Caspase家族與失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮的研究進(jìn)展

田 淼， 陳 雨， 陶 朋綜述， 陳 沛審校

Caspase 家族是一組結(jié)構(gòu)上相似的蛋白酶，能夠切割并活化蛋白質(zhì)，已鑒定在人類中存在的共有11 個成員，根據(jù)主要作用分類可分為炎癥Caspases和凋亡Caspases，其中，凋亡Caspases 又包括凋亡起始Caspases 與凋亡效應(yīng)Caspases［1-5］。研究證明Caspase 家族各成員在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮作用，但研究重點為神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)纖維［6］。對于所支配骨骼肌中Caspases 的變化情況，也有一些學(xué)者在實驗中提及，雖然研究相對分散，但都提示Caspase 家族是失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮通路的重要執(zhí)行因子，通過梳理Caspase 家族在其中發(fā)揮作用的主要通路有助于探索失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮的機(jī)制及治療方向，現(xiàn)做如下綜述。

1 凋亡Caspases

1.1 凋亡Caspases概述 凋亡Caspases根據(jù)調(diào)控細(xì)胞凋亡的激活順序，分為凋亡起始Caspases和凋亡執(zhí)行Caspases 2大類。凋亡起始Caspases分為Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，又稱為“誘導(dǎo)Caspases”，參與細(xì)胞外源性和內(nèi)源性凋亡途徑。

外源性凋亡途徑中，胞外“死亡信號”通過死亡受體傳遞給細(xì)胞內(nèi)，一些常見的死亡受體如Fas 受體、腫瘤壞死因子受體（TNFR1）等與相應(yīng)死亡配體結(jié)合形成死亡域蛋白（FADD）等可激活Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10，給細(xì)胞下達(dá)“凋亡指示”，再由Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7執(zhí)行凋亡事件。其通路可歸納為Fas、TNF-α 等→FADD 等→Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10→Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7的傳導(dǎo)［7，8］。

內(nèi)源性凋亡途徑是由線粒體介導(dǎo)的，常見凋亡刺激如DNA 損傷、ATP 耗竭，可啟動線粒體途徑，此外還有線粒體蛋白中的Bcl-2 家族蛋白利用信號傳導(dǎo)，使線粒體腫脹通透性增強，釋放凋亡活性物質(zhì)如細(xì)胞色素C（Cyt C）吸引pro-Caspase-9 等形成凋亡復(fù)合體，后進(jìn)行自我剪切脫離，激活下游Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，執(zhí)行細(xì)胞凋亡。其傳導(dǎo)通路可總結(jié)為，DNA 損傷、ATP 耗竭、Bcl-2/Bax 比值變化等→線粒體膜通透性增加→釋放Cyt C→活化Caspase-9→Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 激活進(jìn)而執(zhí)行凋亡程序［9］。

1.2 Caspases 促進(jìn)失神經(jīng)支配骨骼肌細(xì)胞凋亡 失神經(jīng)支配后，骨骼肌缺乏神經(jīng)營養(yǎng)支持、運動終板退化、血管床發(fā)生退變等病理變化使肌肉組織發(fā)生萎縮。Caspase 家族各成員在失神經(jīng)支配肌萎縮的病理過程中也發(fā)揮促進(jìn)效應(yīng)。已證實Caspases參與失神經(jīng)支配肌細(xì)胞凋亡［8，10，11］。肌細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞程序性死亡方式，主要表現(xiàn)為肌細(xì)胞縮小、細(xì)胞核固縮、染色體DNA裂解。

在失神經(jīng)支配肌萎縮過程中，Caspase-3 能促進(jìn)肌細(xì)胞凋亡。Borisov 等［12］觀察到坐骨神經(jīng)損傷后，大鼠失神經(jīng)支配比目魚肌和趾長伸肌中出現(xiàn)典型凋亡特征的肌細(xì)胞、同時也檢測到TUNEL 染色陽性細(xì)胞，提示失神經(jīng)支配后肌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡。高睿琦等［13］切斷大鼠坐骨神經(jīng)后取腓腸肌進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時腓腸肌中Caspase-3 mRNA 表達(dá)增強。提示Caspase-3 在神經(jīng)損傷后的肌肉組織中發(fā)揮促凋亡作用。

同時抑制Caspase-3表達(dá)能減弱失神經(jīng)支配后肌細(xì)胞凋亡程度。如有研究者［14］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用Caspase-3抑制劑Ac-DEVE-CHO，可顯著降低失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮中細(xì)胞核凋亡的比例。董玉珍等［15］發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)素3在抑制大鼠坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌的Caspase-3 的表達(dá)后肌細(xì)胞凋亡減弱。宗海斌等［16］在研究大鼠坐骨神經(jīng)損傷實驗中取腓腸肌進(jìn)行檢測，也發(fā)現(xiàn)一致現(xiàn)象，即抑制Caspase-3 表達(dá)能減弱肌細(xì)胞凋亡。對于Caspase-3 表達(dá)抑制后能否影響失神經(jīng)支配肌萎縮其他病理改變后也有學(xué)者進(jìn)行探索。如Plant 等［17］發(fā)現(xiàn)脛神經(jīng)切斷后2 周，Caspase-3 基因敲除小鼠的腓腸肌比未敲除基因小鼠的腓腸肌濕重更重，TUNEL標(biāo)記的凋亡肌細(xì)胞更少。但兩組泛素-蛋白酶體系總蛋白及促使萎縮的2 種特異性泛素連接酶E3［肌肉萎縮盒F（MAFbx）和肌肉環(huán)狀指-1（Mu RF1）］含量均無明顯區(qū)別。提示Caspase-3是通過參與細(xì)胞凋亡促使肌肉萎縮，而不影響失神經(jīng)支配肌細(xì)胞中泛素-蛋白酶體系介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解。雖然大多學(xué)者的研究證實Caspase-3 在失神經(jīng)支配肌細(xì)胞中的促凋亡作用，但有極少學(xué)者有不同發(fā)現(xiàn)。Argadine 等［18］研究大鼠失神經(jīng)支配膈肌發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)支配1 d、3 d、5 d、7 d 后，蛋白印跡法檢測膈肌中Caspase-3 活性并未增強。考慮失神經(jīng)支配時間較短，Caspase-3 有增強趨勢但未體現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異，或大鼠種類、實驗操作等的影響。

除Caspase-3外，Caspase-8和Caspase-9也被證實在失神經(jīng)支配骨骼肌中發(fā)揮相似作用。吳珍元等［19］使用Western Blot 檢測坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)均有增加且肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。史紅偉等［20］切斷大鼠坐骨神經(jīng)后分別于術(shù)后2 d、14 d、28 d使用分光光度法檢測腓腸肌中Caspase-8、Caspase-9含量，結(jié)果提示Caspase-8、Caspase-9均有升高，且于14 d達(dá)到高峰，證明Caspase-8、Caspase-9 在神經(jīng)損傷后相應(yīng)靶肌肉中需一段時間達(dá)到最大效應(yīng)量。張賢等［21］則發(fā)現(xiàn)失神經(jīng)支配環(huán)杓后肌中Caspase-3 表達(dá)升高，在失神經(jīng)支配3～6 月后Caspase-3 表達(dá)量逐漸達(dá)到峰值。也證明失神經(jīng)支配后肌細(xì)胞中凋亡Caspases 需要一段時間達(dá)到峰值，但不同肌肉組織到達(dá)峰值時間不同，這有助于判斷神經(jīng)損傷后進(jìn)行修復(fù)的最佳時間范圍。

1.3 Caspases 參與失神經(jīng)支配骨骼肌細(xì)胞凋亡的通路 失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮過程中，胞外“死亡信號”激活Caspases參與的外源性細(xì)胞凋亡途徑發(fā)揮作用。能通過“死亡信號”→作用于Fas 受體等→產(chǎn)生FADD→激活Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10→驅(qū)動Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 進(jìn)行傳導(dǎo)。吳朝暉等［22］取臂叢神經(jīng)損傷后大鼠肱二頭肌，用免疫組織化學(xué)染色法檢測Fas、Caspase-8，發(fā)現(xiàn)肱二頭肌細(xì)胞發(fā)生凋亡且Fas、Caspase-8 升高。證實這一通路被激活，參與失神經(jīng)支配肌萎縮的過程。

此外，失神經(jīng)支配骨骼肌也發(fā)生由Bcl-2 蛋白家族參與的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，通過Bcl-2/Bax比值變化→線粒體膜通透性增加→釋放Cyt C→Caspase-3 激活進(jìn)而執(zhí)行凋亡程序［11］。Siu等［23］對比野生型大鼠（未敲除Bax基因大鼠）與Bax基因敲除型大鼠失神經(jīng)支配腓腸肌變化情況，對兩組大鼠實施脛神經(jīng)斷離手術(shù)，14 d 后取腓腸肌，野生型大鼠腓腸肌中Cyt C、Caspase-3、Caspase-9 均表達(dá)明顯增強，Bax 基因敲除型大鼠腓腸肌中上述3 種蛋白表達(dá)均受到抑制。結(jié)合Siu［24］的另一實驗，切斷大鼠脛神經(jīng)后14 d取腓腸肌檢測發(fā)現(xiàn)，相比對照組，去神經(jīng)支配腓腸肌的Bax/Bcl-2 比值顯著增加，Cyt C 表達(dá)增強，同時Caspase-3、Caspase-9 的mRNA 上調(diào)。可提示由Bcl-2 蛋白家族介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑在失神經(jīng)支配骨骼肌中被激活。另有Always 等［25］取脛神經(jīng)斷傷后14 d的大鼠腓腸肌及比目魚肌，使用蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)支配腓腸肌及比目魚肌中Bax 蛋白水平升高、同時Caspase-8 表達(dá)增加。以上均提示失神經(jīng)支配肌細(xì)胞中發(fā)生了Bcl-2/Bax 比值變化→線粒體膜通透性增加→釋放Cyt C→Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10→Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7傳導(dǎo)的肌細(xì)胞凋亡。

1.4 Caspases 參與失神經(jīng)支配骨骼肌細(xì)胞凋亡的下游信號 當(dāng)失神經(jīng)支配骨骼肌中Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 這些凋亡執(zhí)行Caspases 被激活后，迅速募集下游信號發(fā)揮凋亡效應(yīng)。Caspase-3、Caspase-7 主要作用于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP ribose polymerase，PARP）［26］。PARP 負(fù)責(zé)DNA 修復(fù)與完整性監(jiān)控，而Caspase-3 剪切PARP 使其失活，促使DNA 裂解而發(fā)生肌細(xì)胞凋亡。Caspase-6 能夠降解穩(wěn)定細(xì)胞核及細(xì)胞骨架的成分，核纖層蛋白A（lamin A）及細(xì)胞角蛋白18（keratin 18），從而導(dǎo)致肌細(xì)胞核及肌細(xì)胞骨架的破壞。雖然分為不同通路，但上述通路之間相互聯(lián)系，且Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 能夠正反饋調(diào)節(jié)凋亡起始Caspases，從而進(jìn)一步促進(jìn)失神經(jīng)支配肌細(xì)胞萎縮。

2 炎癥Caspases

2.1 炎癥Caspases 概述 炎癥Caspases 引起細(xì)胞焦亡包括經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑和非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑，前者主要為Caspase-1參與；后者由 Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 介導(dǎo)。細(xì)胞焦亡和細(xì)胞凋亡都屬于細(xì)胞程序性死亡，不同的是前者表現(xiàn)為細(xì)胞逐漸腫脹，胞膜破裂，是裂解性細(xì)胞死亡，會誘發(fā)炎癥反應(yīng)。這是因為焦亡信號激活穿孔素（GSDMD）后，在細(xì)胞膜表面形成“孔道”釋放胞內(nèi)炎性物質(zhì)（如炎癥細(xì)胞因子、趨化因子等），導(dǎo)致細(xì)胞的滲透性溶解及炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大［27-29］。炎癥小體是細(xì)胞焦亡的啟動物質(zhì)，由核心感受器支架蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）和效應(yīng)器前半胱天冬氨酸酶（pro-Caspase-1）共同構(gòu)成［30］。

2.2 炎癥Caspases 與失神經(jīng)支配骨骼肌 關(guān)于Caspase 家族主導(dǎo)的炎性途徑在失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮的少量研究主要集中在肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）疾病中，在其他神經(jīng)源性肌萎縮疾病中的研究報道極少，這是既往研究較少關(guān)注的肌萎縮途徑，但近期研究有了新的發(fā)現(xiàn)。雖然臨床上其他疾病如外傷所致神經(jīng)損傷、周圍性面癱、腦卒中等導(dǎo)致肌萎縮與肌萎縮側(cè)索硬化同屬于神經(jīng)源性肌萎縮，但它們的病理機(jī)制并不完全一致［31］。故肌萎縮側(cè)索硬化中Caspases 改變能為失神經(jīng)支配骨骼肌研究提供實驗思路，但仍需單獨研究進(jìn)行驗證。

Caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑為炎癥小體（NLRP3）→Caspase-1→激活I(lǐng)L-1β、驅(qū)動IL-18→穿孔素（GSDMD）→細(xì)胞膜形成焦亡小孔→細(xì)胞炎性死亡。Lehmann 等［32］取肌萎縮側(cè)索硬化癥狀早期的患者及大鼠腓腸肌組織進(jìn)行檢驗，發(fā)現(xiàn)兩組萎縮肌組織中Caspase-1、IL-1β水平較對照組（健康鼠、健康人）顯著升高。提示在肌萎縮側(cè)索硬化中Caspase-1 參與失神經(jīng)支配骨骼肌的萎縮過程。近期You 等［33］使用蛋白印跡法、rt-PCR 法檢測證實小鼠坐骨神經(jīng)斷傷后14 d開始腓腸肌中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD 表達(dá)較假手術(shù)組升高，并在此后14 d 持續(xù)上升。而NLRP3 基因敲除組的小鼠在失神經(jīng)支配后同期檢測腓腸肌發(fā)現(xiàn)Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD、等炎癥相關(guān)分子的表達(dá)明顯減少。這證明Caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑參與失神經(jīng)支配骨骼肌萎縮過程。

3 總 結(jié)

Caspase 家族在失神經(jīng)支配骨骼肌中發(fā)揮作用，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑促進(jìn)肌細(xì)胞萎縮已被驗證。炎癥Caspases 中，Caspase-1 傳導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑也被證實參與失神經(jīng)支配骨骼肌的萎縮過程，但還沒有學(xué)者在實驗中觀察肌細(xì)胞是否存在細(xì)胞焦亡的特征形態(tài)即細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破裂。故仍需進(jìn)一步實驗進(jìn)行觀察研究Caspase-1 對失神經(jīng)支配肌細(xì)胞的影響。Caspase 家族中還有一部分成員的功能尚未完全厘清，暫未見相關(guān)研究記錄Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11 等在失神經(jīng)支配肌萎縮中的變化。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：田淼負(fù)責(zé)擬定寫作思路、論文撰寫；陳雨、陶朋負(fù)責(zé)文獻(xiàn)收集、論文設(shè)計；陳沛負(fù)責(zé)論文修改、指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。