濱海白首烏發(fā)酵片工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

卜 京 石 云 林 燕 覃媛媛 洪 鍵

白首烏系蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(Cynanchumauriculatum)、隔山牛皮消(Cynanchumwilfordii)及戟葉牛皮消(Cynanchumbungei)等植物的塊根[1-2]。濱海白首烏屬于耳葉牛皮消的塊根[3-4],中國有95%的耳葉牛皮消產(chǎn)自江蘇濱海,“濱海白首烏”于2010年獲得國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)[5-7]。作為一種傳統(tǒng)的藥食同源地產(chǎn)植物,濱海白首烏至今已使用千余年,2017年被國家衛(wèi)計(jì)委列入普通食品名錄中[8]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究[9-12]證實(shí),濱海白首烏富含多種活性物質(zhì),主要包括C21甾體類化合物、多糖類、二苯酮和磷脂類,具有抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)肝臟以及增強(qiáng)免疫等多種藥理功效。

發(fā)酵食品是飲食中重要的組成部分。發(fā)酵片類型較多,目前已有火棘果咀嚼片[13],麩皮紅棗乳酸發(fā)酵片[14]和木瓜發(fā)酵片[15]等。發(fā)酵片在制作過程中通常需要額外添加碳源以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌種活性維持[16]和發(fā)酵產(chǎn)品口感調(diào)節(jié)。而以火棘果咀嚼片、麩皮紅棗乳酸發(fā)酵片為代表的發(fā)酵片制作工藝是將原料粉碎制漿,以醪液形式進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵,經(jīng)干燥處理后添加輔料最后壓制成片;后期還需設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化原輔料配比,以校正輔料添加對(duì)原料風(fēng)味口感產(chǎn)生的影響,工序相對(duì)繁瑣,營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分會(huì)流失。

研究先用α-淀粉酶對(duì)白首烏片進(jìn)行糖化,減少白首烏片表面淀粉顆粒對(duì)后期發(fā)酵片口感形成的影響,同時(shí)以糖化淀粉產(chǎn)生的還原糖作為葡萄酒酵母和副干酪乳桿菌發(fā)酵碳源,避免在發(fā)酵過程中多種碳源或者外來碳源的加入對(duì)白首烏片最終口感和風(fēng)味造成影響。根據(jù)所選菌種兼性厭氧特性,以糖化后的白首烏片作為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行液態(tài)表面發(fā)酵,改善白首烏片的口感與風(fēng)味,并且發(fā)酵結(jié)束后直接收獲成片,不需要添加任何輔料進(jìn)行制片,極大地減少工作程序,節(jié)省制作成本。

因此,研究擬以濱海白首烏完整切片為原料,采用副干酪乳桿菌與葡萄酒酵母的混合菌種對(duì)白首烏片進(jìn)行液態(tài)表面發(fā)酵。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化濱海白首烏發(fā)酵片工藝參數(shù),通過總抗氧化能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+)自由基清除能力評(píng)價(jià)濱海白首烏發(fā)酵片的抗氧化活性,并比較發(fā)酵前后發(fā)酵片中呈味氨基酸含量變化,以期為濱海白首烏產(chǎn)品的深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濱海白首烏:鹽城市濱?？h白首烏生態(tài)種植基地;

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei):前期試驗(yàn)從蒙牛優(yōu)益C中篩選得到;

葡萄酒酵母(Saccharomycecerevisiae):安琪酵母股份有限公司;

α-淀粉酶:酶活力1 000 U/g,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;

總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒:南京建成生物工程研究所;

DPPH:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,上海源葉生物科技有限公司;

ABTS+:質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%,福州飛凈生物科技有限公司;

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

中藥材切片機(jī):AK-150C型,奧力中藥機(jī)械有限公司;

電子天平:AR124CN型,奧豪斯儀器有限公司;

蒸鍋:ZHG-2801T型,九陽股份有限公司;

超凈工作臺(tái):SW-CJ-2FD型,江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司;

高壓蒸汽滅菌鍋:YXQ-LS-50A型,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;

數(shù)顯生化培養(yǎng)箱:SPX-150型,常州華冠儀器制造有限公司;

pH計(jì):FiveEasy Plus型,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;

真空冷凍干燥機(jī):SCIENTZ-10N型,寧波新芝生物科技股份有限公司;

酶標(biāo)分析儀:DNM-9602型,北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濱海白首烏發(fā)酵片工藝流程

操作要點(diǎn):

(1) 白首烏片預(yù)處理:一年生新鮮濱海白首烏清洗去皮切成厚度2 mm,直徑約1 cm薄片;100 ℃蒸20 min,糊化。

(2) 糖化:每個(gè)發(fā)酵瓶中裝入20 g預(yù)處理后的白首烏片,單層、平鋪于發(fā)酵瓶底;加入20 g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%的α-淀粉酶溶液,65 ℃水浴3 h。

(3) 滅菌:糖化后的白首烏片置于高壓蒸汽滅菌鍋中,90 ℃滅菌20 min[17]。

(4) 接種:調(diào)整發(fā)酵菌種菌液的菌數(shù)為1×109CFU/mL,以體積比1∶5[18]接種葡萄酒酵母與副干酪乳桿菌。

(5) 發(fā)酵:接種完后將發(fā)酵瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中,在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比、發(fā)酵溫度、混合菌液接種量和發(fā)酵時(shí)間下進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

(1) 料液比(m白首烏片∶m無菌水):固定混合菌液接種量7%,發(fā)酵溫度34 ℃,發(fā)酵時(shí)間36 h,考察料液比(m白首烏片∶m無菌水分別為1∶1,1∶1.5,1∶2,1∶2.5,1∶3,1∶3.5)對(duì)感官評(píng)分和總酸含量的影響。

(2) 發(fā)酵溫度:固定料液比(m白首烏片∶m無菌水)1∶1、混合菌液接種量7%,發(fā)酵時(shí)間36 h,考察發(fā)酵溫度(22,25,28,31,34,37 ℃)對(duì)感官評(píng)分和總酸含量的影響。

(3) 混合菌液接種量:固定料液比(m白首烏片∶m無菌水)1∶1,發(fā)酵溫度34 ℃,發(fā)酵時(shí)間36 h,考察混合菌液接種量(3%,5%,7%,9%,11%,13%)對(duì)感官評(píng)分和總酸含量的影響。

(4) 發(fā)酵時(shí)間:固定料液比(m白首烏片∶m無菌水)1∶1,混合菌液接種量7%,發(fā)酵溫度34 ℃,考察發(fā)酵時(shí)間(0,6,12,18,24,30,36,42,48 h)對(duì)感官評(píng)分和總酸含量的影響。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

(1) 感官評(píng)分:根據(jù)產(chǎn)品的外觀、口感和風(fēng)味,邀請(qǐng)10名有一定相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的品評(píng)員,男女比例各半,按表1對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定[19-20]。

表1 感官評(píng)價(jià)表

(2) 總酸含量:按GB/T 12456—2021執(zhí)行。

(3) 總抗氧化能力(T-AOC):按試劑盒說明書執(zhí)行。

(4) DPPH自由基清除率:根據(jù)馮康等[21]的方法。

(5) ABTS+自由基清除率:根據(jù)孫正霄等[22]的方法。

(6) 氨基酸含量:按GB 5009.124—2016執(zhí)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2019、Design-Expert 8.0.6和SPSS 19.0軟件作圖和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1(a)可知,隨著料液比的增加,發(fā)酵片的感官評(píng)分和總酸含量均呈下降趨勢(shì)。當(dāng)料液比(m白首烏片∶m無菌水)>1∶1時(shí),發(fā)酵片浸泡在高比例的液體環(huán)境中易使片體結(jié)構(gòu)分裂,難以成型;同時(shí)發(fā)酵片中的總酸會(huì)較多地流入發(fā)酵液中,導(dǎo)致片中總酸含量降低。因此,選擇料液比(m白首烏片∶m無菌水)1∶1開展后續(xù)單因素試驗(yàn)。

圖1 各因素對(duì)濱海白首烏發(fā)酵片感官評(píng)分和總酸含量的影響

由圖1(b)可知,總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高而升高;感官評(píng)分隨發(fā)酵溫度的升高先升高后下降,當(dāng)發(fā)酵溫度為31 ℃時(shí),發(fā)酵片感官評(píng)分最高可達(dá)83分,此時(shí)總酸含量為0.612 g/100 g。從感官評(píng)分角度分析,當(dāng)發(fā)酵溫度>31 ℃時(shí),菌種處于適宜溫度區(qū)間,產(chǎn)酸積累較多,但溫度過高會(huì)影響發(fā)酵過程中香味成分[23],此時(shí)發(fā)酵片酸味和酒香味偏重,而白首烏本身特征風(fēng)味被掩蓋;當(dāng)發(fā)酵溫度<31 ℃時(shí),菌種活性受到影響[24],發(fā)酵不完全導(dǎo)致酸味不足,發(fā)酵片整體風(fēng)味不協(xié)調(diào),感官評(píng)分差異顯著(P<0.05)。因此,選擇發(fā)酵溫度28,31,34 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1(c)可知,隨著混合菌液接種量的增加,發(fā)酵片感官評(píng)分和總酸含量均呈先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)混合菌液接種量為9%時(shí),感官評(píng)分和總酸含量均達(dá)到最大值,分別為84分、0.732 g/100 g;當(dāng)混合菌液接種量<9%時(shí),菌種產(chǎn)酸能力較弱,發(fā)酵片發(fā)酵周期較長,酸味不足,口感風(fēng)味不佳;接種量為9%,11%和13%時(shí),總酸含量無顯著差異(P>0.05),可能是接種量過高營養(yǎng)物質(zhì)此時(shí)多消耗在菌體細(xì)胞生長繁殖上[25],而過高的接種量也會(huì)使菌體提前衰老而發(fā)生自溶,影響風(fēng)味[26]。因此,選擇混合菌液接種量7%,9%,11%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

由圖1(d)可知,發(fā)酵片感官評(píng)分和總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長先升高后下降,可能是發(fā)酵前期(0～24 h),營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富,菌種利用營養(yǎng)物質(zhì)速度快,產(chǎn)酸量大[27],總酸含量呈上升趨勢(shì),且隨著酸的積累,發(fā)酵片的風(fēng)味逐漸增強(qiáng),其感官評(píng)分也逐漸升高,24 h時(shí)發(fā)酵片感官評(píng)分最高可達(dá)86分,總酸含量可達(dá)0.726 g/100 g;而發(fā)酵后期(24～48 h),30 h時(shí)發(fā)酵片總酸含量相較于24 h時(shí)顯著下降(P<0.05),可能是發(fā)酵時(shí)間過長導(dǎo)致發(fā)酵片表面組織形態(tài)松散,總酸較多地流入發(fā)酵液中。30 h后發(fā)酵片總酸含量變化趨于平穩(wěn)(P>0.05),是因?yàn)榘l(fā)酵液達(dá)到一定酸度后,菌種的生長代謝受到抑制[28],同時(shí)發(fā)酵時(shí)間過長會(huì)使得發(fā)酵片變黏變軟,感官評(píng)分顯著下降(P<0.05)。因此,選擇發(fā)酵時(shí)間28,24,30 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇混合菌液接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間作為主要影響因素,以感官評(píng)分和總酸含量為響應(yīng)值,試驗(yàn)因素和水平見表2,Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

表3 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸分析,得到二次多項(xiàng)式回歸方程分別為:

Y1=91.26+0.19A-1.25B+2.85C-0.42AB+0.49AC-0.04BC-1.33A2-1.71B2-8.07C2,

(1)

Y2=0.73+0.015A+0.004 75B+0.039C+0.007 25AB+0.011AC+0.021BC-0.028A2-0.028B2-0.11C2。

(2)

圖2 感官評(píng)分的響應(yīng)面圖

表4 以感官評(píng)分為響應(yīng)值的回歸模型方差分析?

由表5可知,回歸模型P<0.000 1,失擬項(xiàng)P=0.168 7>0.05,極顯著;R2=0.998 2,說明模型擬合度高,試驗(yàn)誤差較小且可信度比較高。由F值可知,各因素對(duì)總酸含量(Y2)的影響大小順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間>混合菌液接種量>發(fā)酵溫度。由圖3可知,任意兩個(gè)因素間均存在交互作用,其中交互項(xiàng)AC、BC的響應(yīng)面最陡峭,對(duì)總酸含量(Y1)影響最顯著,與方差分析結(jié)果一致。

圖3 總酸含量的響應(yīng)面圖

表5 以總酸含量為響應(yīng)值的回歸模型方差分析?

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6優(yōu)化,濱海白首烏發(fā)酵片最佳工藝參數(shù)為混合菌液接種量9.67%,發(fā)酵溫度31.62 ℃,發(fā)酵時(shí)間25.10 h,此條件下濱海白首烏發(fā)酵片感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為91.77分,總酸含量預(yù)測(cè)值為0.735 g/100 g。以可操作性為前提,調(diào)整實(shí)際條件,在發(fā)酵溫度31 ℃,混合接種量9.6%,發(fā)酵時(shí)間25 h下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得濱海白首烏發(fā)酵片感官評(píng)分為89.33分,總酸含量為0.726 g/100 g,與預(yù)測(cè)值接近,說明該模型可用于濱海白首烏發(fā)酵片工藝優(yōu)化,具有實(shí)用價(jià)值。因此,濱海白首烏發(fā)酵片最佳工藝參數(shù)為料液比(m白首烏片∶m無菌水)1∶1,發(fā)酵溫度31 ℃,混合菌液接種量9.6%,發(fā)酵時(shí)間25 h。

2.3 抗氧化活性試驗(yàn)

由圖4可知,新鮮濱海白首烏完整切片和產(chǎn)品濱海白首烏發(fā)酵片的總抗氧化能力、DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力均隨醇提液質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng),呈正相關(guān)的量效關(guān)系。濱海白首烏發(fā)酵片的抗氧化活性均高于相同醇提液濃度下的新鮮濱海白首烏完整切片,可能與發(fā)酵過程中總黃酮含量和酚類物質(zhì)含量增加有關(guān)[30-31]。此外,發(fā)酵菌種的代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物[25],如總酸和生物堿類物質(zhì)也會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)品的抗氧化活性。當(dāng)醇提液質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),發(fā)酵前后的總抗氧化能力分別為1.72,2.05 U/mL,對(duì)DPPH自由基清除率分別為27.36%,32.18%,對(duì)ABTS+自由基清除率分別為39.73%,45.89%。

*為該濃度下濱海白首烏發(fā)酵片醇提液和新鮮白首烏片醇提液差異顯著(P<0.05)

2.4 氨基酸檢測(cè)結(jié)果

由表6可知,發(fā)酵前后白首烏片中共檢出16種氨基酸,氨基酸總量分別為6.16,6.06 g/100 g,可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中部分氨基酸被乳酸菌降解成風(fēng)味物質(zhì)[32]。參考Ardo[33]的分類方法,根據(jù)氨基酸滋味不同,可以將其分為鮮味、甜味、苦味和芳香味四類氨基酸。由圖5可知,發(fā)酵前后白首烏片中呈味氨基酸的組成發(fā)生變化,鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸含量下降,芳香味氨基酸含量上升了47.22%(P<0.05),一定程度上改善了白首烏片的風(fēng)味和口感。

*表示發(fā)酵前后氨基酸含量差異顯著(P<0.05)

表6 發(fā)酵前后氨基酸含量對(duì)比

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明,濱海白首烏發(fā)酵片的最佳工藝參數(shù)為料液比(m白首烏片∶m無菌水)1∶1,發(fā)酵溫度31 ℃,混合菌液接種量9.6%,發(fā)酵時(shí)間25 h,此條件下濱海白首烏發(fā)酵片感官評(píng)分為89.33分,總酸含量為0.726 g/100 g。濱海白首烏完整切片經(jīng)發(fā)酵后,表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性,其醇提液總抗氧化能力可達(dá)2.05 U/mL,對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基的最大清除率分別為32.18%,45.89%。發(fā)酵前后,白首烏片中芳香味氨基酸含量上升了47.22%,一定程度上改善了白首烏片原本草藥味重和口感苦澀的問題。后續(xù)將開展濱海白首烏發(fā)酵片中試生產(chǎn)工藝探究以及其他基于濱海白首烏活性物質(zhì)的產(chǎn)品開發(fā)。