外泌體在缺血性卒中診斷及治療中的研究與應(yīng)用

尹文婧， 曲 瑒， 任佳欣， 馬虹印綜述， 郭珍妮， 楊 弋審校

腦卒中是全球公共健康的高危疾病之一，其中缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占卒中的87%，可造成嚴(yán)重的殘疾并帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。目前各種指南推薦靜脈溶栓和血管內(nèi)治療作為首選的治療方法，但其應(yīng)用受到狹窄治療時(shí)間窗的限制，并且隨著發(fā)病時(shí)間的延長(zhǎng)，治療效果也會(huì)相應(yīng)下降。因此尋找一種快速、簡(jiǎn)單的診斷方式和有效的治療手段十分重要。外泌體（exosomes）是一類直徑為40～160 nm 的天然脂質(zhì)雙層囊泡。1983 年研究人員首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了它并在1987 年將其命名為“外泌體”。最初，外泌體被簡(jiǎn)單地認(rèn)為是細(xì)胞排出的廢物，但隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)和理解變得更加全面深刻。外泌體作為一種天然的納米材料，可以運(yùn)載蛋白質(zhì)、膽固醇、核酸等物質(zhì)，并通過脂膜融合和受體-配體識(shí)別等機(jī)制完成細(xì)胞間的信息傳遞［2］。最近的研究表明，IS 后腦細(xì)胞釋放的外泌體數(shù)量增加，并且外泌體積極參與了IS 后腦損傷的恢復(fù)過程，成為IS 后潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。此外，由于外泌體低免疫原性、高生物相容性以及可穿過血腦屏障等特性被視為極具潛能的藥物遞送載體。本文主要介紹外泌體對(duì)IS的診斷價(jià)值、治療價(jià)值以及作為藥物載體的價(jià)值，為IS的治療和科學(xué)研究提供參考。

1 外泌體的生物發(fā)生

外泌體是由各種細(xì)胞分泌的脂質(zhì)囊泡，并且可以在血液、尿液、腦脊液等體液中被廣泛檢測(cè)到［3，4］。外泌體的生物發(fā)生機(jī)制已被大多數(shù)研究報(bào)道，但仍有很多細(xì)節(jié)需要進(jìn)一步探索。一般來說，外泌體的生物發(fā)生過程涉及4 個(gè)關(guān)鍵步驟，包括貨物分選、多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）的形成和成熟、MVBs 的運(yùn)輸以及MVB 與質(zhì)膜的融合［2］，并且這些過程都是在各種機(jī)制的嚴(yán)密調(diào)節(jié)下完成的［5］。MVBs 是外泌體生物發(fā)生的中心。細(xì)胞質(zhì)膜的內(nèi)陷形成了早期內(nèi)體。隨后，早期內(nèi)體將各種貨物整合到腔內(nèi)囊泡中以形成MVBs，并且可以與各種細(xì)胞器（例如反式高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體或吞噬體）進(jìn)行信息交流與傳遞。待MVBs 成熟后，會(huì)經(jīng)歷兩條生物學(xué)途徑，其一就是與溶酶體融合進(jìn)而被降解；另外一條途徑就是與質(zhì)膜融合，被釋放到細(xì)胞外并形成外泌體［6，7］。

2 外泌體在IS的診斷作用

IS 由于具有高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，并且治療效果會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低［8］。因此，早期識(shí)別或者診斷是急性腦卒中的關(guān)鍵。對(duì)于IS患者來說，時(shí)間就是大腦，尋找一種快速、敏感和準(zhǔn)確的診斷方法是控制病情進(jìn)展和改善預(yù)后的關(guān)鍵一環(huán)。

在IS 發(fā)生后，不僅外周血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放外泌體［9］，各種腦細(xì)胞也可以釋放外泌體［10，11］。這些外泌體可以穿過血腦屏障并在腦脊液和外周血中檢測(cè)到。因此，有望成為良好的早期診斷和判斷IS預(yù)后的生物標(biāo)志物［12］。最近的研究評(píng)估了IS后外泌體中微小核糖核酸（miRNA）水平的變化，發(fā)現(xiàn)IS患者的外泌體miR-134、miR-223 水平明顯高于非缺血性卒中患者。這些研究還發(fā)現(xiàn)miR-134、miR-223的表達(dá)水平與美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分以及腦梗死體積呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此，miR-134、miR-223 與IS 的發(fā)生、嚴(yán)重程度和預(yù)后緊密相關(guān)，是早期診斷和預(yù)后的潛在的新型標(biāo)志物［13，14］。大腦動(dòng)脈粥樣硬化性卒中（large artery atherosclerotic，LAA）是所有卒中亞型中預(yù)后最差、負(fù)擔(dān)最重的一種亞型，該亞型的早期診斷顯得更加的重要。2021年，Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)外泌體中l(wèi)nc_000048，lnc_001350 和lnc_016442 在LAA 患者中顯著增加，并且其水平隨著卒中嚴(yán)重程度的增加而升高。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNAs 比NIHSS 評(píng)分具有更高的判斷預(yù)后的能力。Xiao 等［16］發(fā)現(xiàn)外泌體所含有的circ_0043837和circ_0001801是LAA 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其診斷價(jià)值優(yōu)于血漿中的circRNAs，有助于更好地預(yù)防和管理LAA。這些發(fā)現(xiàn)表明，外泌體在IS 的早期診斷中具有極大的潛力。

IS包括超早期（＜6 h）、急性期（1～7 d）、亞急性期（8～14 d）和恢復(fù)期（＞14 d），外泌體在鑒別不同時(shí)期的IS 方面也有重要價(jià)值。Wang 等［17］發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（非卒中患者）相比，亞急性和恢復(fù)期卒中患者血漿外泌體中miRNA-21-5p 的水平明顯增高；超早期卒中患者血漿中外泌體miR-30a-5p 明顯升高，而在急性期中的含量卻低于對(duì)照組；與超早期患者相比，急性期患者的miRNA-21-5p 和miRNA-30a-5p 均較低。因此，外泌體有助于準(zhǔn)確地判斷IS所處時(shí)期，并且根據(jù)分期及時(shí)制定針對(duì)性的治療方案。

基于上述研究發(fā)現(xiàn)，外泌體有望作為IS 早期診斷的重要指標(biāo)，同時(shí)也是評(píng)估缺血損傷程度和階段的有希望的生物標(biāo)志物。總之，外泌體對(duì)卒中具有重要的診斷價(jià)值，需要進(jìn)一步研究其作為生物標(biāo)志物的潛力。

3 外泌體在IS的治療作用

3.1 外泌體的潛在治療作用 IS 后的腦組織修復(fù)涉及多個(gè)復(fù)雜過程，如抗炎、抗凋亡、促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生等。眾所周知，外泌體可以通過釋放各種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等與周圍細(xì)胞進(jìn)行通信。IS 發(fā)生后，外泌體的含量發(fā)生了明顯變化，這預(yù)示著外泌體可能在IS 中發(fā)揮著重要作用。

IS后會(huì)發(fā)生一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。多種細(xì)胞和細(xì)胞因子與卒中后的神經(jīng)炎癥有關(guān)。盡管炎癥在某種程度上有助于卒中的修復(fù)［18］，長(zhǎng)期不受控制的炎癥會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷，如神經(jīng)元損傷、血管老化等。因此，控制炎癥是IS 治療的關(guān)鍵目標(biāo)。小膠質(zhì)細(xì)胞在IS 的炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［19］。外泌體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化是一種有前景的治療策略。例如，Zhao 等［20］發(fā)現(xiàn)來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以通過miR-223-3p 調(diào)節(jié)CysLT2RERK1/2 介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞極化發(fā)揮抗炎作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫細(xì)胞也是加劇IS炎性反應(yīng)的重要免疫細(xì)胞。研究人員發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)神經(jīng)元來源的外泌體通過miR-18c-3p下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中CXCL1和炎癥因子的表達(dá)，并且可以進(jìn)一步減少浸潤(rùn)腦組織的外周免疫細(xì)胞數(shù)量，從而改善IS后的炎癥［21］。

細(xì)胞凋亡廣泛地參與到IS的發(fā)生發(fā)展中。來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過miR-134 下調(diào)caspase-8 的表達(dá)進(jìn)而抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，這可能是IS 的潛在治療靶點(diǎn)［22］。Deng 等［23］發(fā)現(xiàn)來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體通過miR-138-5p下調(diào)LCN2、Bax 和caspase-3 水平達(dá)到抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用。由此可見，具有活性成分的外泌體可能通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)IS后的神經(jīng)功能恢復(fù)。

在IS 所致的血管損傷中，促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和受損區(qū)域血管生成是至關(guān)重要的。血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及一系列關(guān)鍵因子的相互作用，如VEGF、VEGFR2、Ang-1 和Tie-2。Hu 等［24］發(fā)現(xiàn)，來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以通過miR-21-5p 增加微血管密度。由于腦組織對(duì)缺血缺氧極其敏感且耐受性差，當(dāng)腦血管相應(yīng)供血?jiǎng)用}被阻塞后，腦部神經(jīng)元會(huì)快速地發(fā)生不可逆的損傷，甚至出現(xiàn)壞死。最近的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中活性物質(zhì)能夠在神經(jīng)元中起到很重要的調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的增殖和分化，有助于促進(jìn)神經(jīng)元的再生和突觸的重塑。例如，Jin 等［25］發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞外泌體中的表面蛋白HepaCAM 通過獨(dú)特的表面接觸機(jī)制促進(jìn)軸突生長(zhǎng)。綜上，外泌體在促進(jìn)血管生成和神經(jīng)發(fā)生方面具有潛力，并促進(jìn)IS 后的神經(jīng)功能恢復(fù)。

3.2 外泌體作為藥物載體的作用 1996 年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了唯一治療IS的藥物阿替普酶，但其應(yīng)用受到狹窄治療窗口的限制。近年來研究人員一直在尋找新的藥物（例如，依達(dá)拉奉、姜黃素等）來延緩病情進(jìn)展，然而大多數(shù)藥物很難通過血腦屏障（blood-brain barrier），該屏障一直是限制IS治療藥物發(fā)展的瓶頸［26］。外泌體具有免疫原性低、穩(wěn)定性好、遞送效率高等特點(diǎn)。更重要的是，外泌體可以穿過血腦屏障，有望成為IS后的藥物遞送載體。

大量證據(jù)表明，活性氧類（ROS）在IS 后立即積聚，通過激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致進(jìn)一步的缺血性損傷。因此，清除ROS可以促進(jìn)IS的功能恢復(fù)。依達(dá)拉奉（edaravone，Edv）是一種臨床上常用的神經(jīng)保護(hù)藥物，可以清除ROS，抑制細(xì)胞過氧化物，減少細(xì)胞損傷［27］。然而其應(yīng)用受到半衰期短、難以通過血腦屏障以及生物利用度低等潛在的限制。為了解決這一問題，Li 等［28］將依達(dá)拉奉加載到巨噬細(xì)胞衍生的外泌體（Exo+Edv）中，隨后發(fā)現(xiàn)Exo+Edv 提高了依達(dá)拉奉的生物利用度，減少了神經(jīng)元損傷和梗死面積，提供了良好的神經(jīng)保護(hù)作用。Guo 等［29］將依達(dá)拉奉加載到血漿來源的外泌體中，與游離依達(dá)拉奉相比，負(fù)載依達(dá)拉奉的外泌體可改善腦靶向性，提高安全性和生物利用度，并減少腦卒中急性期的梗死面積。

與其他抗氧化劑相比，姜黃素是一種從姜科植物姜黃中分離得到的天然抗氧化劑，具有來源簡(jiǎn)單、抗氧化活性強(qiáng)、無毒等優(yōu)點(diǎn)。此外，它在治療IS表現(xiàn)出清除ROS，抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)的特性［30，31］。然而，姜黃素穩(wěn)定性差且難以通過血腦屏障限制了其臨床發(fā)展［32，33］。一些報(bào)道已經(jīng)證實(shí)，姜黃素可以被裝載到干細(xì)胞衍生的外泌體上，并且在IS 中產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用并減輕缺血再灌注損傷［34］。近期，He 等［35］將姜黃素裝載到巨噬細(xì)胞衍生的外泌體（Exo-cur）中，隨后發(fā)現(xiàn)Exo-cur 不僅具有良好的穩(wěn)定性，而且具有減少缺血腦組織中 ROS的作用。

這些結(jié)果表明相比傳統(tǒng)的藥物直接攝入體內(nèi)的方法，外泌體作為藥物載體可以使藥物具有更好的穩(wěn)定性和更高的靶向性，為IS治療提供了新方向。

4 外泌體的臨床試驗(yàn)

近年來，越來越多的研究證實(shí)外泌體可以促進(jìn)IS的神經(jīng)血管再生和功能恢復(fù)。然而基于外泌體治療IS 的臨床研究仍處于初步階段，需要設(shè)計(jì)良好的臨床試驗(yàn)來促進(jìn)外泌體的臨床轉(zhuǎn)化。截至目前，已經(jīng)有兩個(gè)關(guān)于外泌體在治療IS 的臨床研究注冊(cè)（NCT03384433、NCT06138210）。前一項(xiàng)臨床研究的目的是評(píng)估富含mir-124 的同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對(duì)改善急性缺血性卒中患者殘疾的作用；后一項(xiàng)臨床研究的目的是探索人多功能干細(xì)胞外泌體對(duì)急性缺血性卒中的治療作用。此外，還有一些是有關(guān)外泌體在腦卒中的預(yù)測(cè)、診斷和預(yù)后作用的研究（NCT05035134、NCT05370105），目前仍在招募中。

5 展 望

IS是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率和高死亡率的疾病之一。越來越多的研究人員關(guān)注外泌體在IS 的作用，并將外泌體看作是一種潛在的IS治療策略。外泌體作為一種通訊物質(zhì)和運(yùn)輸載體，在IS 中發(fā)揮重要作用，例如抗炎、抗凋亡、血管生成、神經(jīng)發(fā)生等。最近的報(bào)道集中在外泌體作為一種潛在的藥物遞送途徑在IS的應(yīng)用。然而，外泌體給藥的劑量、頻率和途徑尚未達(dá)成一致，需要進(jìn)一步研究，以促進(jìn)外泌體治療從實(shí)驗(yàn)室走向臨床。迄今為止，外泌體研究仍處于初始階段，沒有足夠的信息可用于將外泌體治療轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐。因此，基于外泌體的治療在減輕IS 造成的功能障礙方面具有巨大的潛力，值得進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：尹文婧、曲瑒負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)論文框架、查閱文獻(xiàn)并起草論文；任佳欣、馬虹印負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)；郭珍妮負(fù)責(zé)論文修改；楊弋負(fù)責(zé)擬定寫作思路、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。