基于MTT比色和響應面法優化側孢短芽孢桿菌最大活菌數培養條件

宋 鵬 李理想 趙 彪 王澤樂 孫興鑫

側孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)是一種可產芽孢的兼性厭氧細菌,具有廣譜抑菌活性[1],可產生抗菌肽、蛋白酶、幾丁質酶、芽孢菌胺、肽類抗生素、聚酮化合物等物質[2],在植物抗逆促生[3]、降解重金屬[4]、改善根際微生態環境[5]和抑制食源性致病菌[6]等方面效果顯著,具有較高的應用價值。MTT商品名為噻唑藍,其作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈,可以形成藍紫色結晶甲臜,使用二甲基亞砜溶解后,測定溶液吸光值可以間接反映活細胞數量。有研究[7-8]表明,在107～109CFU/mL細胞濃度范圍內,吸光值與活細胞數成正比。利用MTT比色法檢測細胞活性靈敏度高、成本低廉、操作簡便,主要用于藥物對體外培養細胞的毒性測定及細胞活性的測定[9-10]。菌株傳統優化方法主要為線性回歸分析和正交試驗,其回歸精度低,不連貫,而響應面法可以彌補以上不足[11-12],具有周期短、精度高的優點,被廣泛應用于食品、生物、化工等領域。

目前,微生物培養以活菌數為測定指標的研究多采用比濁法,利用分光光度計測定菌液吸光值,然后通過標準曲線計算得出[13]。這種方法雖然快速簡便,但是無法區分細菌是否存活,結論有一定的誤差。而利用MTT比色法測定微生物活菌數并進行發酵條件優化的研究尚未見報道。研究擬以側孢短芽孢桿菌活菌數為研究對象,建立MTT比色法測定發酵液活菌數的標準曲線,通過響應面法對培養基成分和發酵條件進行優化,以期為微生物活菌制劑發酵工藝優化及規模生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

側孢短芽孢桿菌HA-2:CGMCC NO. 24130,河南科技大學農學院特色生物資源開發與利用實驗室;

瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨、硝酸銨、氯化鈣、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、噻唑藍、二甲基亞砜、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

基礎培養基:10 g/L胰蛋白胨,5 g/L酵母粉,10 g/L NaCl,初始pH 7.0;按2%接種量接種至裝有30 mL基礎培養基的三角瓶中,9層紗布封口,搖床轉速160 r/min,30 ℃培養18 h;

MTT溶液:配制pH 7.2、0.2 mol/mL的PBS緩沖液,121 ℃滅菌15 min待用;稱取0.5 g MTT用PBS緩沖液定容至100 mL,121 ℃滅菌15 min,現配現用,-4 ℃避光保存。

1.2 儀器與設備

酶標儀:Infinite E Plex型,瑞士Tecan公司;

高速冷凍離心機:5810R型,德國Eppendorf公司;

高壓滅菌鍋:SX-700型,日本TOMY公司;

潔凈工作臺:SW-CJ-1BU型,蘇州安泰空氣技術有限公司;

恒溫培養振蕩器:ZWYR-D2403型,上海智城分析儀器制造有限公司;

生化培養箱:TPH-160S型,寧波萊福科技有限公司;

pH計:PP60型,德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MTT比色法及與平板計數法線性關系的確定

將5 mL側孢短芽孢桿菌菌液加入35 mL生理鹽水中,4 ℃、3 500 r/min離心10 min,去除上清液。重復此清洗過程一次后,將離心所得菌泥復溶于5 mL生理鹽水中,制成菌懸液。取100 μL菌懸液于96孔板中,每個樣品重復6次,每孔加入20 μL MTT溶液靜置培養5 h,吸棄上清液,每孔加入150 μL二甲基亞砜,低速振蕩10 min,測定570 nm處菌液的吸光值[14]。

分別制備菌數為1×106,5×106,1×107,5×107,1×108,5×108,1×109CFU/mL的側孢短芽孢桿菌菌懸液10 mL于試管中。每支試管搖勻后平均分為A和B兩管。A管采用MTT比色法測定菌液的吸光值,將其作為線性擬合方程中的自變量,B管稀釋后涂布于基礎培養基瓊脂平板,統計活菌數,將其作為線性擬合方程中的因變量,進而建立MTT比色法與平板計數法的相關回歸方程。

1.3.2 單因素試驗 從基礎培養基成分及發酵條件出發,利用MTT比色法測定各單因素試驗發酵液吸光值[15]。分別考察碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖)、氮源(硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨)和無機鹽(氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀)對側孢短芽孢桿菌活菌數的影響。在最佳碳源、氮源及無機鹽的基礎上,分別研究碳源添加量(0～18.0 g/L)、氮源添加量(0～16.0 g/L)和無機鹽添加量(0～0.33 g/L),確定最佳培養基成分及其添加量。分別考察初始pH(3.5～10.5)、發酵溫度(24～39 ℃)、接種量(1.0%～8.0%)和磷酸二氫鉀添加量(0.5～7.5 g/L)對側孢短芽孢桿菌活菌數的影響,確定最佳發酵條件。

1.3.3 響應面優化

(1) Plackett-Burman試驗:選取影響側孢短芽孢桿菌活菌數的7因素為自變量,發酵液中活菌數為響應值,選用N=12的Plackett-Burman設計。各因素選取高(+1)和低(-1)兩個水平,篩選顯著影響因子。

(2) 最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗:通過Plackett-Burman試驗結果中多個顯著影響因子的系數值確定步長及方向,其因素系數值為正值選取高水平,負值選取低水平,以活菌數結果的最大值作為Box-Behnken試驗起始中心點。以Plackett-Burman試驗篩選出的顯著因子作為自變量,發酵液中側孢短芽孢桿菌活菌數為響應值,設計多因素多水平的響應面試驗,建立多元二次回歸數學方程擬合自變量與響應值之間的函數關系,獲得側孢短芽孢桿菌活菌數的最佳發酵參數。

1.3.4 驗證實驗 通過響應面試驗獲得的理論最佳發酵條件培養18 h進行驗證,得到的側孢短芽孢桿菌活菌數平均值與理論最大值進行比較,驗證模型的可靠性。

1.4 數據分析

使用IBM SPSS 22.0軟件進行顯著性分析和方差分析,采用Design-Expert 10軟件進行響應面分析,采用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 MTT比色法與平板計數法的線性關系

由圖1可知,側孢短芽孢桿菌菌懸液濃度與活菌數的線性回歸擬合方程為y=3.113 5x-0.128 8,相關系數為0.999 7,說明MTT比色法與平板計數法結果具有非常顯著和強的線性相關性,能夠準確、快速反映側孢短芽孢桿菌的活菌數,同時表明MTT比色法具有較好的實用性和可行性,可用于后續側孢短芽孢桿菌活菌數的測定,與高瓊[16]的研究結果相似。

圖1 MTT比色法與平板計數法的線性關系

2.2 單因素試驗

2.2.1 碳源 由圖2可知,以麥芽糖為碳源時,側孢短芽孢桿菌活菌數顯著高于其他碳源的(P<0.05)。當麥芽糖添加量為0～10.0 g/L時,活菌數隨麥芽糖添加量的增加逐步增加,當麥芽糖添加量為10.0～18.0 g/L時,側孢短芽孢桿菌活菌數逐漸下降,可能與麥芽糖呈微弱酸性有關,過多的麥芽糖會導致發酵液pH降低,不利于微生物生長。這與吳麗媛[17]的結果一致,因此選擇麥芽糖最佳添加量為10.0 g/L。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 氮源 由圖3可知,蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨和硝酸銨可以促進側孢短芽孢桿菌快速繁殖。以蛋白胨為氮源時,活菌數達最大值3.72×108CFU/mL。隨著蛋白胨添加量的升高,側孢短芽孢桿菌活菌數緩慢上升,當添加量為8.0～10.0 g/L時活菌數最大,但無顯著性差異,隨后活菌數開始下降,與陳丹霞等[18]的結果相似。這可能是蛋白胨為微生物提供氮源、碳源、維生素、生長因子等營養物質,可以促進側孢短芽孢桿菌的生長繁殖。綜上,選擇8.0 g/L為最佳蛋白胨添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 無機鹽 由圖4可知,氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂和氯化鎂可促進側孢短芽孢桿菌的生長繁殖,其中氯化鈣的促進作用最為顯著,較氯化鎂提升了76.88%(P<0.05)。隨著氯化鈣添加量的增加,側孢短芽孢桿菌活菌數顯著增加。當氯化鈣添加量為0.17 g/L時,其對側孢短芽孢桿菌活菌數的促進效果最佳,與李茂琳等[19]的研究結果一致。其原因可能與Ca2+的存在改變側孢短芽孢桿菌的細胞膜通透性,調節細胞內部物質交換、酸堿度和滲透壓有關。因此,選擇0.17 g/L氯化鈣為最佳無機鹽添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 發酵溫度 由圖5可知,當發酵溫度為24～34 ℃時,側孢短芽孢桿菌活菌數逐漸上升,與側孢短芽孢桿菌在低溫條件下菌株生長受到抑制有關。當發酵溫度為34～39 ℃時,側孢短芽孢桿菌活菌數逐漸下降,可能是由于側孢短芽孢桿菌胞內熱敏性酶活性降低,導致代謝受阻。范海延等[20]發現側孢短芽孢桿菌的最佳培養溫度為30～35 ℃。因此,選擇最佳發酵溫度為34.5 ℃。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.5 接種量 由圖6可知,當接種量為1.0%～6.0%時,側孢短芽孢桿菌活菌數隨接種量的提高而增加,當接種量為6.0%時,側孢短芽孢桿菌活菌數最大可達3.73×108CFU/mL。當接種量>6.0%時,發酵液中初始菌體密度偏高,營養消耗過快,活菌數隨接種量的增加而減少,與楊旭等[21]的研究結果一致。因此,選擇6.0%為最佳接種量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.6 初始pH 由圖7可知,升高初始pH可促進側孢短芽孢桿菌活菌數增加,當pH為7.5時,側孢短芽孢桿菌活菌數最大。而在偏堿性(pH 9.5～10.5)和偏酸性(pH 3.5～4.5)條件下,側孢短芽孢桿菌活菌數的生長繁殖均受到抑制。劉蒲臨等[22]發現側孢短芽孢桿菌的最佳pH為6.0～8.0。因此,選擇最佳發酵初始pH為7.5。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.7 磷酸二氫鉀 由圖8可知,當磷酸二氫鉀添加量為0～3.5 g/L時,側孢短芽孢桿菌活菌數逐漸增加;當添加量為3.5 g/L時,側孢短芽孢桿菌活菌數達最大值(2.27×108CFU/mL),較優化前提高了12.38%(P<0.05)。當添加量>3.5 g/L時,側孢短芽孢桿菌活菌數減少。磷酸二氫鉀作為緩沖物質,在微生物發酵過程中對發酵液pH起緩沖作用,利于側孢短芽孢桿菌的生長繁殖,與卜雯麗等[23]的結果相同,其最佳添加量不同可能與不同菌株因其自身特性對發酵培養基成分及發酵條件具有一定的選擇性有關。因此,選擇3.5 g/L為磷酸二氫鉀最佳添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應面優化

2.3.1 Plackett-Burman試驗 根據微生物生長所需營養成分的基本特點,結合前期單因素試驗,分別選取麥芽糖、蛋白胨、氯化鈣、磷酸二氫鉀添加量及發酵條件中發酵溫度、接種量和初始pH作為試驗因素。各因素設2個水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平

表2 Plackett-Burman試驗設計及結果

由表3可知,X1、X3、X6和X7是構建模型的主要影響因素(P<0.05),因此選擇X1、X3、X6和X7進一步進行優化試驗。

表3 Plackett-Burman試驗顯著性分析?

2.3.2 爬坡試驗 為了逼近X1、X3、X6和X7的最大響應區域,根據表3設計爬坡試驗方案,試驗結果見表4所示。在試驗3條件下,側孢短芽孢桿菌活菌數最高為8.13×108CFU/mL,因此選擇試驗3條件作為試驗中心點。

表4 爬坡試驗結果

2.3.3 Box-Behnken試驗 為確定X1、X3、X6和X7的交互作用,進行四因素三水平響應面試驗,試驗因素水平見表5,試驗設計及結果見表6。

表5 Box-Behnken試驗因素水平

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

采用Design-Expert 10軟件進行響應面回歸過程數據分析,建立二次響應面回歸模型,得到二次多項式回歸方程:

(1)

表7 響應面結果的方差分析?

2.4 響應面結果分析

由圖9可知,氯化鈣與磷酸二氫鉀之間交互作用較其他交互作用最弱。當麥芽糖分別與氯化鈣、初始pH及磷酸二氫鉀交互作用,隨著氯化鈣添加量、初始pH及磷酸二氫鉀添加量的變化,麥芽糖的最佳添加量為9 g/L左右,氯化鈣添加量、初始pH及磷酸二氫鉀添加量分別為0.11～0.16,7.3～7.7,3.2～3.9 g/L;當氯化鈣與初始pH交互作用時,氯化鈣添加量與初始pH對活菌數影響成反比;當初始pH與磷酸二氫鉀交互作用時,活菌數極值點出現在初始pH為7.3～7.8,磷酸二氫鉀添加量為3.5 g/L或磷酸二氫鉀添加量為3.2～3.9 g/L,初始pH為7.5的范圍內。由表7中F值可知,各因素對側孢短芽孢桿菌活菌數的影響強弱為X1>X3>X7>X6,兩因素間除X3X7外,均對活菌數的影響顯著,兩因素間的正負效應大小依次為X3X6、X1X6、X1X3、X6X7、X1X7、X3X7。

圖9 各因素交互作用的響應面圖

2.5 驗證實驗

使用Design-Expert 10軟件分析得到各顯著因子的最佳組合為麥芽糖添加量8.75 g/L、氯化鈣添加量0.17 g/L、初始pH 7.07、磷酸二氫鉀添加量3.73 g/L,此條件下模型預測側孢短芽孢桿菌活菌數最高為8.25×108CFU/mL。在此基礎上重復3次試驗,測得側孢短芽孢桿菌活菌數為(8.12×108±0.64) CFU/mL,為預測值的98.42%,表明該模型能夠很好地預測實際活菌數。

3 結論

以側孢短芽孢桿菌活菌數為研究對象,通過MTT比色法與平板計數法測定建立了相關回歸方程。結果表明,側孢短芽孢桿菌菌懸液濃度與活菌數之間具有良好線性關系(R2>0.999),可用于側孢短芽孢桿菌活菌數的測定。側孢短芽孢桿菌培養基成分及發酵條件的最佳組合為麥芽糖添加量8.75 g/L、氯化鈣添加量0.17 g/L、初始pH 7.07、磷酸二氫鉀添加量3.73 g/L,優化后發酵液中活菌數為8.12×108CFU/mL,較優化前提高了3.02倍。后續將對側孢短芽孢桿菌產抗菌肽、蛋白酶、幾丁質酶等方面開展研究。