LINC00894通過miR-205-5p/ZEB1軸對胃癌細胞增殖和轉移的影響

康偉彪,周理好,余昌俊,江 露,陳昌裕

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,全球每年新增胃癌病例達100萬,因胃癌死亡病例達78.40萬[1]。盡管目前治療手段很多,但早期診斷率不高,針對胃癌的機制研究仍是目前研究的熱點。長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,通常以疾病、組織或階段特異性的方式表達,參與多種生物學過程,并在癌癥的發生、發展中扮演重要角色[2-3]。課題組前期通過利用RT-qPCR技術對比胃癌及其配對癌旁組織中的數條lncRNA的表達差異,發現LINC00894在胃癌組織中的表達水平明顯上調。近些年,有研究[4-7]表明LINC00894在一些腫瘤中高表達、發揮促癌作用,也有研究[8-9]顯示LINC00894在腫瘤中扮演抑癌基因的角色。然而,目前關于LINC00894在胃癌中的研究較少。大量證據表明lncRNA可作為競爭性內源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),與miRNA相互作用從而吸附它們,降低它們對靶基因mRNA的調控效應[10]。因此,該研究通過細胞實驗結合生物信息學分析,探索LINC00894基因對人胃癌細胞增殖、轉移的影響,并驗證LINC00894、miR-205-5p、ZEB1在胃癌中的調控關系。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

1.1.1主要細胞 人胃癌細胞系(MGC-803、AGS、BGC-823、NCI-N87、HGC-27)及人正常胃細胞系(GES-1)取自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑 RPMI-1640、DMEM、Opti-MEM培養基和轉染試劑Lipofectamine 2000(貨號：11668-027)購于美國Invitrogen公司;血清購于美國Life Technology公司;總RNA提取試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司;LINC00894干擾質粒(LINC-KD1,LINC-KD2)、LINC00894過表達質粒(LINC-OE)、miR-205-5p模擬物(mimic)及其相應的陰性對照mimic control、miR-205-5p抑制物(inhibitor)及其相應的陰性對照inhibitor control、含miR-205-5p結合位點的野生型LINC00894熒光素酶報告質粒(LIN-WT)和miR-205-5p結合位點突變的突變型LINC00894熒光素酶報告質粒(LIN-MUT)、含有ZEB1基因3'UTR序列的野生型或突變型熒光素酶報告質粒(ZEB1-3U-WT,ZEB1-3U-MUT)均購于上海吉瑪公司;雙熒光素酶報告基因試劑盒和報告基因載體購于北京索萊寶科技有限公司;抗ZEB1抗體購于美國Abcam公司(貨號：ab124512)(稀釋度：1 ∶1 000);抗β-actin抗體購于美國Abcam公司(貨號：ab8227) (稀釋度：1 ∶1 000 );二抗購于美國Abcam公司(貨號：ab97051)(稀釋度：1 ∶6 000)。

1.1.3主要儀器 CO2培養箱(型號：NU-5810E)及生物安全柜(型號：NU-425-400S)均購于美國NUAIRE公司;倒置熒光顯微鏡(型號：DeltaVision)購于美國GE公司;微量核酸蛋白紫外分析儀(型號：Genove Nano)購于英國JENWAY公司;熒光定量PCR儀(型號：Step One Plus ABI)購于美國Thermo公司。

1.2 樣本收集所有樣本均收集于2011-2012年在安徽醫科大學第一附屬醫院行手術治療的胃癌患者術后標本,所有患者的納入標準均為：無其它特殊疾病;術前未接受任何放療、化學治療、免疫治療、靶向治療或其它特殊治療。所有胃癌患者的隨訪時間均超過5年,且所有納入本研究的患者均簽署了知情同意書。本研究經安徽醫科大學機構審查委員會審查及批準,并嚴格遵照《赫爾辛基宣言》。

1.3 細胞培養與轉染所有實驗細胞均使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM或RPMI-1640培養基,并置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。采用說明書推薦的操作步驟,使用Lipofectamine 2000,對呈對數生長期的BGC-823和AGS細胞進行轉染質粒,分為敲低組(LINC-KD1、LINC-KD2)、過表達組(LINC-OE)和對照組(Control),轉染48 h后,提取總RNA或總蛋白,通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測針對LINC00894的敲低和過表達效率,以確定LINC00894敲減或過表達細胞模型是否構建成功;通過Western blot實驗檢測LINC00894與ZEB1之間表達水平的關系。

1.4 RNA提取與RT-qPCR細胞總RNA的提取、RNA的逆轉錄及RT-qPCR的方法參課題組前期發表的文章[11]。

1.5 Western blot實驗胃癌細胞轉染質粒48 h后,使用PBS溶液清洗細胞3次,然后用含有蛋白酶抑制劑的裂解液對細胞進行裂解,使用干凈的細胞刮刮凈培養皿中的液體,收集后并離心,提取細胞中的總蛋白,并檢測總蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠后,取20 μl的蛋白樣品或Marker在SDS-PAGE膠中進行電泳分離,然后將蛋白轉膜至PVDF膜上,麗春紅染色后再次清洗PVDF膜,然后將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,根據說明書加入稀釋后的一抗(抗ZEB1抗體,1 ∶1 000;抗β-actin抗體,1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜,第2天使用PBST浸洗3次后,加入相應的二抗[山羊抗兔IgG H&L (HRP),1 ∶6 000],室溫下孵育60 min后取出PVDF膜,再次使用PBST浸洗3次,最后加入顯影液放在顯影儀中進行顯影并保存圖片。

1.6 CCK-8實驗胃癌細胞轉染質粒48 h后,使用胰酶消化細胞后進行細胞計數,以每孔2 000個細胞的密度于96孔板種板,每組設置3個復孔,分別于種板后的第1、2、3、4天進行數據收集,數據收集前,每孔加入CCK-8試劑10 μl,孵育120 min后,收集450 nm波長的光密度(optimal density, OD)值。

1.7 克隆形成實驗胃癌細胞轉染質粒48 h后,使用胰酶消化細胞后進行細胞計數,以每孔600個的密度于6孔板種板,每組設置3個復孔,每隔3 d更換1次培養基,連續培養2周,待克隆形成后終止培養,棄去舊的培養基,并使用PBS溶液清洗細胞,去除原有殘余培養基和細胞碎片等雜質,使用濃度為4%的多聚甲醛(1 000 μl/孔),固定20 min;棄去多聚甲醛后,使用0.1%的結晶紫溶液(1 000 μl/孔)染色1 h后,拍照并計數每組克隆形成數。

1.8 Transwell實驗

1.8.1遷移實驗 胃癌細胞轉染質粒48 h后,使用胰酶消化細胞后進行細胞計數,用無血清培養基稀釋細胞密度至5×105/ml,于Transwell 24孔板中加入600 μl完全培養基,向孔中安裝Transwell小室,然后向上室加入200 μl目的細胞懸液,每組設置3個復孔,放入培養箱培養24 h后,90%乙醇固定0.5 h,0.1%結晶紫染色5 min后,最后,使用顯微鏡拍照并計數遷移細胞數。

1.8.2侵襲實驗 于冰上預先配制基質膠工作混合液(基質膠 ∶無血清培養基=1 ∶8),吸取60 μl基質膠工作液于小室上層(小室放于Transwell 24孔板中),將24孔板放入細胞培養箱中超過2 h,按照相同的步驟將細胞懸液種植與小室上層,剩余步驟與遷移實驗相同。

1.9 雙熒光素酶報告實驗使用生物信息學在線數據庫starbase(https：//starbase.sysu.edu.cn)預測LINC00894靶基因,miR-205-5p與LINC00894具有互補結合位點,將結合位點突變,構建突變型熒光素酶報告質粒(LIN-MUT);同樣使用starbase數據庫預測miR-205-5p靶基因,ZEB1與miR-205-5p具有互補結合位點,將結合位點突變,構建突變型熒光素酶報告質粒(ZEB1-3U-MUT)。將LIN-WT或LIN-MUT分別與miR-205-5p mimic或mimic control共轉染到BGC-823細胞中;將LIN-WT或LIN-MUT分別與miR-205-5p inhibitor或inhibitor control共轉染到AGS細胞中;將ZEB1-3U-WT或ZEB1-3U-MUT分別與miR-205-5p mimic或mimic control共轉染到BGC-823細胞中;將ZEB1-3U-WT或ZEB1-3U-MUT分別與miR-205-5p inhibitor或inhibitor control共轉染到AGS細胞中。轉染48 h后,利用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1LINC00894在胃癌中高表達且與不良預后有關RT-qPCR結果顯示(圖1A)：LINC00894在胃癌組織中的表達水平較胃正常組織明顯升高(P<0.01);Kaplan-Meier生存曲線分析顯示(圖1B、C)：高表達LINC00894的胃癌患者具有更差的總生存期和無進展生存期;RT-qPCR結果顯示(圖1D)：LINC00894在胃癌細胞系中的表達水平較胃正常細胞系GES-1明顯升高,其中在BGC-823細胞中表達最高,在AGS細胞中表達最低,因此,選擇BGC-823和AGS細胞進行后續實驗。

圖1 LINC00894在胃癌中高表達且與不良預后有關

2.2LINC00894對胃癌細胞增殖的影響RT-qPCR結果顯示(圖2A)：敲低組LINC-KD1、LINC-KD2較對照組Control的LINC00894表達量下降(F=53.04,P<0.01);過表達組LINC-OE較對照(Control)組的LINC00894表達量上升(P<0.01)。

圖2 LINC00894對胃癌細胞增殖的影響

此外,對LINC00894的敲低效率和過表達效率均超過50%,表明敲減和過表達模型構建成功。CCK-8實驗結果顯示(圖2B)：與對照組比較,LINC00894敲低組(LINC-KD1、LINC-KD2)的OD值(450 nm)減小(F=26.21,P<0.01),而LINC00894過表達組(LINC-OE)(1.76 ± 0.21)的OD值(450 nm)增加,提示LINC00894基因的表達上調可提高胃癌細胞的增殖能力。克隆形成實驗結果顯示(圖2C)：LINC00894敲低組(LINC-KD1、LINC-KD2)細胞形成克隆數較對照組減少(F=135.0,P<0.01),LINC00894過表達組(LINC-OE)細胞形成克隆數較對照組增加,且差異均有統計學意義,提示LINC00894基因的高表達顯著增強胃癌細胞的克隆形成能力。

2.3LINC00894對胃癌細胞遷移、侵襲的影響Transwell遷移實驗結果顯示(圖3A)：LINC-KD1、LINC-KD2組較Control組的遷移細胞數減少(F=75.77,P<0.01),LINC-OE組較Control組的遷移細胞數增加,且差異均有統計學意義(P<0.01)。Transwell侵襲實驗結果顯示(圖3B)：LINC-KD1、LINC-KD2組較Control組的侵襲細胞數減少(F=70.46,P<0.01),LINC-OE組較Control組的侵襲細胞數增加,且差異均有統計學意義。以上結果提示LINC00894基因的高表達增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

圖3 LINC00894對胃癌細胞遷移、侵襲的影響

2.4LINC00894與miR-205-5p和ZEB1的靶向關系生物信息學分析顯示(圖4A、B)：LINC00894與miR-205-5p、miR-205-5p與ZEB1具有互補序列,因此miR-205-5p可能是LINC00894的靶基因,而ZEB1可能是miR-205-5p的靶基因。雙熒光素酶報告實驗顯示：在BGC-823細胞中,miR-205-5p mimic降低了LIN-WT組的熒光素酶活性,而LIN-MUT組的熒光素酶活性沒有變化,在AGS細胞中,miR-205-5p inhibitor增強了LIN-WT組的熒光素酶活性,而LIN-MUT組的熒光素酶活性沒有變化,以上結果提示LINC00894和miR-205-5p之間可能存在直接的相互作用(圖4C);在BGC-823,miR-205-5p mimic降低了ZEB1-3U-WT組的熒光素酶活性,而ZEB1-3U-MUT組的熒光素酶活性沒有變化,在AGS細胞中,miR-205-5p inhibitor增強了ZEB1-3U-WT組的熒光素酶活性,而ZEB1-3U-MUT組的熒光素酶活性沒有變化,以上結果提示ZEB1和miR-205-5p之間可能存在直接的相互作用(圖4D)。RT-qPCR結果顯示(圖4E)：在BGC-823細胞中,敲低組LINC-KD1、LINC-KD2較對照組Control的miR-205-5p表達量上升(F=42.17,P<0.01));在AGS細胞中,過表達組LINC-OE較對照組Control的miR-205-5p表達量下降。Western blot實驗顯示(圖4F)：在BGC-823細胞中,敲低組LINC-KD1、LINC-KD2較對照組Control的ZEB1蛋白的表達量下降;在AGS細胞中,過表達組LINC-OE較對照組Control的ZEB1蛋白的表達量上升。以上結果表明：LINC00894通過靶向miR-205-5p并下調其表達,從而促進ZEB1的表達。

圖4 LINC00894與miR-205-5p和ZEB1的靶向關系

3 討論

隨著對癌癥機制的不斷深入研究,lncRNA作為癌癥的潛在生物標志物,已逐漸成為極具吸引力的癌癥治療靶點[12-13]。課題組前期通過薈萃分析發現[14],lncRNA在胃腸道腫瘤中具有預后價值,有望成為新的腫瘤預后標志物。近些年,多篇研究報道LINC00894在癌癥中扮演著癌基因的角色,其中包括腎癌[4-6]和乳腺癌[7]。然而,有報道[8]說明LINC00894在抑制乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥的進展方面也起到關鍵作用,此外,也有報道[9]說明LINC00894在甲狀腺癌中同樣發揮抑癌作用。由此可見,LINC00894的功能因腫瘤類型而異,這可能與組織異質性或基因的多功能性有關。

本研究中,LINC00894在胃癌中表達上調,且LINC00894高表達的胃癌患者往往預后更差。此外,LINC00894低表達后,CCK-8和克隆形成實驗表明LINC00894的敲低對胃癌細胞的活力和增殖能力具有明顯抑制作用;Transwell實驗表明LINC00894的敲低對胃癌細胞的遷移和侵襲能力也具有顯著的抑制作用。相反,LINC00894基因的過表達得到相反的結果,此數據與過去的研究[7]結果一致。因此,本研究表明LINC00894對胃癌細胞的增殖、轉移具有促進作用。為了探究LINC00894調控胃癌細胞增殖、轉移的潛在機制,本研究通過starbase數據庫預測了“LINC00894/miR-205-5p/ZEB1”ceRNA調控機制,并通過雙熒光素酶報告實驗、RT-qPCR實驗和Western blot實驗檢測了LINC00894、miR-205-5p和ZEB1三者之間的調控關系。實驗結果表明,LINC00894與miR-205-5p、miR-205-5p與ZEB1存在直接結合,且LINC00894與miR-205-5p存在負調控關系,LINC00894與ZEB1存在正調控關系。過去的研究[7-8]表明,在乳腺癌中,LINC00894可通過ceRNA調控機制競爭性地結合miRNA,從而介導ZEB1的表達,此結論與上述數據一致。由此說明,在胃癌中,LINC00894可通過靶向miR-205-5p并下調其表達,從而促進ZEB1的表達。

綜上所述,LINC00894在胃癌中扮演癌基因的角色,且LINC00894可能通過調控miR-205-5p/ZEB1生物軸促進胃癌細胞的增殖和轉移,然而,具體的機制仍需進一步證實。本研究有望為胃癌的靶向治療及預后預測提供新的線索。