基于譜-效關系篩選菊莖葉總黃酮抗氧化物質基礎及其機制探討

巫夢瑩,陳慧芳,2,程冉冉,丁楊飛,熊俊偉,夏成凱,吳德玲,4,5,6,張 偉,4,5,6*

1安徽中醫藥大學藥學院,合肥 230012;2安慶醫藥高等專科學校,安慶 246052;3亳州職業技術學院 安徽中藥材種植聯合研究中心,亳州 236800;4安徽中醫藥大學國家中醫藥管理局中藥炮制技術傳承基地;5省部共建安徽道地中藥材品質提升協同創新中心;6中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室,合肥 230012

菊花有著悠久的臨床應用歷史,隨著對菊花中活性成分研究的不斷深入,菊花有關加工產品越來越多,而菊莖葉作為菊花采收副產物,通常作為畜牧飼料使用或被丟棄[1],目前還缺乏深入系統的研究。前期研究表明,菊花莖葉中含有黃酮類、酚酸類、多糖類、揮發油類、核苷類、氨基酸類等資源性化學成分,與菊花成分多為相似[2,3],同樣具有抗氧化、抗炎、降低血脂、改善腸道功能失調等藥理作用[4-6]。目前已有研究表明菊莖葉總黃酮(total flavonoids from stems and leaves ofChrysanthemummorifolium,TFCSL)具有良好的抗菌、抑制自由基作用,此外,菊莖葉提取物對過氧化叔丁醇誘導的人肝細胞氧化應激也具有一定的保護作用[7-9]。因此菊莖葉也可以作為總黃酮類活性成分的提取原料,這對減少資源浪費有重要意義。

中藥譜效關系研究是將中藥中各成分的指紋圖譜與藥效結果聯系起來,通過多種數據處理模型闡明各成分對藥效貢獻率,從而確定出與藥效相關的化合物群[10]。網絡藥理學是一種藥物研究的新模式,交叉應用于靶點預測、作用機制及生理病理過程分析,多角度建立藥物相關靶點,進而揭示復雜疾病機制[11]。分子對接是計算機輔助藥物設計的一種方法,從分子水平闡明中藥活性成分與靶點的相互作用及位置。血管內皮細胞通過分泌具有調節血管功能的活性物質維持動態平衡,高糖會導致人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增加活性氧的生成量,進而產生氧化應激,造成其功能障礙。同時測定丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平能更準確地反映血管內皮細胞內氧化應激狀態。本研究通過建立不同批次TFCSL指紋圖譜,探討共有峰與抗氧化應激活性的相關性,從而篩選物質基礎;利用Gene Cards和OMIM等數據庫篩選疾病靶點,構建中藥-成分-靶點網絡,預測抗氧化關鍵作用靶點及機制;結合分子對接探索小分子與蛋白之間的相互作用,以期提高菊花采收副產物菊莖葉的利用價值,為后期菊資源的綜合開發利用提供理論依據,提高中藥的資源再利用。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

12批菊莖葉樣品(S1～S12)在2021年11月均采集于亳州譙城區,經安徽中醫藥大學俞年軍教授鑒定為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥莖葉。

1.2 細胞

人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(批號:22053101,蘇州北納創聯生物技術有限公司),于內皮細胞專用培養基(endothelial cell medium,ECM)中培養。

1.3 試劑

ECM培養基(批號35924,ScienCell Research Laboratories);磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)(批號CR0013,SparkJade);胰酶細胞消化液(2.5%胰酶)(批號C0201,Beyotime);總超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號20220402、20220408、20220908,南京建成生物工程研究所);增強型CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號CA0001、EC0001,碧云天生物技術研究所);香葉木素、芹菜素、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸B、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、綠原酸(批號MUST-21061005、MUST-21040401、MUST-21040401、MUST-21030602、MUST-19010201、MUST-21030304,成都曼思特生物科技股份有限公司);異綠原酸C、隱綠原酸、咖啡酸(批號:PS001057、PS001110、PS010522,成都普思生物科技有限公司);芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、蘆丁、異鼠李素(批號:CFS201502、CFS202004、CFS202103,武漢天植生物技術有限公司),純度均>98%;葡萄糖(批號C220410F2,湖北科倫藥業有限公司);HPLC級甲酸(批號C13217140,上海麥克林生化科技有限公司),純度≥99%;抗壞血酸(Vc)(C12873349,純度>99%,上海麥克林生化科技有限公司);HPLC級乙腈(批號20210531,純度≥99%,安徽天地高純溶劑有限公司)。

1.4 儀器

LC-20ADXR型高效液相色譜儀(日本島津公司,二極管陣列檢測器,四元低壓泵,自動進樣器);SpectraMax iD5型熒光酶標儀(美國Molecular Devices 公司)。

1.5 方法

1.5.1 菊莖葉總黃酮HPLC指紋圖譜的建立

1.5.1.1 溶液的制備

精密稱定25.0 g菊莖葉粉末,在85 ℃下分別按照1∶20、1∶15、1∶15的比例加入50%乙醇,加熱回流,合并濃縮提取液。調節提取液pH為4.0,4 000 r/min離心10 min,保留上清液。將AB-8大孔樹脂與上清液2∶1裝柱,先后以水、70%乙醇沖洗,收集70%乙醇洗脫物[12],蒸干,即得TFCSL。取適量用70%甲醇溶解稀釋,作為供試品溶液。

精密稱定綠原酸、異綠原酸C、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、異鼠李素、異綠原酸B、隱綠原酸、蘆丁、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、香葉木素適量,置容量瓶中,加70%甲醇定容,作為混合對照品溶液。

1.5.1.2 色譜條件

XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.2%甲酸(B);梯度洗脫(0～5 min,8%A→10%A;5～11 min,10%A→14%A;11～14 min,14%A→17%A;14～18 min,17%A→17.5%A;18～28 min,17.5%A→18%A;28～33 min,18%A;33～43 min,18%A→18.5%A;43～53 min,18.5%A→19%A;53～68 min,19%A→30%A;68～83 min,30%A→52%A;83～85 min,52%A→8%A;85～90 min,8%A);柱溫:30 ℃;檢測波長:348 nm;流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。

1.5.1.3 方法學考察

精密度:取同一批次TFCSL樣品,按“1.5.1.1”項下方法制備供試品溶液,按照“1.5.1.2”項下色譜條件,連續進樣6次,采集圖譜,計算各共有峰峰面積及保留時間的RSD值。

重復性:取TFCSL樣品,按“1.5.1.1”項下方法重復制備供試品溶液6份,按照“1.5.1.2”項下色譜條件進樣采集圖譜,計算各共有峰峰面積及保留時間的RSD值。

穩定性:取TFCSL樣品,按“1.5.1.1”項下方法制備供試品溶液,分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“1.5.1.2”項下色譜條件進樣測定,計算各共有峰峰面積及保留時間的RSD值。

1.5.1.4 相似度評價

將12批TFCSL樣品指紋圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版本)”進行相似度分析。

1.5.2 菊莖葉總黃酮對高糖誘導HUVEC氧化損傷的保護作用

1.5.2.1 葡萄糖誘導細胞氧化應激損傷模型的最佳濃度的篩選

HUVEC采用專用培養基ECM于37 ℃,5%CO2條件下培養[13]。取生長狀態良好的HUVEC細胞,調整細胞密度為8×103個/孔,接種于96孔板中,并置于CO2培養箱進行培養,待細胞貼壁并且狀態穩定后,棄去原有的培養基,PBS清洗后加入含1%血清的培養基饑餓處理12 h。棄去原先孔板中的培養基,PBS清洗后加入不同濃度梯度葡萄糖溶液(10、20、30、40、50、100、150、200 mmol/L)建立氧化損傷模型,每個濃度設三個復孔,置于CO2培養箱中培養24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液,輕輕搖勻后,在37 ℃下避光孵育2 h,450 nm下測定其吸光度值,按照公式(1)計算細胞存活率(R),實驗重復三次。

R=[(A1-A2)/(A3-A2)]×100%

(1)

式中,A1為給藥組吸光度值,A2為空白組吸光度值,A3為對照組吸光度值。

1.5.2.2 篩選菊莖葉總黃酮對高糖誘導細胞氧化應激損傷保護作用的最適濃度

細胞接種于96孔板中,設置8個實驗組:空白對照組(control,Con)、高糖損傷模型組(high glucose injury group,HG)、TFCSL給藥組(200、400、600、800、1 000 μg/mL)和陽性對照組(25 μg/mL Vc),同樣使用CCK-8檢測細胞活力,方法同“1.5.2.1項”。

1.5.2.3 氧化應激生化指標檢測

實驗分Con組、HG組,不同批次TFCSL組和Vc組。每組設置3個復孔。收集細胞,加入PBS超聲充分裂解后,離心取上清,按照試劑盒說明書分別測定MDA含量、LDH含量和SOD活力。

1.5.2.4 統計學處理

1.5.3 譜-效關系研究

1.5.3.1 灰色關聯度分析

采用初值化變換法對原始數據進行無量綱化處理。將體外細胞實驗各藥效指標作為比較序列{X0(t)},各共有峰峰面積作為參考序列{Xi(t)},根據文獻[14]計算得到各組關聯度r。

1.5.3.2 偏最小二乘法

將標準化處理的不同批次共有峰峰面積數據設為自變量Y,各樣品抗氧化藥效指標作為因變量X,通過SIMCA-P 14.1軟件進行數據處理,得到變量投影重要性系數(variable importance in projection,VIP)值。

1.5.4 網絡藥理學研究

根據譜-效分析結果,篩選出關鍵活性成分,利用中藥系統藥理學技術平臺TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)對芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷相關蛋白靶點進行檢索。使用“Oxidative Stress”作為關鍵詞,分別在Gene cards(https://www.genecards.org/)數據庫和OMIM(https://omim.org/)獲得氧化應激人類基因相關靶點,其中Gene Cards數據庫獲取的疾病相關靶點根據基因靶點數量取其中位數處理,獲取適當數量相關性高的靶點。將疾病靶點與活性成分的作用靶點取交集,即TFCSL抗氧化應激的靶點,將以上活性成分及治療靶點交集數據導入Cytoscape 3.10.0軟件,構建“藥物-活性成分-關鍵靶點基因”網絡。將交集基因導入到STRING數據庫(https://string-db.org)進行分析,其結果導入Cytoscape 3.10.0軟件,獲得蛋白質-蛋白質相互作用PPI網絡圖,并進行核心靶點拓撲分析。將核心作用靶點在DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中進行基因本體論GO和KEGG富集分析。

1.5.5 分子對接

PubChem數據庫得到化學成分的3D結構信息,PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載靶蛋白的3D結構,使用Discovery Studio 2019軟件對靶蛋白進行去除水分子,刪除原配體,添加氫鍵等前處理操作,根據PDB晶體的原配體的空間位置定義活性口袋,運行精準分子對接(CDOCKER)模擬活性成分與蛋白對接。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 精密度試驗

取同一批次(編號:S12)制備供試品溶液,按“1.5.1.2”項下色譜條件,重復進樣6次,計算其相對保留時間RSD為0.017%～1.4%,相對峰面積RSD為0.15%～1.3%,結果表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩定性試驗

取同一批次(編號:S12)制備供試品溶液,分別在0、2、4、6、12、24 h,按“1.5.1.2”項下色譜條件進行測定,對主要色譜共有峰進行分析,計算其相對保留時間RSD為0.051%～1.7%,相對峰面積RSD為0.13%～1.2%。表明樣品溶液在24 h內相對穩定。

2.1.3 重復性試驗

取同一批次(編號:S12)的樣品6份,按“1.5.1.1”項方法制備供試品溶液,按“1.5.1.2”項下色譜條件進行測定,計算得到各共有峰相對保留時間RSD為0.041%～2.0%,相對峰面積RSD為0.17%～2.9%,表明該方法重復性良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.2.1 指紋圖譜的建立及共有峰標定

將12批次TFCSL樣品按“1.5.1.1”項下方法制得供試品溶液,按照“1.5.1.2”項下的色譜條件進樣測定。將各批次TFCSL HPLC 圖譜數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版本)”,設定(S8)為參照圖譜,采用中位數法,時間窗的寬度默認為0.1 min,經過多點校正后將色譜峰自動匹配,生成12批TFCSL HPLC指紋圖譜見圖1。

圖1 12批次TFCSL的HPLC指紋圖譜Fig.1 Fingerprint of 12 batches of TFCSL

通過對照品色譜圖(見圖2)指認,共標定12個共有峰,確定其中的9個成分(見圖3),分別是蘆丁(1號峰)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(2號峰)、異綠原酸B(3號峰)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5號峰)、異綠原酸C(6號峰)、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷(7號峰)、芹菜素(10號峰)、香葉木素(11號峰)、異鼠李素(12號峰)。

圖2 混合對照品溶液HPLC圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substance

圖3 TFCSL HPLC指紋圖譜共有峰Fig.3 Common peaks in HPLC fingerprint of TFCSL

2.2.2 相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)軟件”對12批TFCSL樣品的指紋圖譜進行相似度分析,結果見表1。12批樣品相似度在0.951～0.998,表明相似度良好,各批次樣品化學成分組成較一致。其中8號峰分離度好,峰形良好,含量穩定,故將其作為參照峰(S),計算得到各批次菊花樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間的RSD值為0.052%～0.72%,說明各批次樣品化學成分組成差異較小。

表1 TFCSL樣品HPLC指紋圖譜相似度評價結果

2.3 菊莖葉總黃酮對高糖誘導HUVEC細胞氧化應激模型的影響

2.3.1 氧化應激模型的建立

不同濃度葡萄糖作用于HUVEC后,與空白組相比,當濃度為10 mmol/L時,細胞即出現活力明顯下降(P<0.01),如圖4所示。采用GraphPad prism軟件做擬合曲線圖,計算IC50值為50.4 mmol/L。這提示50.4 mmol/L葡萄糖能引起HUVEC適度損傷,后續實驗將選取50 mmol/L作為高糖誘導HUVEC損傷的工作濃度。

圖4 葡萄糖對HUVEC活力的影響Fig.4 Effect of glucose on the activity of HUVEC

2.3.2 不同濃度菊莖葉總黃酮對高糖下HUVEC的影響

如圖5所示,TFCSL對高糖誘導HUVEC氧化損傷均具有保護作用,且呈質量濃度依賴性,其中TFCSL質量濃度為1 000 μg/mL時對HUVEC細胞氧化損傷保護效果最好,與陽性藥Vc相當。

圖5 TFCSL對氧化損傷HUVEC活力的影響Fig.5 Effect of TFCSL on the activity of oxidative damaged HUVEC

2.3.3 菊莖葉總黃酮調節HUVEC內MDA、LDH、SOD水平

如圖6所示,HG組細胞內MDA、LDH含量較空白對照組分別顯著升高至5.636 nmol/mL、85.61 U/gprot,SOD活力分別明顯下降至6.659 U/gprot,表明高糖引起細胞氧化損傷并導致胞內LDH釋放含量增加,MDA水平過高,SOD活性減弱。經TFCSL處理后,能有效降低高糖誘導的MDA、LDH水平增加,同時能明顯改善SOD水平降低,具有統計學差異(P<0.01)。

圖6 TFCSL對損傷HUVEC中MDA、LDH、SOD的影響Fig.6 The effect of TFCSL on MDA,LDH,and SOD in damaged HUVEC

2.4 譜效關系研究

2.4.1 灰色關聯度分析

由表2可知,12個共有峰與抗氧化應激活性關聯度均大于0.6,當關聯度r>0.6時,表示成分與藥效有關聯性,r越大,成分與藥效的關聯性越強[15]。12個峰關聯度都較高,說明TFCSL的抗氧化作用是不同化學成分協同作用的結果。由表2可知,與抑制LDH產生關聯度大于0.9的峰有4個,其關聯度大小依次為峰6(異綠原酸C)>峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)>峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)>峰2(木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷);對于抑制高糖誘導MDA產生,其中峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(異綠原酸C)等貢獻較大;與SOD活性關聯度均大于0.9的峰有3個,其大小依次為峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)>峰6(異綠原酸C)>峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷),對增強氧化損傷細胞的SOD活性貢獻較大。綜合考慮各指標與TFCSL中各共有峰的關聯度,發現其中存在共有藥效成分,即峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(異綠原酸C)、峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷),這些共有藥效成分是TFCSL發揮抗氧化應激作用的物質基礎。

表2 MDA、LDH、SOD與各特征峰峰面積的關聯度

2.4.2 偏最小二乘回歸法

偏最小二乘回歸法(partial least squares regression,PLSR)主要通過建立線性多元模型,以揭示因變量與自變量之間的相關性[16]。VIP值是反映自變量對因變量解釋能力的一個重要指標,其值越大說明該自變量對因變量的解釋能力越強,即相應色譜峰對應的化合物對藥效的影響越強[17]。一般認為當VIP>1時,自變量在解釋因變量時具有顯著重要性[18]。分析結果如圖7,峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰1(蘆丁)、峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰11(香葉木素)、峰2(木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷)共5個共有峰的VIP值>1,表明這些成分對LDH抑制率的貢獻度最大;峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰3(異綠原酸B)、峰6(異綠原酸C)、峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)共4個峰對抑制MDA水平的貢獻度最大;峰11(香葉木素)、峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)等3個共有峰對增加SOD活性的貢獻度最大。

圖7 TFCSL指紋圖譜與LDH、MDA、SOD VIP值Fig.7 Fingerprint of TFCSL and VIP value of LDH,MDA,SOD

2.5 網絡藥理學分析

根據譜效分析結果,篩選出關鍵化合物,共得到芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷共105個相關靶點基因,去重后得到77個。分別將從GeneCards和OMIM兩個數據庫中檢索“氧化應激”相關靶點,并將相關靶點進行合并去重后最終獲得氧化應激相關基因共1790個。將TFCSL活性成分對應靶基因取交集,共獲得33個共同靶點,兩者共同的基因可能是TFCSL抗氧化的潛在作用基因。將成分、共同靶點導入Cytoscape 3.10.0軟件,剔除與共同靶點無作用關系的成分,構建“中藥-成分-靶點”網絡圖(見圖8)。

圖8 TFCSL“中藥-成分-靶點”圖Fig.8 TFCSL "traditional Chinese medicine-component-target"

PPI網絡分析能夠了解基因間的關系,確定分子間的關聯性。通過STRING數據庫對交集靶點進行PPI分析,隱藏游離點基因后,共包含33個節點,153條邊(見圖9),按度值大小進行分類排序,TNF、CASP3是度值較高的靶點,認為是TFCSL抗氧化的關鍵作用靶點。

圖9 TFCSL抗氧化應激PPI網絡分析圖Fig.9 PPI network analysis of antioxidant stress of TFCSL

利用DAVID數據庫對獲得的核心靶點進行 GO生物功能富集和KEGG通路富集分析(見圖10)。選取智人(Homo Sapiens)物種的“Gene Ontology”項,得到包含生物過程(biological process,BP)141個條目,主要涉及凋亡過程正調控、信號轉導、對脂多糖的反應蛋白磷酸化等方面;細胞組成(cellular component,CC)23個條目,主要涉及細胞外間隙、細胞質基質、細胞質膜、細胞質、核質等方面。分子功能(molecular function,MF)35個條目,主要涉及蛋白質結合、相同蛋白結合、ATP結合、酶結合、內肽酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等方面。KEGG通路富集分析通過微生信進行可視化,這些通路主要富集在脂質和動脈粥樣硬化信號通路、IL-17信號通路、糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、TNF通路、MPKA通路等。

圖10 GO生物功能、KEGG通路富集圖Fig.10 GO biological function and KEGG pathway enrichment map

2.6 分子對接

將通過譜-效關系篩選到的活性成分(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷),與網絡藥理學選出的TFCSL抗氧化應激的關鍵作用靶點(TNF、CASP3)進行分子對接,以揭示活性成分與TNF(PDB編號1A8M)、CASP3(PDB編號1CP3)之間的相互作用和親和力,初步推斷TFCSL抗氧化應激機制。一般用結合能來評估成分與靶點的結合能力,大于0表明可以自由結合,結合能越高表明受體與配體之間的親和力越大,二者發生相互作用的可能性就越高[19]。三種化合物與各蛋白對接的結合能如表3所示。

表3 TFCSL活性成分與關鍵靶點的結合能

以TNF為例,配體(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C和香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)與對接的二維和三維圖如圖11～13所示。結果表明,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷與氨基酸殘基LEU57、SER9具有氫鍵作用,與LYS11產生鹽橋作用,與PRO12、ALA156、ASP10、LYS11產生范德華作用,與LYS11形成碳氫鍵。異綠原酸C與ASP10、SER52、LYS11具有氫鍵作用,與LEU157、SER9、LEU55、GLY54、LYS11產生范德華力,與PRO12形成碳氫鍵,與LYS11產生鹽橋作用,其母核主要與氨基酸殘基ALA156、PRO12、LYS11形成疏水結合Pi-Alkyl作用。香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷與ASP10、LYS11、ALA156、LEU157、SER9、GLY54、GLU53、PRO12產生范德華力,與LEU157、SER9、ASP10、LYS11具有氫鍵作用,與SER9形成碳氫鍵,黃酮母核中的苯環參與π-陽離子、π-陰離子、π-Sigma、π-烷基等相互作用力的形成。這些相互作用力分別使芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、異綠原酸C、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷與TNF結合并產生抑制作用。同理,這些作用力使各活性成分與CASP3靶點蛋白結合并產生抑制作用。

圖11 化合物與TNF對接的2D和3D圖Fig.11 2D and 3D diagrams of the docking of compounds with TNF

3 討論與結論

本研究建立12批TFCSL樣品 HPLC 指紋圖譜,確定12個共有峰,并通過標準品對其中9個峰進行指認。高糖環境下可導致HUVEC受損和生理因子分泌紊亂,具體表現為促進細胞凋亡,上清液中LDH、MDA含量顯著增高,SOD活性顯著降低。經TFCSL處理后除可明顯抑制細胞凋亡外,還可以改善氧化應激相關因子水平,保護HUVEC正常生理功能。利用灰色關聯度分析法和偏最小二乘回歸法分析各共有峰與抗氧化活性之間的相關性,推測峰5(芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)、峰6(異綠原酸C)、峰7(香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷)為TFCSL抗氧化應激的物質基礎。

對譜-效相關分析所得的3種成分與抗氧化應激作用進行網絡藥理學分析,構建活性成分-靶點網絡,篩選出TNF、CASP3可能為關鍵靶點,KEGG富集分析表示菊花莖葉總黃酮抗氧化可能與TNF通路、MPKA通路、IL-17信號通路等相關。GO富集分析可能通過蛋白激酶活性、ATP結合、酶結合等分子功能,以及信號傳導和調控細胞生物過程發揮抗氧化應激作用。TNF是重要促炎因子之一,其中TNF-α可以刺激血管擴張增加血管內皮細胞通透性,芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷可通過抑制MAPK通路緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎,調節TNF-α表達[20];現代藥理研究表明異綠原酸C可降低巨噬細胞中TNF-α的表達及轉錄[21];CASP除了在凋亡過程中起重要作用外,也促進促炎細胞因子的產生,香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷對去血清條件下血管內皮細胞有保護作用,降低細胞內ROS水平,下調CASP3水平[22]。

通過對Discovery Studio軟件分子對接結果的分析比較,發現TFCSL中3個主要活性成分與TNF、CASP3具有較為穩定的結合活性。通過進一步篩選對接結果,發現3種成分與TNF、CASP3蛋白作用殘基大部分都是相同的,其中與受體相互作用種類多且作用較強的共同殘基主要有:SER9、LYS11、PRO12、ALA156、ASP10、LYS11,推斷它們可能為受體的活性位點殘基。

我國菊資源分布廣泛,但目前對菊花的開發利用存在著不足,其他非用藥部位如根、莖、葉等中研究報道相對較少。菊非藥用部位的化學成分與菊花極其相似,具有顯著的生物學活性,但由于缺乏深入研究,導致這些有效成分未得到合理的利用與開發。本研究對TFCSL抗氧化應激活性進行初步的研究與探討,后續增加對未明確的共有峰進行結構解析,并結合藥理實驗對其功能進一步開發,以期為菊莖葉的開發利用與產業化方向提供科學依據和參考。