保健食品中新型雙醋酚汀衍生物的發現、合成與鑒定

夏金濤 吳婉琴 朱松松 江 豐

隨著生活水平的提高,肥胖現象呈逐年上升的趨勢。肥胖不僅影響個人形象,還會導致高血壓、糖尿病等心血管疾病的發生[1]。由于藥物減肥存在作用機制明確,見效快的特點,近年來,在保健食品中非法添加西藥成分的情形頻頻發生[2-9]。針對這種現象,國家食品藥品監督管理局和國家市場監督管理總局先后發布了8個補充檢驗標準,涉及39種減肥類非法添加物的檢測[10]。但這些檢驗標準僅能對靶向目標物進行分析,針對的物質種類和數量明顯偏少,存在漏檢現象。一些不法商家利用這一漏洞,在暴利的驅使下,開始向減肥類食品基質中添加補充檢驗標準監管以外、國家明令禁止的西藥成分的結構衍生物[11-15]。由于這些新型結構衍生物的毒理藥理學作用機制及服用劑量尚不明確,消費者在不知情的情況下服用后將會對健康和生命安全造成嚴重的威脅。同時,這些新型結構衍生物未經批準而非法應用于食品中,給執法部門的監管帶來了巨大挑戰。

雙醋酚汀是一種臨床上常用的輕瀉劑類藥物,在腸道內經腸液堿解產生刺激性更強的酚汀,從而加速腸道的蠕動而發揮導瀉作用。近年來,雙醋酚汀作為減肥類非法添加物在食品中常被檢出[16]。為鑒別食品中非法摻雜雙醋酚汀等化合物的不當行為,國家市場監督管理總局已發布了BJS202209《食品中雙醋酚丁等19種化合物的測定》補充檢驗方法對其進行檢測。由于在食品中添加新型化學物質的隱蔽性強,該法遠不能滿足實際檢測的需要,如最近已有雙酚沙汀在果味型果凍中被檢出的報道[17]。研究擬通過高分辨質譜對市售及網購的24批次明示或暗示具有減肥功效的食品進行篩查,在2批次果凍中發現了一種未見能獲批作為食品添加劑的新型雙醋酚汀類衍生物,經同位素質譜圖、二級質譜圖、核磁共振波譜圖解析及從頭合成策略比對分析研究,確證該新型非法添加物,以期為監管部門及時做到快發現、早預防提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

薄層層析硅膠板:TLC Silica gel 60 F254,德國默克公司;

wilmad核磁管:5 mm,湖北熱安科技有限公司;

柱層析硅膠:37～48 μm,青島海洋化工廠;

微孔濾膜:0.45 μm,天津津騰實驗設備有限公司;

果味型果凍等:網購;

氘代氯仿CDCl3:D含量99.8%,美國CIL公司;

氘代二甲亞砜DMSO-d6:D含量99.8%,美國CIL公司;

乙腈:色譜純,德國默克公司;

甲酸:質譜純,美國 Fisher Scientific 公司;

三苯甲基四(五氟苯基)硼酸鹽:純度98%,上海阿拉丁試劑有限公司;

5-氯靛紅(純度98%)、吡啶(純度99.5%)、苯酚(純度≥99.5%):上海麥克林生化科技有限公司;

6-氯靛紅:純度99.82%,上海皓鴻生物醫藥科技有限公司;

雙醋酚汀:純度98%,天津阿爾塔科技有限公司;

其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

超高效液相色譜儀:ExionLCTMAD型,上海愛博才思分析儀器貿易有限公司;

高分辨質譜儀:Triple TOF TM 5600+型,上海愛博才思分析儀器貿易有限公司;

全數字化超導核磁共振波譜儀:AVANCE Ⅲ型,600 MHz,德國Bruker公司;

高效液相色譜儀:Waters e2695型,美國Waters公司;

套裝加熱型磁力攪拌器:MS-H280-Pro型,北京大龍興創實驗儀器有限公司;

勻質機:D-500型,北京大龍興創實驗儀器有限公司;

旋轉蒸發儀:Hei-Vap Expert ML型,德國Heidolph公司;

超聲輔助萃取儀:S 180H型,德國Elma公司;

電子天平:ME 204型,精度0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司;

去離子水發生器:Milli-Q型,美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 高分辨質譜分析

(1) 供試品溶液制備:稱取 1.0 g供試樣品,用剪刀剪碎于50 mL比色管中,加入30 mL乙腈,40 ℃超聲輔助萃取15 min,冷卻,用乙腈定容至50 mL,靜置5 min,取上清液過0.45 μm濾膜,備用。

(2) 色譜條件:流動相A為含0.1%甲酸—水溶液,B為乙腈;流速0.3 mL/min;進樣體積5 μL;柱溫40 ℃;色譜柱C18色譜柱(100 mm×2. 1 mm,1.7 μm);梯度洗脫程序:0～2 min,5% B;2～14 min,5%～95% B;14～17 min,95% B;17～20 min,5% B。

(3) 質譜條件:采用電噴霧離子源(ESI源)正離子掃描模式采集數據;離子源溫度550 ℃;電噴霧電壓5 500 V;霧化氣壓力和輔助氣壓力均為344.7 kPa;氣簾氣壓力241.3 kPa;去簇電壓60 V;碰撞能量35 V;碰撞能量范圍±15 V;掃描范圍:一級質譜50～1 100 Da,二級質譜50～1 100 Da。

1.2.2 NMR結構分析

(1) 供試品制備:取約100 g樣品于1 000 mL塑料量杯中,用勻質機攪碎,分3次用300 mL乙腈超聲輔助萃提10 min,抽濾。濾液濃縮富集后,經柱層析色譜純化(V乙酸乙酯∶V石油醚為35∶65)得到分析物約25 mg,經高效液相色譜分析純度≥99%。

(2) 核磁測試條件:鎖場溫度298 K;1H-NMR脈沖序列zg30;譜寬(SWH)9.6 kHz,觀察道中心頻率偏置(O1P)4.8 kHz;13C-NMR脈沖序列zgpg30,譜寬(SW)120 kHz,觀察道中心頻率偏置(O1P)60 kHz;HSQC和HMBC分別采用HSQCEDETGPSISP2.3和HMBCGPLPNDQF標準脈沖程序,采樣數據點陣均為t2×t1=2 048×256,累加次數32。

1.2.3 雙醋酚汀疑似結構的從頭合成 參照圖1,根據文獻[18]的方法進行疑似結構中間體I的合成。

圖1 雙醋酚汀類似物的從頭合成技術路線

1.2.4 數據處理 質譜數據采集在Analyst TF 1.8.1 Software上進行;非靶向篩查在Library View上進行;數據分析在PeakView?2.2上進行;質譜數據處理在Origin 9.0上進行;NMR數據通過Topspin 3.5 pl 7采集,譜圖處理在Mestrenova 14.0上完成。

2 結果與分析

2.1 減肥類保健食品中非法添加物篩查

應用HRMS篩查條件,通過Triple TOF的IDA模式對24批次減肥類保健食品進行篩查,結果在2批次果凍制品中發現了一種未見報道的新型雙醋酚汀類衍生物。測試條件下,該新型化合物的出峰時間為10.693 min(圖2)。對雙醋酚汀與其新型衍生物的同位素質譜圖分析發現,與雙醋酚汀的同位素質譜圖(圖3)相比,新型衍生物質荷比436.09峰面積與質荷比438.08峰面積之比約為3∶1、質荷比437.10峰面積與質荷比439.09峰面積之比也約為3∶1,結合氯元素的天然同位素35Cl和37Cl豐度比為3∶1,推測未知非法添加物可能含有氯原子取代。對雙醋酚汀與其新型衍生物的二級質譜圖(圖4)分析發現,將新型衍生物母離子質荷比436.09、子離子質荷比300.04/258.03/230.03與雙醋酚汀母離子質荷比402.13、子離子質荷比266.08/224.07/196.07比對,新型衍生物比雙醋酚汀相對分子質量多34,表明該新型衍生物疑似為雙醋酚汀的單氯取代物。但氯原子在雙醋酚汀上的取代位置經質譜不能明確分析得出,因此有必要借助核磁測試明晰化合物的結構。

圖2 雙醋酚汀類似物的非靶向篩查總離子

圖3 雙醋酚汀及其類似物5-Cl雙醋酚汀的一級同位素質譜圖

圖4 雙醋酚汀及其類似物5-Cl雙醋酚汀的二級質譜圖

2.2 疑似物的核磁譜圖分析

取雙醋酚汀和供試樣品各約15 mg,用DMSO-d6溶解,上機檢測。結果表明,疑似物的1H NMR和13C NMR分別為1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ11.00(s,1H),7.41(d,J=2.1 Hz,1H),7.33(dd,J=8.3,2.2 Hz,1H),7.23～7.18(m,4H),7.15～7.09(m,4H),7.01(d,J=8.3 Hz,1H),2.25(s,6H);13C NMR(151 MHz,DMSO)δ178.0,169.6,150.2,140.8,139.0,135.2,129.6,129.2,126.8,126.4,122.5,112.2,62.0,21.3。經與雙醋酚汀的1H NMR對比(圖5),從氫譜中可見δ11.00(s,1H)為活潑NH;從δ7.41(d,J=2.1 Hz,1H),7.33(dd,J=8.3,2.2 Hz,1H)與7.01(d,J=8.3 Hz,1H)的耦合裂分情況判斷這3個氫原子為同一自旋體系;δ2.25(s,6H)為乙酸酐上的甲基信號;通過將1H NMRδ7.23～7.18(m,4H),7.15～7.09(m,4H)信號和13C NMRδ129.2,122.5的信號強度與雙醋酚汀的13C NMR對比,可知疑似物的氯原子取代應發生在吲哚啉骨架5號或6號位,其具體位置通過核磁手段還無法確定。由于疑似物的合成步驟并不繁瑣,因此通過從頭合成策略對參照物進行制備,通過核磁氫譜比對來精準確證化合物的結構。

圖5 雙醋酚汀及其類似物5-Cl雙醋酚汀的1H NMR和13C NMR譜圖

2.3 疑似物的從頭合成

參照1.2.3方法對5-氯雙醋酚汀和6-氯雙醋酚汀進行合成,得到5-氯雙醋酚汀0.80 g,核磁數據與2.2的一致;6-氯雙醋酚汀0.75 g,其核磁數據及質譜數據為1H NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),7.35(d,J=8.1 Hz,1H),7.24～7.16(m,4H),7.16～7.09(m,5H),7.01(d,J=2.0 Hz,1H),2.26(s,6H);13C NMR(151 MHz,DMSO-d6)δ178.3,169.6,150.1,143.3,139.1,133.4,132.1,129.5,128.0,122.5(重合),110.8,61.4,21.3。HRMS(ESI):理論計算值C24H19NO5Cl[M+H]+:436.094 6;實際測試值:436.095 8。經與疑似物進行核磁氫譜比對(圖6)發現,5-氯雙醋酚汀與疑似物氫譜完全一致,而6-氯雙醋酚汀與疑似物氫譜差別明顯。因此,疑似物的精細結構被確證為5-氯雙醋酚汀。

圖6 疑似物提取物與合成的5-氯雙醋酚汀、6-氯雙醋酚汀的1H NMR對比圖

2.4 疑似物的譜學特征和譜峰歸屬

結合核磁共振二維譜,將5-氯雙醋酚汀和雙醋酚汀的結構式及原子編號列于圖7,波譜學數據特征及原子歸屬見表1。由表1的一維(1H NMR、13C NMR和DEPT135)、二維核磁數據(HSQC、HMBC)可知,5-氯雙醋酚汀和雙醋酚汀的氫譜和碳譜化學位移基本保持一致。由于5-氯雙醋酚汀5號位存在氯原子取代,基于氯原子的誘導吸電子和共軛給電子效應,碳原子的化學位移略向低場移動,符合客觀規律。

表1 雙醋酚汀和5-氯雙醋酚汀的核磁數據及歸屬?

圖7 雙醋酚汀和5-氯雙醋酚汀的結構式

3 結論

通過對雙醋酚汀的質譜裂解規律分析,利用Triple TOF系統的IDA模式,一針進樣即可對化合物的同位素質譜圖和二級質譜圖進行分析,確認疑似物為單氯代雙醋酚汀。通過核磁共振波譜確證疑似物的單氯代發生在吲哚啉苯環骨架5或6號位上,縮小了精準識別的范圍。進一步通過從頭合成策略對疑似物的可能結構進行制備,最終憑借氫譜比對確證了疑似物為5-氯雙醋酚汀。試驗建立了食品中非法添加物精準識別確證的鑒定方法,并在兩份樣本中檢測出國家標準中未納入的非法添加物5-氯雙醋酚汀,需要引起相關部門的關注和重視。