生素C 也稱為抗壞血酸（aseorbic acid，AsA），是一類在生物體內合成的己糖內酯化合物，在植物體內與生長發育、次生代謝產物及激素的合成密切相關[4]，如在植物細胞分裂、光合作用、乙烯和赤霉素的合成以及抗氧化和清除自由基等植物抗氧化脅迫中起著非常重要作用[5-8]。研究表明，維生素C 能夠促進人體對鋅和鐵的吸收[9]，還對心血管病、癌癥、糖尿病、白內障及衰老等病癥具有良好的預防功效[10-11]。維生素C 為人體所必需，卻在人體內無法合成、儲存，必須從飲食中獲取。因此，闡明植物中維生素C 的合成途徑，提高植物體內維生素C 含量，對于人體健康有著重要意義。

研究認為植物維生素C 合成途徑主要有L-半乳糖途徑、D-半乳糖醛酸途徑、L-古洛糖途徑以及葡萄糖醛酸途徑[12]。L-半乳糖途徑被認為是高等植物中維生素C 生物合成的主要途徑[13-14]。目前，植物中L-半乳糖合成途徑所涉及的反應酶和相應的基因已全部被鑒定出[15-16]。其中，L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase，GPP）在該途徑中起著重要作用，其能夠催化L-半乳糖-1-磷酸生成L-半乳糖，即維生素C 合成所必需的前體物質。Conklin 等[17]研究發現擬南芥Arabidopsis thalianaGPP缺失突變體中維生素C 的含量僅為野生型的50%。還有研究證實在蘋果MalusdomesticaBorkh 葉片和番茄SolanumlycopersiconL.果實中，GPP基因是維生素C 合成積累的關鍵基因[18-19]。因此，本研究以西伯利亞白刺為研究對象，基于其三代測序數據鑒定出NsGPP基因，并根據序列信息設計特異引物，從西伯利亞白刺葉片中克隆得到NsGPP1和NsGPP2基因，利用生物信息學對其進行分析，并結合轉錄組數據分析其在鹽脅迫中的表達模式，同時利用qRT-PCR 分析其在不同組織中的表達水平，為進一步揭示白刺中維生素C 生物合成的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 西伯利亞白刺RNA 的提取及cDNA 的合成

西伯利亞白刺果實于2022 年8 月采摘自內蒙古自治區阿拉善盟吉蘭泰鎮，采摘后立即用液氮速凍，帶回實驗室后存放于?80 ℃冰箱保存。西伯利亞白刺莖、葉組織于2023 年5 月取自中國林業科學研究院溫室種植的組培苗，取樣后，液氮速凍，?80 ℃冰箱保存。使用RNA Easy Fast Plant Tissue Kit 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取樣品總RNA，利用FastKing RT Kit（With gDNase）反轉錄試劑盒（北京天根生化科技有限公司）合成cDNA，于?20 ℃冰箱保存。

1.2 西伯利亞白刺GPP 基因鑒定

通過本地化Blast 程序，以擬南芥VTC4 蛋白（登錄號：NP_186936）作為query，與西伯利亞白刺轉錄組數據（登錄號：SRR18000662）進行比對，并利用CD-HIT 軟件默認參數進行去冗余，之后將去冗余得到的蛋白序列利用CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行結構域預測，篩選結構域完整的蛋白序列進行后續分析。

1.3 NsGPP 基因的克隆

本研究從西伯利亞白刺轉錄組數據庫中共鑒定出兩個NsGPP基因（SRR18000662.115405.1 和SRR18000662.126374.1）。依據2 個基因的序列信息，利用 Primer Primer 5 軟件進行引物設計（ NsGPP1-F ： 5’-TCATTGCTTTCCTTCAC-3’ ；NsGPP1-R ： 5’-AACACCTGTCCTTTTCC-3’ ；NsGPP2-F ： 5’-TACCATCAGGTTCCATT-3’ ；NsGPP2-R：5’-CGATAACACCTGTCCTTTT-3’）。

PCR 反應體系為：2 μL cDNA，0.5 μL 引物，10μL 2×M5 HiPer Plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）（北京聚合美生物科技有限公司），7 μL Nuclease-free ddH2O。PCR 反應程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環；最后72 ℃延伸5 min。通過1.2%瓊脂糖凝膠對PCR 產物進行電泳分離，利用M5 HiPure Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）回收目的片段。將膠回收產物與pTOPO-TA 載體連接后轉化大腸桿菌菌株DH5α，挑取單克隆進行菌液PCR 鑒定，對條帶正確的陽性克隆菌液進行測序（中美泰和生物技術（北京）有限公司）。

基于菌液測序的結果，使用NCBI 網頁工具ORF Finder 尋找測序序列完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF），隨后利用DNAMAN 6.0 對目的基因序列與轉錄組數據對應序列進行比對。

1.4 NsGPP 蛋白理化性質分析

利用ExPASy 在線網站（https://www.expasy.org/）中的ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）對NsGPP 蛋白的氨基酸數量、相對分子質量、等電點以及疏水性進行分析。

1.5 NsGPP 蛋白序列比對及系統進化發育分析

利用DNAMAN 6.0 對NsGPP 蛋白序列進行比對。從NCBI 數據庫下載擬南芥等植物GPP 家族蛋白序列。利用MEGA X 軟件對NsGPP基因編碼的蛋白和擬南芥等植物GPP 蛋白進行比對，并采用鄰接法（neighbor- joining，NJ）法構建進化樹，參數為默認值，重復1 000 次。

1.6 NsGPP 蛋白保守基序分析

利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在線工具對NsGPP 蛋白以及擬南芥等植物GPP 蛋白進行保守基序（Motif）分析[20]，最大motif 檢索數為10，其余為默認參數。

1.7 西伯利亞白刺NsGPP 蛋白結構分析

利用 phyre2 在線網站（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）對NsGPP 蛋白三級結構進行建模。

1.8 NsGPP 基因鹽脅迫下表達分析

從NCBI 基因表達數據庫中下載西伯利亞白刺鹽脅迫的GEO 數據（SRP127697），利用Blast 比對尋找NsGPP同源序列，獲得其FPKM 數據，分析2 個NsGPP基因的表達水平。

1.9 NsGPP 基因組織表達分析

為檢測NsGPP基因在不同組織中的表達水平，以西伯利亞白刺果實、莖、葉的cDNA 為模板，利用SuperRe-al PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）在 Roche LightCycler?480Ⅱ熒光定量PCR 儀上進行qRTPCR 反應，每個樣品設置3 個生物學重復以及3 次技術重復。反應程序：95 ℃酶激活15 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，循環次數40，以Actin[21]為內參基因，利用2–ΔΔCt法[22]計算基因的相對表達量。相關引物見表1，利用SPSS 軟件進行顯著性分析。

表1 qRT-PCR 引物Table 1 Primers for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 西伯利亞白刺NsGPP 基因克隆及其編碼蛋白理化性質分析

利用生物信息學的方法，從西伯利亞白刺轉錄組數據中鑒定出2 條GPP基因序列，依據這2 條序列信息，設計特異引物進行RT-PCR 擴增（圖1），經膠回收，克隆以及測序，得到2 個基因完整的ORF序列。2 個基因ORF 全長分別為897 bp 和1 113 bp，與轉錄組預測序列長度一致且相似性達到99%，進而分別將其命名為NsGPP1和NsGPP2。NsGPP1和NsGPP2編碼的蛋白分別由298 和370 個氨基酸殘基組成，其相對分子質量為32 220 和40 451，等電點分別為5.39 和7.10，GRAVY 值為–0.015與–0.118，表明2 個NsGPP 蛋白均為親水蛋白。

圖1 NsGPP1/2 基因PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR amplification of NsGPP1/2

2.2 序列比對分析

將2 個NsGPP基因的ORF 核苷酸序列進行比對，發現NsGPP1和NsGPP2基因同源性較高，兩者除了在5’端存在明顯差異（NsGPP2比NsGPP1基因長216 bp）之外，在后半部分同源性較高的序列中，還存在6 個差異堿基（圖2-A）。蛋白序列比對結果如圖2-B 所示，2 個NsGPP 蛋白序列的相似性為80%，NsGPP2 蛋白N 端明顯長于NsGPP1蛋白；2 個蛋白存在2 個氨基酸差異，NsGPP1 蛋白序列的第145 位與第276 位氨基酸分別為甘氨酸與丙氨酸，而NsGPP2 蛋白序列中與其對應位置上的氨基酸則分別為天冬氨酸與谷氨酸。利用擬南芥、油菜BrassicanapusL.以及蘋果、棗樹Zizyphus jujuba(L.) Lam.等不同物種的GPP 蛋白序列（下載自Genbank 數據庫）與2 個NsGPP 蛋白序列進行多序列比對。由圖3 可以看出，NsGPP 與其他植物GPP 蛋白具有較高的同源性，且均含有完整的FBPase/IMPase/glpX- like(FIG)保守結構域，可見其屬于FIG 家族。

圖2 西伯利亞白刺GPP 基因ORF 核苷酸序列 (A) 和蛋白序列比對 (B)Fig.2 Nucleotide sequences alignment (A) and protein sequences alignment (B) of NsGPPs

圖3 西伯利亞白刺與其他植物GPP 蛋白多序列比對Fig.3 Sequence alignment of GPP proteins of N.sibirica and other plants

2.3 系統進化發育分析

利用NsGPP 蛋白序列和其他植物的GPP 蛋白序列，構建系統進化樹。結果如圖4 所示，NsGPP 蛋白與陸地棉GossypiumhirsutumL.、長蒴黃麻Corchorus olitoriusL.、月季RosachinensisJacq.和茄Solanum melongenaL.、蘿卜RaphanussativusL.等灌木或半木質化草本植物的GPP 蛋白聚在一起，而與主要由木本植物棗Ziziphusjujuba(L.) Lam.、柑橘CitrusunshiuMarc.、辣木MoringaoleiferaLam.組成的II 亞家族和由蘋果Malusdomestica(Suckow) Borkh.、桃Prunuspersica(L.) Batsch 組成的III 亞家族關系較遠。因此，從進化上來講，西伯利亞白刺可能與灌木或半木質化草本植物的親緣關系更近。

圖4 西伯利亞白刺與其他植物GPP 蛋白系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of GPP proteins of N.sibirica and other plants

2.4 NsGPP 蛋白保守基序分析

利用MEME 在線網站對2 個NsGPP 蛋白以及擬南芥、油菜和辣木的GPP 蛋白進行motif 分析（圖5），結果發現NsGPP1 和NsGPP2 與其他植物的GPP 蛋白較為保守，均含有motif 1、2、5。同時，NsGPP 與其他植物的GPP 蛋白還存在著差異，如只有NsGPP1 和NsGPP2 中含有motif8，且兩者均不含有motif 6 和9；motif 6 存在于擬南芥和辣木的GPP蛋白中，motif 9 存在于擬南芥、油菜和辣木GPP 蛋白中，而油菜中的GPP 蛋白缺少motif 3、4、6、7 和8。由此可見，GPP 蛋白在不同物種存在較高的保守性，但也存在基序數目以及類型上的差異。

圖5 白刺及其他植物GPP 蛋白motif 分析Fig.5 Motif analysis of GPP proteins of N.sibirica and other plants

2.5 NsGPP 蛋白三級結構分析

利用 phyre2 在線軟件（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）對NsGPP基因編碼的蛋白進行三級結構特征分析。從圖6 中可以看出，NsGPP 蛋白與模型結構非常相似，但也存在微小差異，如NsGPP2 中藍色螺旋長度明顯低于NsGPP1 和模型蛋白，NsGPP1 蛋白比NsGPP2 多了2 個紅色β-折疊。

圖6 NsGPP 蛋白的三級結構分析Fig.6 3D structures of NsGPP proteins

2.6 NsGPP 基因的表達模式分析

通過轉錄組數據，對2 個NsGPP基因在不同濃度NaCl 處理下的西伯利亞白刺葉片中的表達水平進行分析。結果顯示，NsGPP1在0 mmol/L（對照）、100 mmol/L 和400 mmol/L 鹽處理下的表達量均明顯高于NsGPP2；而NsGPP2在對照以及鹽處理下的表達值均顯著低于NsGPP1，且NsGPP2在鹽處理下的表達水平無顯著差異（圖7）。由此可見，NsGPP1能夠響應鹽脅迫，鹽脅迫可能促進葉片中維生素C 的合成。

圖7 不同濃度NaCl 處理下NsGPP1/2 的表達量Fig.7 Expression levels of NsGPP 1/2 under different concentrations of NaCl treatment

2.7 NsGPP 基因組織表達分析

為進一步分析NsGPP基因在白刺不同組織中的表達水平，本研究利用qRT-PCR 分析了NsGPP1和NsGPP2在西伯利亞白刺果實、莖與葉中的表達情況。結果如圖8 顯示，NsGPP1在果實、莖和葉中的表達量均明顯高于NsGPP2的表達量（P＜0.05），且其在莖和葉中的表達量無顯著差異；而NsGPP2在葉片中的表達量顯著高于其在莖中的表達量。此外，在葉中，NsGPP1表達量接近于NsGPP2的2 倍，這也與鹽處理轉錄組數據中未經過鹽處理的葉片中2 個基因表達的結果基本一致，驗證了轉錄組數據結果的準確性。

圖8 NsGPP 在不同組織中的相對表達水平Fig.8 Relative gene expression of NsGPP in different tissues

3 討論

L-半乳糖途徑是植物合成維生素C 的主要途徑，而GPP 蛋白是維生素C 合成中的關鍵限速酶[4,12]，目前已在多種植物中克隆得到GPP基因[23-24]。本研究從西伯利亞白刺中克隆出2 個GPP基因，其cDNA 序列均含有完整的ORF，且與其他植物的同源基因的編碼序列長度相近，所編碼的GPP 蛋白與其他植物的GPP 蛋白序列具有較高的相似性，表明所獲得的基因為GPP基因。

GPP 蛋白具有FIG 保守結構域，本研究中的蛋白多序列比對結果顯示，2 個NsGPP 蛋白均具有完整的FIG 結構域（圖3）。Motif 分析結果顯示，NsGPP1 與NsGPP2 蛋白具有一致的motif 組成（圖5）。此外發現，NsGPP 蛋白不僅與擬南芥等其他植物存在相似性，同時也存在差異之處（圖5）。蛋白三維結構分析表型，NsGPP2 比NsGPP1 的藍色螺旋短小并且缺少β-折疊（圖6）。蛋白結構與其功能密切相關，由此可以推測，本研究所獲得的NsGPP基因所編碼蛋白很有可能與其他植物的GPP 蛋白具有類似功能，為白刺維生素C 合成中的重要一環，但由于NsGPP 蛋白與其他植物GPP 蛋白存在結構上的顯著差異，乃至NsGPP1 與NsGPP2蛋白之間的差異，可能導致它們在功能上也會存在差異。在轉錄水平，NsGPP1與NsGPP2在不同組織中均有表達，其中NsGPP1在莖中高表達，NsGPP2在葉片中表達量最高，且在3 種不同組織中，NsGPP1的表達量均顯著高于NsGPP2的表達量（圖8），由此可見，白刺NsGPP1與NsGPP2基因可能具有不同的功能。而為確定NsGPP1 和NsGPP2 功能上兩者之間存在哪些差異，還需要進一步研究來揭示。

進化分析結果顯示，西伯利亞白刺GPP 蛋白與多數草本植物GPP 蛋白進化關系較近，與蘋果等木本植物進化較遠（圖4）。分析原因，可能是由于西伯利亞白刺自身為小灌木，身形匍散，與半木質化草本植物更為接近。此外，由于NsGPP 與月季等GPP 更為相近，可以通過月季等植物GPP 蛋白功能進一步了解其功能。

適度鹽脅迫下提高了獼猴桃中的維生素 C含量[25]，而維生素C 可以清除植物體內活性氧[26]，增強植物的抗鹽性[25]。眾所周知，白刺具有很強的耐鹽性，本研究也發現NsGPP1在鹽脅迫（100 mmol/L 或400 mmol/L NaCl）下表達量均高于對照，這與上述前人研究結果較為一致，表明其可能在西伯利亞白刺抵抗鹽脅迫過程中起到重要作用。NsGPP2在鹽脅迫后表達量無顯著變化，且其在正常生長條件下表達量也顯著低于NsGPP1，因此推測其可能不響應鹽脅迫，且在維生素C 合成過程不如NsGPP1作用重要。前人研究發現，獼猴桃AceGPP基因表達并未隨著NaCl 濃度增加而改變，反而是AceGMP基因表達量顯著提高[25]。也有人發現，在水稻中轉化擬南芥維生素C 合成基因，結果發現GGP、GME或GDH對水稻葉片維生素C 積累貢獻最大，且轉化GGP基因的轉基因水稻幼苗在鹽脅迫下維生素C 含量最高，抗鹽能力最高[27]。同時還有研究發現GPP在番茄果實成熟過程中維持高水平表達，但只是維持了組成型的高表達，并不響應對乙烯、高溫等非生物脅迫[12]。由此可見，物種在漫長進化中衍生出了較大差異，而遺傳背景迥異的物種在維生素C 合成以及抗鹽機制上也會存在顯著差異。

本研究從西伯利亞白刺中鑒定出2 個NsGPP基因，發現NsGPP基因編碼蛋白均具有保守的FIG結構域，且與其他植物GPP 蛋白具有較高的相似性，推測NsGPP 可能與其他植物的GPP 蛋白具有相似的功能。此外，NsGPP1 與NsGPP2 蛋白在三維結構上也存在差異，暗示兩者可能在功能上存在差異。鹽脅迫與組織表達分析進一步證實，NsGPP1基因不僅在西伯利亞白刺果實、莖和葉中維生素C生物合成過程中起到重要作用，并且也極有可能在西伯利亞白刺耐鹽脅迫過程中起到積極作用。本研究為進一步探索白刺維生素C 生物合成以及耐鹽分子機制提供理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突