茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的綠色檢測分析

李貝貝 汪 薇 江 豐 王會霞 陳 鋰

草甘膦(glyphosate,Gly)是一種廣譜、滅生性、氨基酸類除草劑,對多年生雜草非常有效,是目前使用量最大的除草劑之一[1-2],被廣泛用于茶園、果園等。若不按照規范使用會造成草甘膦殘留,長期食用含草甘膦的茶葉會增加患非霍奇金淋巴瘤癌癥的風險[3]。研究[4]表明,植物會代謝草甘膦產生氨甲基膦酸(amino methyl phosphoric acid, AMPA),作為草甘膦的代謝標志物,AMPA對水生生物和哺乳動物具有長期的毒性作用,且具有蓄積性。GB 2763—2021規定草甘膦在茶葉中的最大殘留限量為1 mg/kg,茶葉中的草甘膦不符合食品安全國家標準的情況時有發生[5],影響了中國茶葉產業的發展。

草甘膦為極性離子型農藥,溶于水而不溶于有機溶劑[6],與茶葉中的有機物具有很強的結合能力,對其殘留量分析的難度較大[7]。常用的檢測方法有免疫法、毛細管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜—氮磷檢測法、氣相/液相色譜—質譜聯用法[7-9]和高效液相色譜—高分辨質譜法[10-11]等。采用氣相/液相色譜—質譜聯用法檢測均需衍生化,操作復雜、時間長[1,12],且由于結構中存在氨基和磷酸基團,草甘膦與AMPA在流動相中容易形成內鹽,導致在普通反相色譜柱中的保留能力差。親水作用色譜柱(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)雖然可以改進保留能力,但需要平衡的時間長,重復性也較差,且均需要使用大量的有機溶劑,易造成環境污染。綠色分析檢測技術是以無污染或少污染理念為核心內容,彌補了傳統食品檢驗技術有機溶劑消耗大等的不足,可最大限度減少或消除分析過程中有害物的產生,將環境污染降到最低[13]。同時,草甘膦與AMPA在水溶液中易形成離子化合物,因此可以利用離子交換柱分離草甘膦殘留,經抑制器轉換成電導值高的離子型化合物[14-15],不需要衍生,對于這類親水性農藥殘留的測定有特殊的優勢[16]。離子色譜的流動相多為NaOH、KOH水溶液,有機試劑使用量小,且抑制反應產物為水[17-18],符合綠色分析化學要求[17-19]。

目前,離子色譜法主要應用于食品中離子型化合物的檢測,如測定現煮咖啡中氯酸鹽[20]以及水果和蔬菜中高極性陰離子農藥的多殘留等[16,21],且多以水質等基質干擾相對較小的樣品分析為主[22-24],主要是由于基質復雜,干擾因素較多,以致在離子色譜檢測器端雜峰較多,檢出限難以得到保證[25],而茶葉的基質效應更是儀器分析的難點[26-27]。茶葉中大量的色素、氨基酸等物質必然會嚴重干擾離子色譜測定草甘膦和AMPA的信號,限制離子色譜在茶葉分析中的應用。將離子色譜與串聯質譜聯用(ion chromatography tandem mass spectrometry, IC-MS/MS)可提高對于茶葉等復雜基質分析的抗干擾能力和靈敏度,但還需要針對茶葉樣品基質特征和草甘膦等的理化性質,優化與IC-MS/MS分析配套的前處理方法,探究IC-MS/MS在茶葉中草甘膦及AMPA檢測的適用性。QuEChERS是一種基質固相分散的快速樣品處理技術,通過吸附劑與樣品中的雜質相互作用,如各種糖類、有機酸、色素等,從而使基質復雜的樣品能實現快速、高效和經濟的分離提取,可針對茶葉基質干擾嚴重的特點進行改進優化。

研究擬利用QuEChERS前處理技術,結合IC-MS/MS法同時檢測茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸,通過優化儀器參數、改進前處理方法,建立無需衍生化的茶葉中草甘膦和AMPA檢測方法,以期提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草甘膦、氨甲基磷酸標準品:純度99.0%,上海安譜實驗科技股份有限公司;

內標13C2,15N-草甘膦:純度97.1%,上海安譜實驗科技股份有限公司;

氫氧化鈉:優級純,國藥集團化學試劑有限公司;

試驗用水為超純水;

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、石墨化炭黑(GCB):美國Supelco公司;

茶葉:市售。

1.2 儀器與設備

三重四極桿質譜儀:TSQ Altis型,美國賽默飛世爾科技公司;

高壓離子色譜儀:Thermo ICS-5000型,配EGC淋洗液發生器、輔助泵、AS-AP 自動進樣器、ASRS300 2 mm陰離子抑制器、電導檢測器,美國賽默飛世爾科技公司;

離子色譜柱:IonPac AS11-HC型,4 μm×2 mm×250 mm,美國賽默飛世爾科技公司;

離心機:Centrifuge 5810型,艾本德中國有限公司;

渦旋儀:IKA MS3 digital型,德國IKA公司;

電子天平:ME 204型,梅特勒—托利多儀器上海有限公司;

去離子水發生器:Milli-Q型,美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理方法

(1) 標準溶液配制:分別取草甘膦、氨甲基膦酸和內標13C2,15N-草甘膦標準品,用超純水溶解并配制成質量濃度為1 μg/mL的標準儲備液。用超純水梯度稀釋成質量濃度為5,10,20,50,100,150,200 ng/mL的標準溶液工作曲線。

(2) 樣品處理:將茶葉樣品粉碎過網篩,稱取5 g 樣品,加入同位素內標工作液,用20 mmol/L NaOH水溶液定容,渦旋1 min,超聲提取20 min,4 000 r/min 離心5 min。取2 mL 上清液加入凈化劑(150 mg PSA、15 mg C18、15 mg GCB),渦旋1 min,過0.22 μm水相濾膜,IC-MS/MS檢測。

1.3.2 離子色譜條件 采用AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)離子色譜柱;淋洗液濃度為35 mmol/L NaOH 溶液,等度淋洗,流速為0.35 mL/min;AERS 2 mm抑制電導檢測器,抑制電流為70 mA,抑制器再生水流速1 mL/min。柱溫25 ℃,進樣量600 μL;初始30 s后,通過六通閥將流量注入離子源[16]。

1.3.3 質譜條件 離子源為加熱ESI源,質譜掃描方式為負離子多反應監測模式(MRM),噴霧電壓2 500 V,離子傳輸管溫度350 ℃,霧化器溫度450 ℃,其他質譜參數見表1。

表1 MRM參數?

1.4 方法學考察

用峰面積對濃度進行線性回歸,得到線性回歸方程和相關系數[28]。將陰性茶葉基質提取液逐級稀釋獲得草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限(LOD,S/N≥3)和定量限(LOQ,S/N≥10)。取茶葉樣品陰性基質,分別添加1,2,10倍LOQ的草甘膦和氨甲基膦酸標準品溶液,每個加標水平平行6次,計算平均加標回收率和相對標準偏差(RSD)。

1.5 數據采集和分析

所有試驗重復3次,分別通過Xcalibur、Tracefinder進行質譜數據的采集和草甘膦及氨甲基膦酸的定性定量分析。應用SAS 9.0、GraphPad Prism 5和Design-Expert 11軟件進行數據統計和繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的選擇

草甘膦和氨甲基膦酸在負離子模式下的質譜信號響應值高于正離子模式,因此選擇負離子模式進行分析。分別對兩種化合物及其穩定同位素內標的質譜條件包括錐孔電壓、碰撞能量等進行優化,優化后的質譜參數見表1。草甘膦和氨甲基膦酸的質譜特征碎片離子見圖1。

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸的質譜特征碎片離子

2.2 離子色譜條件優化

比較兩種陰離子分析柱IonPac AS16-9 μm(4 mm×250 mm)和AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)對草甘膦和氨甲基膦酸的分離效果。結果表明,草甘膦在兩種陰離子柱中均呈良好的峰型,氨甲基膦酸在IonPac AS16中峰展寬,有明顯的拖尾,在AS11-HC中具有較好的保留,峰型良好。從草甘膦和氨甲基膦酸的結構來看,草甘膦中額外存在的羧酸基團使其在離子色譜柱上的保留能力比氨甲基膦酸的大。因此,選擇陰離子柱AS11-HC-4 μm(2 mm×250 mm)。

圖2 草甘膦和氨甲基膦酸的總離子流圖和提取離子色譜圖

2.3 提取條件的選擇

草甘膦水溶性極強,不溶于有機溶劑。目前用于草甘膦提取的溶劑主要有水、堿溶液、酸溶液等[1],SN/T 1923—2007等現行標準中多采用超純水作為提取溶劑。但由于離子色譜對樣品提取液的離子強度較為敏感,進而影響后續檢測結果的準確度,因此需要探索適合IC-MS/MS茶葉中草甘膦和AMPA的提取方法。分別選擇超純水、NaOH水溶液(10,20,30 mmol/L)作為提取溶劑,同時比較振蕩提取和超聲波輔助提取兩種方式,考察不同提取溶劑和提取方式對草甘膦和AMPA提取效率的影響,結果見圖3。采用堿性溶液作為提取溶劑,有利于將被茶葉有機質結合的草甘膦和AMPA變成離子形態,提高回收率。隨著NaOH濃度的提高,草甘膦和AMPA的回收率隨之提高,當采用20 mmol/L的NaOH溶液提取時,二者的回收率達最大值,繼續增大NaOH濃度,草甘膦的回收率趨于平穩,AMPA的回收率有所降低。與振蕩提取相比,超聲輔助提取下茶葉中草甘膦和AMPA的回收率升高,可能與草甘膦為內吸性農藥有關[1]。因此,采用20 mmol/L的NaOH水溶液超聲輔助提取的方法。

圖3 提取條件對茶葉基質中草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影響

2.4 凈化方式的選擇

茶葉中豐富的色素、多糖、茶多酚等內源性物質對草甘膦和氨甲基磷酸IC-MS/MS檢測結果影響較大,茶葉基質的有效凈化是排除假陽性結果的關鍵[9]。目前對于草甘膦、氨甲基膦酸凈化多使用固相萃取柱,SN/T 1923—2007等前處理均采用陽離子交換柱(CAX)凈化,使用CAX小柱時不能采用真空泵抽氣,必須采用常壓過柱方式,不得使小柱干涸,需要多次調節樣品提取液的pH值,且固相萃取柱價格較高[9]。試驗采用吸附劑(PSA、C18和GCB)對茶葉提取液進行凈化,在前期單因素分析基礎上[7],根據Box-Behnken中心組合設計原理,以目標物回收率為響應值設計響應面試驗,對凈化劑用量進行優化,考察不同凈化劑對茶葉基質凈化效果的影響,結果如圖4所示。

圖4 吸附劑凈化對茶葉基質中草甘膦和氨甲基磷酸回收率的影響

由圖4可知,PSA和GCB用量的等高線為橢圓形,交互作用顯著,C18用量與二者的交互作用均不明顯。PSA可有效去除樣品中的糖、有機酸、脂肪酸等極性化合物,而草甘膦和氨甲基膦酸也屬于強極性化合物,過多的PSA會對二者產生吸附;C18可吸附脂肪等非極性物質;GCB可吸附色素、甾醇等[7]。綜合樣品的凈化效果及目標化合物的回收率,最終確定加入150 mg PSA、15 mg GCB和15 mg C18對茶葉基質進行凈化。

2.5 基質效應評價

采用茶葉基質標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率比值評價基質效應(ME)[32],ME>0為基質增強效應,ME<0為基質抑制效應,0≤|ME|≤20%為基質對待測物的信號干擾程度較低,|ME|≥50%為基質效應干擾強烈[26,32]。如圖5所示,未凈化時茶葉基質中草甘膦和氨甲基膦酸表現為強基質抑制效應,尤其是氨甲基膦酸,可能是由于茶葉中氨基酸、色素或類似結構的干擾所致[8]。凈化后基質效應顯著降低,說明凈化是必要且有效的,茶葉中草甘膦的ME<15%,基質干擾較低,氨甲基膦酸的ME為24%～29%,存在中等程度的基質效應,可采用矩陣匹配曲線來減少茶葉樣品中復雜成分對定量過程的不利影響。

圖5 草甘膦及氨甲基膦酸在4種茶葉中的基質效應

2.6 方法學評價

2.6.1 線性范圍、檢出限與定量限 由表2可知,草甘膦和AMPA在5～200 ng/mL質量濃度范圍內有良好的線性關系,其相關系數均>0.998。草甘膦和AMPA的檢出限均為0.05 mg/kg,定量限為0.10 mg/kg。茶葉中草甘膦的最大殘留限量為1 mg/kg,試驗方法靈敏度可以滿足GB 2763—2021的要求。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸的線性范圍、相關系數、檢出限和定量限

2.6.2 特異性 如圖6所示,茶葉基質成分未對草甘膦及氨甲基膦酸檢測造成干擾,無雜峰干擾,方法的特異性良好。

圖6 方法的特異性

2.6.3 回收率與精密度 為考察試驗方法在不同茶葉類型中的適用性,按制茶工藝選取空白綠茶、紅茶、白茶和普洱茶樣本,進行3個水平的加標回收試驗,方法的回收率及精密度見表3。由表3可知,草甘膦和氨甲基膦酸的平均加標回收率分別為61.2%～104.9%,61.5%～83.2%,RSDs均<20%,符合GB/T 27404—2008 的要求。

表3 不同茶葉基質中草甘膦和氨甲基膦酸的回收率和精密度

2.7 實際樣品分析

采用試驗方法對市售綠茶(23份)、紅茶(3份)、白茶(2份)、普洱茶(2份)共30批次茶葉樣本進行測定,其中1批次綠茶樣品中檢出草甘膦殘留,其含量為0.074 mg/kg。試驗方法操作簡便易行,無需衍生化,可以用于實際樣品的檢測。

3 結論

研究建立一種離子色譜串聯質譜(IC-MS/MS)測定茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的方法。該方法前處理簡單,樣品經簡單水提取和稀釋后基于IC-MS/MS進行分析,無需衍生化或預濃縮。針對茶葉基質干擾問題,利用分散萃取凈化代替固相萃取小柱,優化凈化劑配比,同時結合同位素內標及基質標曲對數據進行校準后,將茶葉基質效應降低至可接受范圍,各項方法學指標令人滿意。試驗方法有機溶劑使用量小,無需衍生,符合綠色化學的理念,結果穩定準確,可操作性強,且方法學評價結果滿足茶葉中草甘膦及其代謝物的日常檢測要求,具有實際應用價值。后續可利用毛細管離子色譜技術對試驗方法進行持續改進。